Science | 人工設(shè)計蛋白質(zhì)納米馬達

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?2022-05-06 07:03

收錄于合集#前沿生物大數(shù)據(jù)分析

撰文：huacishu

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1勃救、作者通過從頭設(shè)計提供了一個自下而上的平臺來探索納米機器功能的基本原理和機制校套，同時補充了對自然進化產(chǎn)生的復(fù)雜分子機器的長期研究庇配；

2、這些方法可以使一系列用于醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)或工業(yè)生物過程的納米設(shè)備工程化。

美國華盛頓大學(xué)D. Baker教授課題組在國際知名期刊Science在線發(fā)表題為“Computational design of mechanically coupled axle-rotor protein assemblies”的論文。天然分子機器包含蛋白質(zhì)組分嗤军，這些蛋白質(zhì)組分彼此相對運動。設(shè)計具有內(nèi)部自由度的納米蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是計算蛋白質(zhì)設(shè)計的一個突出挑戰(zhàn)晃危。作者發(fā)現(xiàn)軸轉(zhuǎn)子系統(tǒng)在體外和體內(nèi)按照設(shè)計進行組裝叙赚。使用冷凍電鏡，作者發(fā)現(xiàn)這些系統(tǒng)填充了構(gòu)象可變的相對方向僚饭，反映了耦合組件的對稱性和計算設(shè)計的界面能量景觀纠俭。這些具有內(nèi)部自由度的機械系統(tǒng)是設(shè)計基因可編碼納米機器的一個步驟。

從一個機器設(shè)計藍圖開始浪慌，該藍圖由兩個耦合的結(jié)構(gòu)組件組成冤荆，類似于軸和轉(zhuǎn)子（圖1A），其中权纤，與天然蛋白質(zhì)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)類似钓简，能量景觀的特征由相互作用組件的對稱性、形狀互補性和跨界面的特定相互作用決定汹想。首先試圖設(shè)計環(huán)狀蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或轉(zhuǎn)子外邓，其內(nèi)徑大小范圍能夠容納軸狀結(jié)合成分（圖1B）。在第一種方法中古掏，從a-螺旋串聯(lián)重復(fù)蛋白開始损话，重新設(shè)計它們以形成C1單鏈結(jié)構(gòu)或?qū)ΨQ的C3或C4同源寡聚體。在第二種方法中槽唾，從螺旋重復(fù)蛋白（DHR）和螺旋束異二聚體開始丧枪，使用基于結(jié)構(gòu)導(dǎo)向剛性螺旋融合的分層設(shè)計程序構(gòu)建C3和C5循環(huán)對稱轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)。為了便于后續(xù)的顯微鏡表征和模塊化庞萍，在轉(zhuǎn)子外側(cè)融合了另一組DHR拧烦，產(chǎn)生了臂狀延伸（圖1 A和B）。合成編碼這些轉(zhuǎn)子設(shè)計（12xC3s钝计、12xC4s恋博、2xC5s）的基因，并在大腸桿菌中表達蛋白質(zhì)私恬。對于C3_R1轉(zhuǎn)子债沮，SAXS數(shù)據(jù)分析與計算模型一致（圖1B）。同樣拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的另一種設(shè)計（C3_R2）也得到了類似的結(jié)果本鸣。對于C4設(shè)計C4_1疫衩，獲得了與設(shè)計模型密切一致的冷凍電鏡密度圖（圖1B）。使用負(fù)應(yīng)變電鏡對內(nèi)徑較大永高、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同（C3_R3和C5_2）的C3和C5轉(zhuǎn)子進行了表征隧土，得到了與設(shè)計模型一致的低分辨率3D重建（圖1B）提针。

