title：The Mammalian Spermatogenesis Single-Cell Transcriptome, from Spermatogonial Stem Cells to Spermatids
journal：cell report
IF:7.8
摘要：精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜和高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞分化過(guò)程痕貌，對(duì)雄性生殖至關(guān)重要风罩，其過(guò)程由精原干細(xì)胞維持。盡管一些確定的精細(xì)胞類型的基因表達(dá)模式已經(jīng)描述舵稠，但是精子發(fā)生過(guò)程中的完整連續(xù)的基因模式尚未有人探究超升。我們使用了62000個(gè)來(lái)自未成熟和成熟期的小鼠及人類的精子細(xì)胞做了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，這使我們可以探究ssc和精原細(xì)胞前體的發(fā)育過(guò)程哺徊，闡明雄性減數(shù)分裂和精子形成過(guò)程中的基因表達(dá)模式的整體改變室琢，同時(shí)我們還可以獲得人和鼠的精子細(xì)胞類型或者亞型之間不同的分子標(biāo)記。這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集給我們提供了豐富的資源來(lái)研究SSC落追。雄性減數(shù)分裂盈滴，睪丸癌癥，雄性不育或者可以幫助我們建立體外的精子發(fā)生過(guò)程
介紹：
雄性生殖能力依賴于睪丸曲細(xì)精管中正常的生殖細(xì)胞的擴(kuò)增和分化過(guò)程轿钠。穩(wěn)定狀態(tài)的精子發(fā)生過(guò)程是由生殖細(xì)胞和其支持的體細(xì)胞共同協(xié)調(diào)驅(qū)動(dòng)的巢钓，這個(gè)過(guò)程起始于SSC的自我更新和分化的平和宽菜，這保證了精原干細(xì)胞池的穩(wěn)態(tài)。以前的研究以bulkseq為主竿报，這中間忽略了發(fā)育過(guò)程細(xì)胞的異質(zhì)性，
本文使用了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)（10X平臺(tái)和Fluidigm C1平臺(tái)）继谚，獲得了來(lái)自于1烈菌、未成熟小鼠睪丸 2、成熟小鼠睪丸 3花履、成年人睪丸 總共62000個(gè)細(xì)胞芽世，可以檢測(cè)到發(fā)育過(guò)程中稀有亞群的存在，同時(shí)也可以兼顧細(xì)胞的異質(zhì)性
結(jié)果：
我們使用了10X的方法诡壁，同時(shí)使用了Fluidigm C1的方法（有更深度的測(cè)序）來(lái)證明我們的結(jié)果济瓢，這些研究揭示了62141個(gè)小鼠和人完整的生精過(guò)程中的基因表達(dá)的異質(zhì)性。我們首先在未篩選的條件下從曲細(xì)精管的細(xì)胞懸液中獲得生精細(xì)胞妹卿，然后再?gòu)闹蝎@得精原細(xì)胞精母細(xì)胞和精子細(xì)胞旺矾，非監(jiān)督的聚類和擬時(shí)序分析可以看到在精子發(fā)生過(guò)程中的基因表達(dá)的發(fā)育動(dòng)力學(xué)。細(xì)胞亞型的鑒定是通過(guò)細(xì)胞特異性的marker夺克、或者通過(guò)和一些平行的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果作比較得來(lái)的箕宙，后者使用的方法往往是通過(guò)FACS或者StaPut 的方法預(yù)先篩選得到相應(yīng)發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞。（重點(diǎn)Ｆ膛Α＜砼痢）
1、穩(wěn)定狀態(tài)的精細(xì)胞的完整的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組
小鼠細(xì)胞：4651 人：7134
小鼠基因9400/28625? 人：7031/20939
小鼠cluster：14? 人：14
2狡门、小鼠和人成年精原細(xì)胞的異質(zhì)性
