熒光原位雜交（Fluorescencein situ hybridization FISH）是一門分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)纪蜒，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)瓤漏。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究凿将、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析校套、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷牧抵、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域笛匙。

一侨把、實(shí)驗(yàn)方法原理：

FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則妹孙，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合秋柄，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列蠢正，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位华匾。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速机隙、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)蜘拉、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注有鹿。

雜交所用的探針大致可以分類三類：1）染色體特異重復(fù)序列探針旭旭，例如α衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針葱跋，其雜交靶位常大于1Mb持寄，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密娱俺，雜交信號(hào)強(qiáng)稍味，易于檢測(cè)；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針荠卷，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上極端不同的核苷酸片段所組成模庐，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針油宜，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成掂碱。

探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針慎冤，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)疼燥，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大蚁堤，從而可以檢測(cè)500bp的片段醉者。而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入披诗。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡單撬即，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法藤巢。

二搞莺、實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1. 探針變性

將探針在75℃恒溫水浴中溫育5 min，立即置0℃掂咒，5～10 min才沧，使雙鏈DNA探針變性迈喉。

2. 標(biāo)本變性

（1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3 h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）温圆。

（2）取出玻片標(biāo)本挨摸，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70% 甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3 min。

（3）立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%岁歉、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水得运，每次5 min，然后空氣干燥锅移。

3. 雜交

將已變性或預(yù)退火的DNA探針10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上熔掺，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片非剃，置于潮濕暗盒中37℃雜交過夜（約15～17 h）置逻。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高备绽，持續(xù)時(shí)間又長券坞，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行肺素。

4. 洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針恨锚，從而降低本底。

（1）雜交次日倍靡，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出猴伶，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次菌瘫，每次5 min蜗顽。

（3）在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5 min雨让。

（4）在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗一下忿等。

（5）取出玻片栖忠，自然干燥。

（6）取200 μL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上贸街，蓋上蓋玻片庵寞。

5. 雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）

（1）在玻片的雜交部位加150 μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋薛匪，37℃溫育20min捐川。

（2）去掉保鮮膜，再加150 μLavidin-FITC于標(biāo)本上逸尖，用保鮮膜覆蓋古沥，37℃繼續(xù)溫育40 min瘸右。

（3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次岩齿，每次5 min太颤。

（4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150 μL封閉液II，覆蓋保鮮膜盹沈，37℃溫育20 min龄章。

（5）去掉保鮮膜，加150 μLantiavidin于標(biāo)本上乞封，覆蓋新的保鮮膜做裙，37℃溫育40 min。

（6）取出標(biāo)本肃晚，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中锚贱，洗滌3次，每次5 min陷揪。

（7）重復(fù)步驟（1）惋鸥、（2）、（3）悍缠，再于2×SSC中室溫清洗一下卦绣。

（8）取出玻片，自然干燥飞蚓。

（9）取200 μLPI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上滤港，蓋上蓋玻片。

6. 封片

可采用不同類型的封片液趴拧。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用）溅漾，為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉著榴。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久添履。

7. 熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果

先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源脑又，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490 nm暮胧。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光问麸。