接下來命爬，試圖設(shè)計高深寬比蛋白質(zhì)組件曹傀，使用三種不同的設(shè)計方法，將設(shè)計的轉(zhuǎn)子蛋白質(zhì)穿入其中饲宛。在第一種方法中皆愉，以參數(shù)化方式生成單螺旋主干，并在D2艇抠、D3或D4二面體對稱性中使用埋入氫鍵網(wǎng)絡(luò)和疏水接觸優(yōu)化序列幕庐，以產(chǎn)生具有二面體組裝所需的高度特異性的自組裝同源低聚物界面（圖2A）。為了增加總質(zhì)量并使后續(xù)電鏡分析的形狀多樣化家淤，將這些桿狀結(jié)構(gòu)的末端剛性融合到匹配對稱性的環(huán)狀同源低聚物上以構(gòu)建啞鈴狀結(jié)構(gòu)异剥。在第二種方法中，通過使用片段取樣構(gòu)建的剛性螺旋組裝成二面體結(jié)構(gòu)（圖2B）絮重。在第三種方法中冤寿，由螺旋發(fā)夾式拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)組成的參數(shù)化生成的同源三聚體骨架被循環(huán)排列和拉長，以生成延伸的C3同源低聚物（圖2C）青伤。獲得了編碼三種方法（12xC3s督怜、12xC5s、12xC8s狠角、6xD2s号杠、12xD3s、6xD4s丰歌、6xD5s和12xD8s）產(chǎn)生的軸設(shè)計的合成基因姨蟋，并在大腸桿菌中表達了蛋白質(zhì)。設(shè)計的蛋白質(zhì)表達良好立帖，可溶芬探，易于通過Ni-NTA親和層析純化，并在SEC上進一步純化厘惦。第一偷仿、第二和第三種方法的成功率分別為37.5%（6/16）、43%（14/32）和33%（4/12）宵蕉，這是通過SEC的估計分子量（MW）與設(shè)計模型的MW之間的匹配來評估的（圖2D）酝静。

為了防止由于弱軸-轉(zhuǎn)子相互作用而在低濃度下發(fā)生潛在拆卸作用，作者試圖通過在轉(zhuǎn)子-亞單位界面上安裝二硫鍵羡玛，將轉(zhuǎn)子固定在軸周圍别智。為了逐步控制體外組裝過程，在轉(zhuǎn)子亞單位之間的不對稱界面引入了埋藏的組氨酸介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)稼稿，以實現(xiàn)pH控制的轉(zhuǎn)子組裝薄榛。為了測試這種方法讳窟，選擇了上述三種機器部件——D3軸、C3轉(zhuǎn)子和C5轉(zhuǎn)子敞恋，并構(gòu)建了具有D3-C3和D3-C5對稱性的軸轉(zhuǎn)子組件（分別設(shè)計為D3-C5和D3-C3）（圖3A）丽啡。為了將軸和轉(zhuǎn)子連接在一起，對旋轉(zhuǎn)和平移自由度進行了計算采樣硬猫，并設(shè)計了互補的靜電相互作用表面补箍，不包括軸上的正電荷殘基（賴氨酸和精氨酸）和轉(zhuǎn)子上的負(fù)電荷殘基（天冬氨酸和谷氨酸）。根據(jù)設(shè)計啸蜜，D3-C3可以沿主對稱軸旋轉(zhuǎn)和平移坑雅，而D3-C5轉(zhuǎn)子具有沿x、y和z的旋轉(zhuǎn)和平移組件（圖3衬横、A和B）裹粤。獲得編碼單軸和雙轉(zhuǎn)子設(shè)計的合成基因，并在大腸桿菌中分別表達蛋白質(zhì)蜂林，并通過Ni-NTA親和層析和SEC純化遥诉。在對設(shè)計的D3軸和C3轉(zhuǎn)子進行化學(xué)計量混合后，電鏡分析顯示了組裝和分離的軸和轉(zhuǎn)子分子的集合悉尾。在降低pH值并減少二硫化物后突那，這些顆粒呈現(xiàn)為開放的、線性的构眯、難以區(qū)分的顆粒的混合物愕难。在氧化條件下恢復(fù)pH值后，電鏡顯示顆粒完全組裝惫霸。干涉測量分析表明猫缭，轉(zhuǎn)子和軸快速關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)率約為103?M?1·s?1和微摩爾范圍內(nèi)的離解常數(shù)（Kd）壹店。D3-C5旋轉(zhuǎn)組件也獲得了類似的結(jié)果猜丹，在這兩種情況下，SEC和SAXS剖面與設(shè)計模型一致硅卢。