從人和小鼠的生精細(xì)胞中可以獲得精原細(xì)胞（表達(dá)GFRA1 KIT NANOS3 PHOX13 SALL4 ZBTB16等）陷寝，將這些細(xì)胞單獨(dú)取出來(lái)分析，可以得到5個(gè)人類精原細(xì)胞和10個(gè)小鼠細(xì)胞的簇其馏，以及獲得簇之間的差異基因凤跑。
同時(shí)使用ID4-eGfp轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)獲得純凈的精原細(xì)胞，在未成熟的小鼠中叛复，具有分化能力的ssc幾乎都來(lái)自于ID4-EGFP陽(yáng)性的細(xì)胞饶火，因此這個(gè)具有這個(gè)marker的轉(zhuǎn)基因鼠結(jié)合FACS可以獲得較高純度的精原細(xì)胞。而人精原細(xì)胞的獲得是利用了以前報(bào)的marker來(lái)進(jìn)行的致扯。通過(guò)此步篩選得到了6945個(gè)小鼠細(xì)胞和11104個(gè)人類細(xì)胞肤寝，同時(shí)使用了10X的方法及非監(jiān)督的聚類最終得到14個(gè)鼠的簇和10個(gè)人的簇，同時(shí)平行的Fludigm C1單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了10X的方法抖僵。（重要＠鹂础！）
3耍群、精原細(xì)胞的發(fā)育順序
擬時(shí)間分析的結(jié)果通過(guò)已知的marker的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證义桂，比如精原細(xì)胞中都表達(dá)的DDX4找筝，在未分化的精原細(xì)胞中表達(dá)的GFRA1 ID4 NANOS2等以及在分化中的精原細(xì)胞中表達(dá)的DMRT1 KIT NANOS3 STRA8等。有趣的是盡管stra8在未分化精原細(xì)胞向分化中的精原細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中有重要作用慷吊，但其在二者的細(xì)胞中卻很難被檢測(cè)到袖裕。
在擬時(shí)序分析、marker基因表達(dá)等方面的驗(yàn)證下溉瓶，小鼠的精原細(xì)胞的發(fā)育軌跡圖譜是可信的蚣常。有趣的是唬渗，在人和小鼠精原細(xì)胞被檢測(cè)到的公有的14688個(gè)同源基因中辆影，只有286個(gè)基因存在顯著性差異昭卓，而這些基因中在人體內(nèi)高表達(dá)的主要的功能是參與mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、存活和降解触创，而在鼠中則是氧化磷酸化和蛋白酶體功能等生物學(xué)過(guò)程坎藐。
4、干細(xì)胞和分化中的精原細(xì)胞的命運(yùn)的信號(hào)和代謝驅(qū)動(dòng)（精原細(xì)胞）
我們發(fā)現(xiàn)一些典型的SSC的marker（GFRA1 ID4 ETV5 NANOS2 PAX7 TSPAN8 RHOX10 ZBTB16等）都在擬時(shí)間分析得到的3cluster中哼绑，同時(shí)還有一些新的marker基因如DUSP6 EPHA2 PTPN13 PVR等岩馍，其中這些基因會(huì)參與代謝的調(diào)控和細(xì)胞的增殖行為，如DUSP6是調(diào)控MAP激酶活性的磷酸酶等抖韩，基于這些發(fā)現(xiàn)我們認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)控對(duì)SSC的功能的是非常重要的兼雄。
（其他基因簇也做了類似的解釋，不贅述）
5帽蝶、減數(shù)分裂過(guò)程是受代謝和信號(hào)的動(dòng)態(tài)調(diào)控的（精母細(xì)胞）
小鼠和人的生精細(xì)胞總集中把表達(dá)精母細(xì)胞marker基因（DMC1 HORMAD1 MYBL1 SPO11）的細(xì)胞挑出來(lái)重新聚類赦肋。最終得到9個(gè)cluster，人和小鼠的精母細(xì)胞在共表達(dá)的15684個(gè)同源基因中只有404個(gè)基因存在物種間的顯著性差異励稳。
作者重點(diǎn)關(guān)注了一些重要的生物學(xué)過(guò)程中的基因佃乘，如MSCI 同源染色體聯(lián)會(huì) 減數(shù)分裂重組等過(guò)程
