體液（指酶：Fingerase）
體液（如汗液和皮膚油）中含有豐富的RNase活性（此類來源的RNase也被戲稱為指酶Fingerase，即手指上的酶）惶傻。因此鞋怀，雙手不戴手套會非常容易造成RNase污染瓤檐，從而對關(guān)鍵實驗造成影響憔狞。請在實驗過程中佩戴手套冈钦，并經(jīng)常丟棄用過的手套，再換上一副新的手套界逛。
（提示：與裸露皮膚接觸過的昆稿，摸過冰箱把手纺座、門把手息拜、移液器、鋼筆/鉛筆或?qū)嶒炇译娫挼氖痔拙梢暈楸籖Nase污染）
一直穿著實驗服净响，以避免您衣物上的某些顆粒物質(zhì)掉入樣品少欺。請避免在氣流擾動的環(huán)境或可能形成微粒的表面附近（如黑板）操作RNA。
槍頭與離心管
高質(zhì)量的實驗室塑料耗材一般可視為不含RNase馋贤。不過赞别，槍頭和離心管容易成為被忽視的RNase污染源。請確保從未開包的槍頭盒中取用槍頭配乓，離心管也需來自未開包的仿滔，或經(jīng)小心操作的包裹。僅進(jìn)行高壓滅菌操作無法破壞全部RNase活性犹芹，因為這些酶類耐受性強(qiáng)每界，而且降至室溫后又會重新恢復(fù)部分活性陡蝇。請務(wù)必使用經(jīng)過無RNase檢測并具有相關(guān)認(rèn)證的槍頭和離心管。Life
Technologies提供品種、規(guī)格齊全的經(jīng)認(rèn)證過的無RNase（RNase-free）的槍頭和離心管以滿足廣泛的實驗需求纳账。在操作RNA的過程中，請使用帶RNase-free隔離層（濾芯）的加樣槍頭以避免引入RNase或RNA樣本之間的交叉污染丧叽。多種尺寸的AmbionRNase-free槍頭（包含濾芯的槍頭）能夠適配絕大多數(shù)的常規(guī)移液器骚灸。我們同時也提供常規(guī)型和無粘附性的微型離心管，可適用于任何分子生物學(xué)實驗驴一。每一批次的槍頭和離心管都經(jīng)RNase與DNase污染的嚴(yán)格檢測休雌，并通過無核酸酶（nuclease-free）的相關(guān)認(rèn)證。
需要使用玻璃器皿和金屬器皿時肝断，請使用RNaseZap試劑或濕巾進(jìn)行處理挑辆。如需使用大量器皿例朱，也可對其進(jìn)行烘烤處理。烘烤操作通常需要在450°F（232°C）下進(jìn)行2小時或更長時間（不要放入膠帶鱼蝉，會導(dǎo)致起火Ｈ鬣汀）。在烘烤之前魁亦，請確保將金屬器皿物體渔隶，以及燒杯和燒瓶的頂部用鋁箔包好，以避免在烘烤之后再度發(fā)生污染洁奈。如果兩小時的等待時間過長间唉，請使用RNaseZap試劑或濕巾作為良好的替代法進(jìn)行處理。請務(wù)必確保RNaseZap試劑不要與鉗利术、鏟或其他具有活性金屬表面的器皿（如鋁制物品）接觸超過數(shù)分鐘呈野，因為這會導(dǎo)致金屬表面的腐蝕。將烘烤好的或RNaseZap試劑處理過的物品標(biāo)上RNase-free的記號印叁，以便與未處理的物品進(jìn)行區(qū)分被冒。我們推薦將處理過的物品存放于明確標(biāo)有RNase-free的區(qū)域內(nèi)，以避免偶然性的污染事件轮蜕。
水與緩沖液
由于RNase無處不在昨悼，供水設(shè)備的來源及日常維護(hù)常導(dǎo)致分子生物學(xué)應(yīng)用中的水和緩沖液成為RNase污染的常見來源。焦碳酸二乙酯（DEPC）處理是滅活水和緩沖液中RNase最常用的方法跃洛。不過率触，包括Tris在內(nèi)的某些試劑不能使用DEPC進(jìn)行處理。我們能提供多種Ambion緩沖液和水（經(jīng)DEPC處理或未經(jīng)DEPC處理）的相關(guān)產(chǎn)品汇竭，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制以確保其中去除了RNase葱蝗。除了DEPC處理之外，我們還提供RNAsecure?细燎，可用于處理Tris這類含伯胺的溶液两曼，且無需2小時的處理時間或高壓處理。避免RNase污染的來源
