研究背景?

G-四鏈體（G-quadruplex, G4）是由富含鳥嘌呤（G）的DNA或RNA序列折疊形成的高級結(jié)構(gòu)[1]把敢。G-四分體（G-quartet）是四鏈體的結(jié)構(gòu)單元，由Hoogsteen氫鍵連接4個(gè)G形成環(huán)狀平面喇闸，兩層或以上的四分體通過π-π堆積形成四鏈體，并且由一價(jià)陽離子如Na+或K+離子進(jìn)一步穩(wěn)定[2]询件。由于G4具有重要的生物功能和特殊構(gòu)象燃乍，其結(jié)構(gòu)和功能的特性已成為化學(xué)、生物學(xué)和藥學(xué)的重要研究領(lǐng)域宛琅。自1962年G4首次被報(bào)道至今刻蟹，人們已經(jīng)在人類基因組和轉(zhuǎn)錄組中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了大量可以形成G4的DNA或RNA序列，并被證明可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程嘿辟，包括端粒維持舆瘪、DNA復(fù)制、染色質(zhì)重塑红伦、轉(zhuǎn)錄英古、RNA剪接和翻譯等[2]。目前昙读，利用G4穩(wěn)定配體靶向G4結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為一種有吸引力的疾病治療策略[3,4]召调，但是由于G4配體缺乏不同G4結(jié)構(gòu)間的選擇性，極大地限制了其臨床應(yīng)用。另外唠叛，G4配體已被廣泛用于研究G4的生物學(xué)功能只嚣。同樣，由于缺乏選擇性艺沼，該方法無法精確定義G4與特定生物學(xué)過程之間的關(guān)系介牙。因此，開發(fā)能夠在特定基因組位點(diǎn)選擇性操控G4折疊的技術(shù)對于G4的功能分析和以G4為靶點(diǎn)的疾病治療至關(guān)重要澳厢。

近日，中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所的曲曉剛研究員團(tuán)隊(duì)在Nature Cell Biology期刊上發(fā)表了題為Targeting specific DNA G-quadruplexes with CRISPR-guided G-quadruplex-binding proteins and ligands的研究論文囚似。該研究聯(lián)合CRISPR技術(shù)和G4結(jié)合蛋白/配體開發(fā)出了一種可以選擇性靶向特定基因組G4結(jié)構(gòu)的新策略剩拢。

圖1. 將CRISPR技術(shù)與G4結(jié)合蛋白/配體結(jié)合靶向基因組特定G4結(jié)構(gòu)

CRISPR是DNA的短回文重復(fù)序列，是大多數(shù)細(xì)菌及古細(xì)菌中一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御機(jī)制[5]饶唤。CRISPR技術(shù)可以將不同的功能蛋白或化合物與催化失活的Cas9（dCas9蛋白）相融合徐伐，從而將功能蛋白或化合物招募到特定基因組位點(diǎn)，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控募狂，基因組成像办素，染色質(zhì)修飾等[6]。曲曉剛團(tuán)隊(duì)通過將G4穩(wěn)定蛋白核仁素與dCas9蛋白融合祸穷，可以特異性地在癌基因MYC性穿、肌肉相關(guān)基因Itga7的啟動子區(qū)以及端粒區(qū)中穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu)，分別導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯雷滚、成肌細(xì)胞分化抑制和細(xì)胞衰老需曾。進(jìn)一步，曲曉剛團(tuán)隊(duì)利用生物素-親和素系統(tǒng)將G4配體與dCas9蛋白相偶聯(lián)祈远，招募G4穩(wěn)定配體PDS和PDC靶向特定基因組位點(diǎn)的G4結(jié)構(gòu)呆万。與傳統(tǒng)G4配體相比，該策略能夠更精確地研究新生G4的生物功能车份。

