本次向大家推薦一篇來自武漢協(xié)和醫(yī)院副主任醫(yī)師-彭濤在J Exp Clin Cancer Res雜志投的一篇文章红选，文章題目“Circ-MBOAT2 knockdown represses tumor progression and glutamine catabolism by miR-433-3p/GOT1 axis in pancreatic cancer”，這是剛剛在該雜志發(fā)表的恶座，影響因子：7.068分篷牌，內(nèi)容主要講的是敲低Circ-MBOAT2靶向調(diào)控miR-433-3p/GOT1軸從而抑制胰腺癌的腫瘤進展和谷氨酰胺分解代謝恶迈。

研究背景

胰腺癌是一種惡性腫瘤臣咖，在所有癌癥中的發(fā)病率排名第六跃捣。據(jù)報道，環(huán)狀RNA（circRNA）調(diào)節(jié)胰腺癌的進展夺蛇，在原來的一些基礎(chǔ)研究中疚漆，作者發(fā)現(xiàn)含有2個環(huán)膜結(jié)合的O-酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（circ-MBOAT2）在胰腺癌組織標(biāo)本和細胞樣本中高表達刁赦，但是尚不清楚circ-MBOAT2對胰腺癌過程的調(diào)節(jié)作用娶聘。在miRNA的確認中，有相關(guān)研究表明miR-433-3p能夠抑制腫瘤發(fā)生的過程甚脉，以至作者選用它作為circ-MBOAT2相互作用的研究對象丸升，通過網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-433-3p和circ-MBOAT2有相互結(jié)合的位點；在下游靶基因的選擇中牺氨，作者選擇了癌癥細胞增殖所必須的一種物質(zhì)——谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT1）狡耻，其在谷氨酸代謝中非必須氨基酸的產(chǎn)生起到至關(guān)重要的作用，也有相關(guān)研究報道谷草轉(zhuǎn)氨酶對胰腺癌的增殖有著促進的作用猴凹。根據(jù)這些基礎(chǔ)工作夷狰，作者提出了在胰腺癌腫瘤進展過程中，circ-MBOAT2通過海綿吸附作用miR-433-3p從而使GOT1表達對腫瘤細胞的增殖有著促進作用精堕。

研究結(jié)果

1孵淘、Circ-MBOAT2在胰腺癌組織和細胞中高表達

作者通過QPCR的方法檢測胰腺癌組織和細胞中幾個感興趣的circRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Circ-MBOAT2在胰腺癌組織以及細胞中高表達（如下圖A）歹篓。為了判斷所發(fā)現(xiàn)的Circ-MBOAT2為環(huán)狀結(jié)構(gòu)瘫证，將提取的RNA加入RNase R，接著檢測Circ-MBOAT2在樣本中的穩(wěn)定性庄撮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)背捌，在樣本中Circ-MBOAT2含量并沒有減少（如下圖C-D），作者接下來為了檢測Circ-MBOAT2在細胞中的定位洞斯，將樣本進行核質(zhì)分離毡庆，分別檢測Circ-MBOAT2的含量，結(jié)果表明Circ-MBOAT2主要存在于細胞質(zhì)中（如下圖E-F）

2烙如、敲低Circ-MBOAT2對胰腺癌細胞功能的影響

作者繼續(xù)探討Circ-MBOAT2是否調(diào)節(jié)胰腺癌的形成么抗，通過敲低Circ-MBOAT2（si- Circ-MBOAT2）在PANC-1 and SW1990的表達，觀察細胞增殖亚铁、侵襲蝇刀、遷移、凋亡以及谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶1（GOT1）徘溢、α-酮戊二酸吞琐、谷氨酸的mRNA表達水平捆探，這些結(jié)果表明了在細胞水平上敲低Circ-MBOAT2的表達，能夠抑制腫瘤細胞的增殖站粟、侵襲黍图、遷移以及下游通路中相關(guān)基因mRNA水平的降低，從而引起腫瘤細胞的凋亡（如下圖A-J）奴烙。