DEPC處理是消除水體找颓、緩沖液及其他溶液中RNase污染最為常用的方法合愈。（注意：某些緩沖液不能使用DEPC。請參見下方的段落击狮，以及“DEPC的替代品”部分佛析。）DEPC能夠通過修飾RNase及其他蛋白中的-NH、-SH和-OH基團(tuán)來破壞酶的活性彪蓬。處理步驟通常包括將溶液與0.1%的DEPC在室溫下共同孵育數(shù)小時——通常過夜——之后對溶液進(jìn)行高壓處理以去除殘余的DEPC寸莫。部分研究人員注意到在對DEPC處理的溶液進(jìn)行高壓滅菌之后，會嗅到一種果味的芳香氣味档冬，便擔(dān)心這可能是未滅活的DEPC膘茎。其實這是由于高壓滅菌滅活DEPC過程中桃纯，產(chǎn)生了少量的乙醇。乙醇可能會與痕量的羧酸相結(jié)合披坏，生成揮發(fā)性酯類從而散發(fā)出此種特殊氣味态坦。這并不是DEPC未經(jīng)完全消除的信號，不會對后續(xù)反應(yīng)造成干擾棒拂。
含有伯胺基（如Tris）及一些含有仲胺或叔胺（如HEPES）的試劑不能使用DEPC進(jìn)行處理伞梯。胺基會與DEPC反應(yīng)并將其吸收，這樣就無法實現(xiàn)對RNase的滅活處理了（參見178號技術(shù)通告）帚屉。同時谜诫，對試劑中胺基的修飾也會影響其緩沖能力。對于只能進(jìn)行過濾除菌攻旦，而不能耐受高壓滅菌的溶液喻旷，如MOPS，也就不適合用DEPC來處理牢屋，因為高壓滅菌是滅活DEPC必不可少的步驟且预。
試劑可作為一種方便易用、無致癌性的DEPC替代品伟阔，用于處理少量珍貴試劑或Tris辣之、MOPS等無法使用DEPC進(jìn)行處理的溶液掰伸。本品以25倍儲存液的形式提供皱炉。RNAsecureTM試劑儲存液被溶液稀釋之后，將其置于60°C十分鐘狮鸭，以激活本品合搅。不同于DEPC（DEPC處理法無法消除處理后引入的RNase污染），經(jīng)RNAsecureTM試劑處理過的溶液仍可重新加熱歧蕉，以幫助消除新的RNase污染灾部。如需重懸RNA沉淀，我們也提供了1X工作濃度的RNAsecureTM重懸溶液（RNAsecure?
Resuspension Solution）惯退。
商品化和實驗室制備的酶類都可能成為RNase的潛在污染源赌髓。在Life
Technologies，我們使用RNaseAlert試劑來確定大量市售酶類中RNase污染的程度催跪。您在操作RNA的過程中必需選用RNase-free的酶類锁蠕，這點至關(guān)重要。我們針對各類RNA分析實驗提供了相應(yīng)的RNase-free酶懊蒸。
當(dāng)RNase污染導(dǎo)致實驗失敗時荣倾，確定何種溶液或儀器部件發(fā)生問題通常既困難又耗時。
緩沖體系骑丸、溶液與表面
查找和確定RNase污染源常常是一項曠日持久卻無果而終的工作舌仍。最為簡單但又最昂貴的解決方案是丟棄現(xiàn)有試劑的全部儲存液——特別當(dāng)某一試劑被懷疑為污染源時——并啟用全新批次的RNase-free試劑妒貌。另一個可選項是針對疑似污染溶液測試其中的RNase。用戶可使用RNaseAlert實驗室檢測試劑盒（RNaseAlert Lab Test Kit）進(jìn)行測試铸豁。本試劑盒為非同位素標(biāo)記產(chǎn)品灌曙，允許研究者快速鑒定污染的試劑和設(shè)備。RNaseAlert實驗室檢測試劑盒的操作流程中使用了一種經(jīng)過優(yōu)化的RNA寡聚核苷酸节芥，該物質(zhì)經(jīng)過熒光和淬滅基團(tuán)的雙重標(biāo)記平匈，進(jìn)而（在相關(guān)測試中）作為RNase污染物的靶標(biāo)。當(dāng)RNase存在時藏古，該底物即被降解增炭，釋放出的熒光素隨即發(fā)出熒光。熒光信號可通過肉眼或熒光計進(jìn)行檢測拧晕。相同技術(shù)也可方便地用于槍頭隙姿、離心管、玻璃器皿及其他任何表面上RNase污染的檢測厂捞。