圖2. 以NEAT1和MALAT1 G4s作為代表研究dCas9-SunTag-mSA系統(tǒng)介導(dǎo)Bio-PDC募集到特定 G4 位點(diǎn)的全基因組脫靶效應(yīng)谋减。a. RNA-seq結(jié)果顯示，dCas9-SunTag-mSA系統(tǒng)介導(dǎo)的Bio-PDC募集到特定的G4位點(diǎn)后扫沼，有163個(gè)基上調(diào)出爹，49個(gè)基因下調(diào)；b. MA圖顯示啟動子中G4s基因表達(dá)的倍數(shù)變化缎除，在這些差異表達(dá)基因中以政，只有93個(gè)基因的啟動子具有活躍的G4基序

圖3.?為了進(jìn)一步研究這些具有活性G4 motifs的基因的差異表達(dá)是否是由于Bio-PDC的脫靶效應(yīng)所致，研究者利用ATAC-seq分析了經(jīng)500nM Bio-PDC處理的dCas9-SunTag-mSA/sgR-lncRNAs轉(zhuǎn)染細(xì)胞的染色質(zhì)可及性伴找，結(jié)果顯示并沒有明顯改變?nèi)旧|(zhì)的可及性盈蛮；

圖4. e. ATAC-seq結(jié)果顯示只有六個(gè)基因出現(xiàn)了差異表達(dá)，并觀察到其啟動子區(qū)域的 ATAC信號強(qiáng)度發(fā)生了變化技矮；f. 其中4個(gè)基因的啟動子區(qū)域存在活性G4基序抖誉，包括NEAT1 和MALAT1殊轴；g.? NEAT1和MALAT的G4基序處ATAC-seq信號增強(qiáng)，但已知的G4驅(qū)動的致癌基因信號并沒有增加

綜上所述袒炉，該研究提出了一種可以特異性靶向基因組G4結(jié)構(gòu)的新技術(shù)旁理，利用該技術(shù)可以更準(zhǔn)確地研究G4結(jié)構(gòu)與其鄰近基因和各種生物學(xué)過程的關(guān)系。同時(shí)我磁，該技術(shù)解決了傳統(tǒng)G4配體缺乏選擇性的問題孽文，從而在不影響其他細(xì)胞內(nèi)G4的情況下選擇性地促進(jìn)單個(gè)或多個(gè)目標(biāo)G4的折疊。此外夺艰，該技術(shù)未來的研究將進(jìn)一步揭示G4與其鄰近基因及各種生物過程的關(guān)聯(lián)芋哭，并為活細(xì)胞篩選G4探針或以G4為靶點(diǎn)的候選藥物的開發(fā)開辟了一條新途徑。

圖5. 結(jié)合CRISPR和G4穩(wěn)定分子的G4調(diào)控轉(zhuǎn)錄組工程郁副。通過將每種dCas9-SunTag-mSA 與不同設(shè)計(jì)的sgRNA配對减牺，研究者可以通過Bio-PDC低濃度給藥來獨(dú)立控制單個(gè)或多個(gè)感興趣的G4，而不會對其他細(xì)胞G4產(chǎn)生全局影響存谎。

參考文獻(xiàn)

[1]?Collie?GW, Parkinson GN. The application of DNA and RNA G-quadruplexes to therapeutic medicines. Chemical Society reviews. 2011;40:5867-92.

[2] Varshney D, Spiegel J, Zyner K, Tannahill D, Balasubramanian S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature reviews Molecular cell biology. 2020;21:459-74.

[3] Balasubramanian S, Hurley LH, Neidle S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nature reviews Drug discovery. 2011;10:261-75.

[4] Kosiol N, Juranek S, Brossart P, Heine A, Paeschke K. G-quadruplexes: a promising target for cancer therapy. Molecular cancer. 2021;20:40.

[5] Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007;315:1709-12.

[6] Pacesa M, Pelea O, Jinek M. Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies. Cell. 2024;187:1076-100.

[7]?Qin G, Liu Z, Yang J, et al. Targeting specific DNA G-quadruplexes with CRISPR-guided G-quadruplex-binding proteins and ligands. Nat Cell Biol. 2024 Jul 3.?