3助被、敲低Circ-MBOAT2胰腺癌細胞在動物體內(nèi)的成瘤觀察

通過成功構(gòu)建敲低Circ-MBOAT2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株（Sh- Circ-MBOAT2+SW1990），皮下接著裸鼠切诀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恰起，在相同的成瘤時間，敲低Circ-MBOAT2的細胞株成瘤能力明顯降低趾牧，運用QPCR技術(shù)檢測瘤體中Circ-MBOAT2 mRNA表達水平，結(jié)果表明敲低Circ-MBOAT2組中Circ-MBOAT2的mRNA表達顯著低于Circ-MBOAT2組（如圖A-D）肯污。

4翘单、Circ-MBOAT2海綿吸附miR-433-3p相結(jié)合

在雙熒光素梅實驗中，通過構(gòu)建包含miR-433-3p潛在結(jié)合序列的Circ-MBOAT2重組熒光宿酶報告質(zhì)粒pGL3-Circ-MBOAT2-WT及包含突變了結(jié)合序列的重組質(zhì)粒pGL3-Circ-MBOAT2-MUT蹦渣；通過瞬轉(zhuǎn)的方式把重組質(zhì)粒pGL3-Circ-MBOAT2-WT以及pGL3-Circ-MBOAT2-MUT分別跟miR-433-3p mimic共轉(zhuǎn)到兩株人胰腺癌細胞PANC-1 and SW1990中哄芜，同時也設(shè)了分別跟miR-NC共轉(zhuǎn)到細胞中；結(jié)果如圖所示柬唯，在pGL3-Circ-MBOAT2-WT+miR-433-3p mimic組中认臊，相對熒光素酶活性顯著抑制相對于pGL3-Circ-MBOAT2-MUT+miR-433-3p mimic、pGL3-Circ-MBOAT2-WT+miR-NC和pGL3-Circ-MBOAT2-MUT+miR-NC锄奢，說明了Circ-MBOAT2和miR-433-3p能夠相互結(jié)合失晴。

通過實時熒光定量PCR檢測34對胰腺癌組織和旁癌組織中miR-433-3p的表達，結(jié)果表明在胰腺癌組織中miR-433-3p顯著表達（如圖E）拘央；通過斯皮爾曼相關(guān)分析涂屁，Circ-MBOAT2和miR-433-3p呈負相關(guān)（如圖F）；在PANC-1和SW1990細胞中灰伟，Circ-MBOAT2顯著高表達拆又，而miR-433-3p顯著低表達（如圖G和H）；然而在這兩株細胞中栏账，通過si- Circ-MBOAT2敲減其在細胞中的表達檢測miR-433-3p mRNA表達水平帖族，發(fā)現(xiàn)miR-433-3p顯著上升(如圖I)。

5挡爵、Circ-MBOAT2通過miR-433-3p調(diào)節(jié)胰腺癌的發(fā)展

作者通過上面的實驗證實了Circ-MBOAT2能海綿吸附miR-433-3p相結(jié)合的作用方式竖般，進一步通過實驗設(shè)計Circ-MBOAT2是否通過miR-433-3p調(diào)節(jié)胰腺癌的發(fā)展。在PANC-1 和SW1990細胞中了讨，通過合成miR-433-3p inhibitor在細胞中敲低miR-433-3p捻激，QPCR技術(shù)檢測細胞中miR-433-3p mRNA表達水平制轰，合成的miR-433-3p inhibitor起到一個很好的敲低作用（如下圖A）；接著作者通過在兩株細胞中瞬轉(zhuǎn)si-Circ-MBOAT2-NC胞谭、si-Circ-MBOAT2垃杖、si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor以及si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor-NC四組，分別做了細胞增殖實驗丈屹、平板克隆形成實驗调俘、細胞凋亡、侵襲旺垒、遷移彩库、檢測谷氨酰胺消耗、α-酮戊二酸產(chǎn)生和谷氨酸產(chǎn)生來解釋Circ-MBOAT2通過海綿吸附miR-433-3p作用調(diào)節(jié)胰腺癌的發(fā)展以及谷氨酰胺分解代謝先蒋，在細胞凋亡實驗中骇钦，si-Circ-MBOAT2、si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p NC這兩組細胞凋亡水平無顯著變化竞漾，但是相對于si-Circ-MBOAT2-NC和si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor這兩組眯搭，凋亡水平顯著上升的趨勢（如下圖F）；剩下的實驗結(jié)果和細胞凋亡結(jié)果相反（如下圖C-E业岁、G-K）