RNA樣品
RNase進(jìn)入RNA樣本可在多種情況下發(fā)生输玷，如RNA分離時（少量RNase在RNA制備過程中引入），或日常取用時（會不可避免地需要重復(fù)開關(guān)樣品管并插入可能被污染的加樣槍頭）靡馁。RNase的污染通秤簦可以從樣品RNA的降解看出端倪。n
可于變性瓊脂糖凝膠中對總RNA樣本（2-5 μg）電泳分析臭墨，并使用溴化乙錠染色分析赔嚎，或通過Agilent 2100 Bioanalyzer?設(shè)備進(jìn)行分析（圖1）。完整的總RNA樣本中28S與18S核糖體RNA條帶會顯示出2：1的信號強(qiáng)度比率胧弛。核糖體比值顯著低于2:1通常意味著發(fā)生了降解尤误。
圖1a.完整RNA與降解RNA之間的對比。分別取2微克的降解總RNA及完整總RNA與Ambion的RNA Millennium Markers?一同進(jìn)行1.5%的變性瓊脂糖凝膠電泳结缚。在完整RNA樣品中可以清楚地觀察到18S和28S核糖體RNA损晤。而降解RNA則表現(xiàn)為較低分子量的彌散條帶。
圖1b.Agilent2100bioanalyzer數(shù)據(jù)红竭。該圖為高質(zhì)量的真核總RNA樣品的電泳圖尤勋。在39秒及46秒位置分別可以觀察到清晰的18S和28S峰。2100Bioanalyzer?設(shè)備的微泳道充滿了一種篩分聚合物和熒光染料茵宪。樣品可以通過其發(fā)出的熒光而被檢測到最冰，其信號可轉(zhuǎn)換為電泳峰圖或類凝膠電泳圖像（數(shù)據(jù)未顯示）。
可用GAPDH眉厨、cyclophilin锌奴、或beta-actin等看家基因的探針，通過northern分析來評估poly(A)
RNA樣品的完整性憾股。由于在變性膠中RNA樣品會依據(jù)大小得到分離鹿蜀，降解產(chǎn)物會在全長mRNA的條帶下顯現(xiàn)為彌散的條帶箕慧。降解的嚴(yán)重程度可通過低分子量彌散條帶的增加加以判斷。全長mRNA的預(yù)期位置處缺失目的條帶/彌散信號茴恰，或在凝膠底部出現(xiàn)條帶/彌散信號意味著RNA已經(jīng)發(fā)生了嚴(yán)重降解颠焦。
降解的RNA樣品不適于進(jìn)行Northern分析、RACE方案往枣，或全長cDNA文庫的構(gòu)建伐庭。不過，除非樣本發(fā)生嚴(yán)重降解分冈，反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR（RT-qPCR）的應(yīng)用中對于小擴(kuò)增子的分析一般不會受到影響圾另。帶有某種程度降解的RNA樣品仍可進(jìn)行一些其它類型的分析，如二代測序雕沉，以及核酸酶保護(hù)分析（NPAs）集乔。在某些類型的樣品（如福爾馬林固定，石蠟包埋(FFPE)樣本或儲存時間過久的樣本）中坡椒，RNA降解是不可避免的扰路。
操作RNA時一些基本的注意事項。這些常識性的預(yù)防措施會對減少RNase污染大有幫助倔叼。
在實驗過程中戴著手套可避免源自人手的RNase污染
觸摸皮膚（例如您的面部）汗唱、門把手及普通物體表面后更換手套
使用RNA操作專用的移液槍組
使用經(jīng)檢測，確保為RNase-free的槍頭和離心管
使用RNase-free的化合物與試劑
將實驗室內(nèi)一片遠(yuǎn)離/遮蔽通風(fēng)孔或開放窗口丈攒，走動較少的區(qū)域指定為RNase-free區(qū)域哩罪。
在體外轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄和翻譯等酶促反應(yīng)中對抗RNase的傳統(tǒng)方法是使用人類胎盤核糖核酸酶抑制劑（也稱為RNase抑制劑蛋白肥印，RI或hPRI）识椰。這一蛋白僅針對核酸酶當(dāng)中的RNAaseA家族具有抑制性绝葡，該家族的成員包括RNaseA深碱、B和C。該抑制的模式為非競爭性的藏畅，即該蛋白并不會破壞這些RNase敷硅，而只是與其按1:1的比例結(jié)合。因此使用該抑制劑一個潛在的問題是其自身也可能被RNase污染愉阎。長時間與存在污染的抑制劑共同孵育绞蹦，有可能會向酶促反應(yīng)系統(tǒng)中緩慢釋放核酸酶。因此榜旦，盡管這種抑制劑有助于解決多種核酸酶污染的情況幽七，它并不一定是現(xiàn)有的最佳抑制劑。