對(duì)于每個(gè)過(guò)程的解釋都是基于擬時(shí)間分析過(guò)程得到的基因簇通過(guò)GO分析得到相關(guān)的詞條解釋的，這里不贅述
6驹尼、單倍體轉(zhuǎn)錄組促進(jìn)精子形成（精細(xì)胞）
在精子形成過(guò)程中趣避，持續(xù)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)只在原型精子中發(fā)生，因?yàn)殡S后的基因組濃縮會(huì)終止轉(zhuǎn)錄新翎，作者按照之前的套路程帕，把表達(dá)精子細(xì)胞marker的細(xì)胞單獨(dú)挑出來(lái)做了重聚類，以及分別做了擬時(shí)間分析獲得了一些特定時(shí)間表達(dá)的基因簇地啰。
同時(shí)也是與之前一樣愁拭。將未篩選的細(xì)胞與通過(guò)staput篩選過(guò)的細(xì)胞數(shù)據(jù)混合分析。作者發(fā)現(xiàn)了一些減數(shù)分裂的基因在最早期圓形精子中表達(dá)亏吝，說(shuō)明這些細(xì)胞正在經(jīng)歷減數(shù)分裂的完成及精子形成的開始岭埠，并且重新激活了X連鎖的一些基因（SSXB1 SSXB2 HSFY2等），隨后一些與精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因也被激活（CA2 car2等），以及一些特殊的蛋白如魚精蛋白等也被激活（PRM1/2）惜论。在人和小鼠中许赃，參與離子通道 第二信使酶 精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)的酶的基因均發(fā)現(xiàn)在精子形成的中期顯著上調(diào)
其他分析套路如上文所述，不再贅述
7馆类、未成熟的小鼠睪丸中精原細(xì)胞的基因表達(dá)模式與成年期的基因表達(dá)模式不同
一般認(rèn)為第一波精子發(fā)生過(guò)程與成年后精子發(fā)生過(guò)程是不同的混聊，因此我們就通過(guò)比較P6階段的小鼠和成年小鼠生殖細(xì)胞來(lái)尋找其中的差異，同樣的乾巧，在P6鼠中使用未篩選和篩選的方式各得到3466和9628個(gè)細(xì)胞句喜，并通過(guò)Fluidign C1測(cè)序結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)
與前面分析套路相同，先使用擬時(shí)間分析找到SSC的marker卧抗，然后在該簇中找到特征i性表達(dá)的基因做注釋，解釋生物學(xué)過(guò)程
8鳖粟、qRTPCR分析驗(yàn)證單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果并提供了細(xì)胞特異性的分子特征
略
兩個(gè)概念
first wave spermatogenesis：是指未成熟雄性個(gè)體中第一次進(jìn)行精子發(fā)生的過(guò)程社裆，這個(gè)過(guò)程是在沒(méi)有形成穩(wěn)定的精子發(fā)生生境的條件下完成的，其過(guò)程沒(méi)有SSC階段向图，是由prospermatogonia直接產(chǎn)生spermatogonia之后進(jìn)行發(fā)育泳秀，這個(gè)過(guò)程一般認(rèn)為是為了保證雄性個(gè)體盡快擁有生殖能力。
steady-state spermatogenesis：是指在成熟個(gè)體通過(guò)發(fā)育在體內(nèi)建立了完整的精子發(fā)生生境榄攀，可以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞與生殖細(xì)胞的相互調(diào)控的過(guò)程嗜傅，同時(shí)該過(guò)程還存在prospermaotogonia發(fā)育成SSC，之后存在SSC自我更新和分化spermatogonia穩(wěn)態(tài)平衡檩赢。這個(gè)過(guò)程的建立保證了雄性精子過(guò)程可以高度有序地貫穿整個(gè)雄性個(gè)體的生命周期吕嘀。
工具參數(shù)：
10x數(shù)據(jù)和FPKM的smart-seq數(shù)據(jù)均直接導(dǎo)入seurat2.3.0
篩選標(biāo)準(zhǔn)：200genes/cell? ?3cell/gene
lognormal/scaledata? ? ?秩和檢驗(yàn)，logFC>0.25
