一庶溶、重組蛋白與融合蛋白

1. 重組蛋白

• 要明白什么是重組蛋白，首先要知道什么是重組DNA技術(shù)。重組DNA技術(shù)又稱為基因工程或分子克隆捌肴，是指采用人工方法將不同來源的DNA進行重組，將重組后的DNA分子引入宿主細胞中進行增殖或表達的過程藕咏。典型的DNA重組實驗通常包含：分状知、切、接孽查、轉(zhuǎn)饥悴、篩五個步驟。重組DNA分子在宿主細胞中表達出的蛋白質(zhì)即為重組蛋白盲再。

2. 融合蛋白

• 融合蛋白是指通過重組DNA技術(shù)將你要表達的目的蛋白基因同表達載體上融合蛋白基因相連西设，這樣表達出的蛋白質(zhì)就會是同時具有目的基因蛋白和融合基因蛋白兩個部分的重組蛋白。
• 融合蛋白與重組蛋白不是一個層次上對立的概念答朋，融合蛋白表達只是重組蛋白表達的一種策略贷揽，融合表達是一種方法。因為融合表達具有表達效率高梦碗、產(chǎn)物穩(wěn)定而且水溶性好禽绪、易于鑒定和純化等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛采用叉弦。融合蛋白又稱標(biāo)簽（Tag）丐一，常用的His、GST等淹冰。

二库车、 HIS標(biāo)簽

1. 定義

6xHis標(biāo)簽，也稱為多組氨酸標(biāo)簽（polyhistidine ）樱拴，His6標(biāo)簽或hexa組氨酸標(biāo)簽柠衍，這是一種在轉(zhuǎn)染的細胞中目標(biāo)蛋白的C端或N端上由至少6個組氨酸殘基鏈接上所組成的氨基酸序列洋满。

2. 特點

• His標(biāo)簽是蛋白質(zhì)重組技術(shù)中經(jīng)常用到的一種標(biāo)簽，其序列為六個組氨酸HHHHHH珍坊， 其特點是分子量小牺勾，基本不改變蛋白質(zhì)的生物結(jié)構(gòu)，不改變蛋白質(zhì)的溶解性阵漏。
• 更重要的是它使蛋白質(zhì)的純化變得極為方便驻民，根據(jù)組氨酸上的咪唑環(huán)可以與二價金屬離子結(jié)合的原理，人們可以利用金屬離子親和層析技術(shù)純化帶有His標(biāo)簽的蛋白履怯，即將含有目的蛋白的裂解液通過固定的二價金屬離子（通常是二價Ni離子）填料回还，帶有6his標(biāo)簽的蛋白質(zhì)即與填料結(jié)合，其它蛋白不與填料結(jié)合叹洲，最后再用高濃度的咪唑即可將目的蛋白洗脫下來柠硕。
• His標(biāo)簽單抗可以用來鑒定His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的表達情況（如目的蛋白的相對表達量、分子量）运提、在細胞中的定位以及其它特性蝗柔。

3. His標(biāo)簽的用途

親和純化蛋白

• 原理：

6xHis標(biāo)簽通常在重組蛋白的純化中使用，這是因為組氨酸殘基的序列可以在特定的緩沖液條件下結(jié)合到幾種類型固定的離子上（比如鎳民泵，鈷和銅）癣丧，從而達到容易檢測和純化His標(biāo)簽蛋白的目的。

IAMC一種非常有效的分離技術(shù)栈妆，它利用組氨酸能夠與金屬離子發(fā)生親和作用的原理對蛋白質(zhì)加以分離坎缭。

• 方法：

IMAC，全稱是 immobilized metal-affinity chromatography签钩，即固定金屬親和層析法掏呼。(親和是指采用抗原-抗體之間的特異性結(jié)合來分離出自己的目標(biāo)抗原或抗體）

• 金屬離子的選擇

鎳，鈷铅檩，銅是進行純化His標(biāo)簽蛋白首選的被廣泛使用的離子憎夷，由于它們在水溶液中對于組氨酸和半胱氨酸良好的親和性。

鎳-在這三個離子中昧旨，鎳是最廣泛使用的金屬離子拾给，它呈現(xiàn)出最高的親和性和選擇性對于His標(biāo)簽蛋白。然而兔沃，它也會非特異性的結(jié)合包含組氨酸群的內(nèi)源蛋白蒋得。

鈷-而鈷提供最特異性的結(jié)合和組氨酸標(biāo)簽因此當(dāng)純度是首要選擇時鈷是二價陽離子的首選。

銅-銅離子和鎳鈷離子相比和His標(biāo)簽蛋白的結(jié)合非常強勁乒疏，但是它的特異性在三種離子中是最弱的额衙。由于這個原因，當(dāng)純度不是最主要的目的時銅離子IMAC被使用。

• 細胞總蛋白裂解

在制備樣品時窍侧，通過酶解法或機械條件細胞被裂解县踢。因為多組氨酸標(biāo)簽在生理PH值和離子強度下很好的結(jié)合到IMAC樹脂上。結(jié)合在幾乎中性緩沖液的條件下完成伟件。

• 漂洗

大部分科研人員使用包含10-25mM咪唑的TBS溶液作為結(jié)合/漂洗緩沖液來防止帶有組氨酸殘基內(nèi)源蛋白的非特異性的結(jié)合.
被捕獲的組氨酸標(biāo)簽蛋白的洗脫和回復(fù)通常使用增加的咪唑濃度(至少200mM)來實現(xiàn)硼啤，低PH值或一個過量的強螯合劑比如EDTA。

鑒定目標(biāo)蛋白

• 跑蛋白膠：抗多組氨酸標(biāo)簽抗體或通過SDS-PAGE來檢測靶蛋白斧账。

• 顯色：酶聯(lián)免疫吸附測稱ELISA,采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接,然后通過酶與底物發(fā)生顏色反應(yīng)對受檢物質(zhì)進行定性或定量分析的一種檢測方法谴返。

參考

• 【求助】 重組蛋白與融合蛋白有什么區(qū)別嗎？ - 免疫學(xué)討論版 - 專業(yè)醫(yī)生社區(qū)咧织，醫(yī)學(xué)亏镰、藥學(xué)、生命科學(xué)拯爽、科研學(xué)術(shù)交流 https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/4997453
• 常見蛋白標(biāo)簽-6xHis標(biāo)簽 - 簡書 http://www.reibang.com/p/6c1201cab98b
• 常見的融合蛋白表達標(biāo)簽——總結(jié) - 簡書 http://www.reibang.com/p/0e9e7c941cf0