SUPERase?In?RNase抑制劑是RNase的廣譜抑制劑溅呢，能夠保護(hù)RNA免受RNaseA家族成員的降解澡屡，并且對RNaseT1與RNaseI也有抑制作用猿挚。我們推薦用戶在所有酶促反應(yīng)中使用本品，它是胎盤核酸酶抑制劑（RI或hPRI）的一個更優(yōu)的替代品驶鹉。
我們也為體外轉(zhuǎn)錄绩蜻、RT-qPCR和翻譯等反應(yīng)提供了非酶的替代品——RNAsecure?試劑。
RNase——特別是RNase
A家族的成員——是一些微小緊湊的蛋白室埋，它們含有一些半胱氨酸殘基能夠形成許多分子內(nèi)二硫鍵办绝。因此在冷卻至室溫后，在無變性劑存在的條件下姚淆，變性的RNase會重新恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)及部分功能孕蝉。因此，RNase在反復(fù)凍融腌逢，甚至高壓滅菌后仍會保留相當(dāng)?shù)幕钚晕羟＿@些酶類穩(wěn)定的天然屬性使它們對眾多的去污染方法具有抵抗性，通常需要強(qiáng)力的化學(xué)方法來消除物體表面和溶液中的RNase上忍。
RNAsecure?試劑可作為一種方便易用骤肛、無致癌性的DEPC替代品，用于處理少量珍貴試劑或Tris窍蓝、MOPS等無法使用DEPC進(jìn)行處理的溶液腋颠。本品以儲存液（25倍）的形式提供。RNAsecureTM試劑儲存液被溶液稀釋之后吓笙，將其置于60°C十分鐘淑玫，以激活本品。不同于DEPC（DEPC處理法無法消除處理后引入的RNase污染）面睛，經(jīng)RNAsecureTM試劑處理過的溶液仍可重新加熱絮蒿，以幫助消除新的（RNase）污染。如需重懸RNA沉淀叁鉴，我們也提供了1X工作濃度的RNAsecureTM重懸溶液（RNAsecure?Resuspension Solution）土涝。
實驗室表面，如實驗臺幌墓、離心機(jī)和電泳設(shè)備但壮，都應(yīng)該被認(rèn)為存在RNase污染，因為這些表面通常都暴露于環(huán)境當(dāng)中常侣。這些表面會由于實驗室環(huán)境中廣泛存在的細(xì)菌和真菌孢子而受到污染蜡饵。類似的情況還包括從人體皮膚脫落的死細(xì)胞，也會造成暴露表面的污染胳施。用戶應(yīng)該假定常規(guī)的實驗室環(huán)境均遭受了潛在的污染溯祸。可使用RNaseZap等RNase去污染溶液處理這些表面，這些試劑為三種不同成分組成焦辅，專為完全滅活RNase（及其他任何酶類）而設(shè)計鸟召，一旦接觸即發(fā)揮作用。使用時直接將本溶液噴灑在需要去污染的表面氨鹏，隨后使用去核酸酶的水進(jìn)行清洗欧募。RNaseZap濕巾，是預(yù)先浸泡了RNaseZap試劑的小紙巾仆抵，可十分方便地處理槍頭跟继、實驗臺臺面及其它表面。常規(guī)的去垢劑溶液無去污染效果镣丑，甚至?xí)斐筛蟮膯栴}舔糖，因為去垢劑可能將RNase污染擴(kuò)大到整個區(qū)域。
所有的組織樣品都含有內(nèi)源性的RNases莺匠。組織取樣后若不進(jìn)行直接處理（如RNA抽提等）金吗，常常需要用液氮迅速冷凍，這樣可使RNA的降解達(dá)到最少趣竣。不過摇庙，在液氮中冷凍組織再進(jìn)行后續(xù)操作通常并不方便，特別是對于大量需要保存的樣本而言遥缕。RNAlater溶液是用于保存和穩(wěn)定化組織的溶液卫袒，可保護(hù)組織和細(xì)胞中的RNA。使用者可在RNA分離操作之前单匣，將組織塊簡單地浸入5-10倍體積的RNAlater溶液中夕凝，經(jīng)此處理的樣本即可于4°C保存長達(dá)一個月。