6鳞仙、胰腺癌細胞中miR-433-3p和GOT1相互結(jié)合作用

同樣進行雙熒光素梅實驗，構(gòu)建miR-433-3p潛在結(jié)合下游靶基因GOT1 3’UTR的重組熒光素梅報告質(zhì)粒pGL3-GOT1 3’UTR-WT和突變了結(jié)合序列的重組質(zhì)粒pGL3-GOT1 3’UTR-MUT笔时。實驗結(jié)果表明miR-433-3p能和GOT1相結(jié)合棍好，在pGL3-GOT1 3’UTR-WT+miR-433-3p mimic組中熒光強度顯著降低（如下圖A-C）。

同樣取34對胰腺癌組織和旁癌組織做QPCR和WB實驗檢測GOT1表達水平允耿，結(jié)果表明在胰腺癌組織中GOT1 mRNA水平以及蛋白水平高表達借笙，說明了GOT1在對胰腺癌的研究中有著重要的作用。在細胞層面上也檢測了GOT1的表達水平右犹，相對于HPDE正常胰腺上皮細胞提澎，PANC-1和SW1990兩株胰腺癌細胞中的GOT1同樣是高表達；miR-433-3p和GOT1的表達水平呈負相關(guān)念链；接著通過在細胞中瞬轉(zhuǎn)miR-433-3p inhibitor和miR-433-3p mimic檢測GOT1蛋白表達水平盼忌，發(fā)現(xiàn)在miR-433-3p inhibitor組中，GOT1蛋白表達水平顯著上升掂墓。

7谦纱、miR-433-3p作用于下游靶基因GOT1調(diào)控胰腺癌進展和谷氨酰胺代謝

作者通過在PANC-1和SW1990細胞中分別瞬轉(zhuǎn)miR-NC、miR-433-3p mimic君编、miR-433-3p mimic +pcDNA以及miR-433-3p mimic+pcDNA- GOT1四組跨嘉，后面分別檢測細胞增殖藏斩、細胞凋亡纱兑、侵襲、遷移、檢測谷氨酰胺消耗子巾、α-酮戊二酸產(chǎn)生和谷氨酸產(chǎn)生模狭，這些結(jié)果表明了衔沼，miR-433-3p作用于下游靶基因GOT1從而抑制細胞增殖晰甚、遷移、侵襲和谷氨酰胺代謝嘱支，從而促進細胞凋亡（如下圖A-K）蚓胸。

8、Circ-MBOAT2通過miR-433-3p調(diào)控GOT1表達

作者從上面一系列的實驗證實了Circ-MBOAT2能海綿吸附作用miR-433-3p除师，而miR-433-3p能夠跟下游靶基因GOT1相互作用從而調(diào)控胰腺癌的發(fā)展沛膳，所以作者提出了circMBOAT2是否通過分泌miR-433-3p調(diào)控GOT1的表達。結(jié)果顯示汛聚，PANC-1和SW1990細胞中的circ-MBOAT2沉默顯著下調(diào)了GOT1的mRNA和蛋白質(zhì)水平锹安；但是miR-433-3p inhibitor能夠回挽這種影響（如下圖A-B）。

總結(jié)

本研究指出Circ-MBOAT2通過miR-433-3p/GOT1軸調(diào)節(jié)胰腺癌的腫瘤發(fā)展和谷氨酰胺分解代謝倚舀。這一發(fā)現(xiàn)提示circ-MBOAT2可能是胰腺癌的治療靶點八毯。