與RNA分離產(chǎn)物共純化出的少量RNase可能對后續(xù)應(yīng)用造成干擾户秤。相關(guān)操作所使用的槍頭码秉、離心管及其他試劑也可能引入此類污染。RNase抑制劑在針對RNA的大多數(shù)酶學(xué)操作中作為一種常規(guī)的預(yù)防措施鸡号，以確保將污染排除在外转砖。只有SUPERase?In?RNase抑制劑能夠同時抑制RNasesA、T1和RNase1（胎盤核酸抑制劑（RI）僅能抑制RNaseA）膜蠢。
為體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄-翻譯偶聯(lián)反應(yīng)而制備的質(zhì)粒DNA有可能將RNase污染引入反應(yīng)體系堪藐。許多研究人員會使用RNase處理步驟去除質(zhì)粒制備產(chǎn)物中的RNA。如果采用了RNase處理這一操作挑围，我們則推薦對樣本進(jìn)行蛋白酶K處理+酚氯仿提純的步驟，以期在開展后續(xù)反應(yīng)之前糖荒，消除所有可能存在的RNase杉辙。如果DNA模板已經(jīng)過限制性酶切而被線性化，我們也推薦使用類似的步驟捶朵，因為限制性內(nèi)切酶中也可能存在RNase的污染蜘矢。
注:強(qiáng)烈建議使用核糖核酸酶進(jìn)行處理的步驟在專用空間內(nèi)進(jìn)行狂男，以避免RNA樣品不慎接觸到RNase
痕量的RNase即會降低RNA的完整度，即使對冰凍儲存的液相樣本也是如此品腹。短期保存時岖食，可將RNA樣本重懸于RNase-Free水（加入0.1mM EDTA）或TE緩沖液（10mM Tris，1mMEDTA）并存儲于–80°C舞吭。使用含有螯合劑的緩沖液是保存RNA的更優(yōu)選擇泡垃。針對Mg2+和Ca2+等二價陽離子的螯合作用能夠避免加熱所導(dǎo)致的鏈斷裂效應(yīng)（Mg2+存在的條件下進(jìn)行加熱可造成RNA的化學(xué)裂解）。我們?yōu)镽NA的保存提供了不含核酸酶的水以及多種Ambion緩沖液羡鸥，包括TE蔑穴，0.1mM EDTA和RNA存儲液具有低pH值的額外優(yōu)勢）。全部這些產(chǎn)品都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制步驟惧浴，均去除了核酸酶存和。
長期保存RNA的最佳方法是對預(yù)先分裝的樣本進(jìn)行鹽/酒精沉淀操作，并將此沉淀溶液保存于–20°C衷旅。低溫和酒精能夠有效抑制所有酶類的活性捐腿。比中性pH更低的酸堿度（添加醋酸鈉或醋酸銨）也有助于穩(wěn)定RNA。請注意柿顶，在進(jìn)行任意后續(xù)應(yīng)用前需先離心沉淀RNA并去除該儲存液叙量。另一個選擇是將RNA重懸于RNAsecureTM重懸溶液中，該產(chǎn)品中包含了RNase的滅活試劑九串。加入RNAsecure?溶液之后绞佩，將樣品簡單加熱至60°C，保持10分鐘猪钮，以滅活RNase品山。如果在后續(xù)操作中懷疑發(fā)生了樣品污染，用戶仍可再次加熱以滅活這些新發(fā)生的污染烤低。
當(dāng)觀察到RNA的降解情況時肘交，盡管RNase的污染是最為常見的推測，不過RNA分子在二價陽離子存在的加熱條件下其實也會發(fā)生鏈的斷裂扑馁，如在含有Mg2+或Ca2+離子的條件下涯呻，在>80°C的溫度下作用5分鐘或更長時間。因此腻要，如需加熱RNA樣本复罐，則最好在螯合劑存在的條件下進(jìn)行。RNA存儲液專為RNA的存儲用途而設(shè)計雄家。它包含1mM的檸檬酸鈉效诅，可有效螯合二價陽離子，并具有相對較低的pH值（6.4左右），能夠使RNA堿基的水解情況最小化乱投。
摘自 https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/the-basics-rnase-control.html