其次射窒，試驗了更直接的空間耦合，以限制構(gòu)象變化将塑，主要是轉(zhuǎn)子繞軸旋轉(zhuǎn)脉顿。使用形狀互補的軸和轉(zhuǎn)子組件，利用緊密排列的界面和氫鍵網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的特異性的能力点寥，使限制翻譯的空間結(jié)合起來艾疟。使用這種方法設(shè)計了七個軸轉(zhuǎn)子組件：三個帶有C3對稱軸和C1轉(zhuǎn)子，四個更大的設(shè)計帶有C3軸和帶有DHR臂延長件的轉(zhuǎn)子（圖4A）。根據(jù)接口指標(biāo)和設(shè)計規(guī)范蔽莱，每個接口設(shè)計軌跡產(chǎn)生不同的周期性能量景觀弟疆，并形成具有整體齒輪拓?fù)涞男螤罨パa軸轉(zhuǎn)子接口。通過雙順時針表達轉(zhuǎn)子和軸對盗冷，并依靠轉(zhuǎn)子組件上的單個His標(biāo)簽進行Ni-NTA凈化怠苔，對C3-C1設(shè)計進行了裝配試驗篩選。12個設(shè)計中有6個是可溶性表達和共純化的正塌，這表明這兩個組分組裝在細(xì)胞中嘀略，選擇了3個設(shè)計進行進一步表征恤溶。SEC曲線與天然質(zhì)譜相結(jié)合表明乓诽，低聚物狀態(tài)與設(shè)計的組裝一致，SAXS數(shù)據(jù)也與設(shè)計模型一致咒程。通過軸和轉(zhuǎn)子的化學(xué)計量混合鸠天，對C3-C3設(shè)計（C3-C3_1至C3-C3_4）進行體外組裝篩選，然后進行SEC和SAXS分析帐姻，這與預(yù)期低聚物狀態(tài)的組裝一致稠集。干涉測量顯示，設(shè)計的C3軸和C3轉(zhuǎn)子快速組裝饥瓷，關(guān)聯(lián)率約為103m?1·s?1和微摩爾范圍內(nèi)的Kd剥纷。通過增加軸和轉(zhuǎn)子之間接口的表面積來設(shè)計進一步約束的軸-轉(zhuǎn)子組件，以實現(xiàn)更廣泛的能源景觀圖呢铆。作者設(shè)計了一個對稱組件晦鞋，包括一個D8軸，圍繞該軸組裝兩個C4轉(zhuǎn)子（D8-C4）棺克，包括一個C5軸和C3轉(zhuǎn)子（C5-C3_1和C5-C3_2）悠垛，以及一個對應(yīng)于D8-C4（C8-C4）的C8-C4組件（圖4A）。D8-C4組件具有一個軸娜谊，用于兩個轉(zhuǎn)子确买，測試多個耦合旋轉(zhuǎn)自由度在多部件系統(tǒng)中的結(jié)合，還提供了一種通過實驗結(jié)構(gòu)表征監(jiān)測轉(zhuǎn)子相對位置的簡單方法纱皆。C4轉(zhuǎn)子具有內(nèi)部C24對稱性湾趾，因此對稱性與D8和C8軸匹配。相比之下派草，C5-C3排列打破了對稱性搀缠，由此產(chǎn)生的能量景觀具有15個能量極小值，周期性反映了組成C5和C3的對稱性澳眷。通過Ni-NTA純化分離軸和轉(zhuǎn)子胡嘿，并進行化學(xué)計量混合，篩選12個D8-C4钳踊、12個C5-C3和6個C8-C4設(shè)計衷敌，以進行體外組裝勿侯。選擇了其中四種設(shè)計進行進一步的實驗研究，并獲得了指示軸轉(zhuǎn)子復(fù)合體組裝的SEC數(shù)據(jù)缴罗，而C5-C3設(shè)計的SAXS分析表明軸轉(zhuǎn)子復(fù)合體組裝助琐。

對每種設(shè)計方法和對稱性類別的一種結(jié)構(gòu)進行了冷凍電鏡檢查，并將這些數(shù)據(jù)與基于設(shè)計模型的能量景觀計算相關(guān)聯(lián)（圖3和圖4）面氓。將軸轉(zhuǎn)子組件上的電子密度數(shù)據(jù)與隔離轉(zhuǎn)子和軸上的數(shù)據(jù)進行比較兵钮，表明它們的剛性方向有相當(dāng)大的變化。對于第一種方法生產(chǎn)的D3-C3和D3-C5組件舌界，獲得的2D類平均值與從設(shè)計模型和3D重建計算出的投影圖非常相似掘譬，與總體設(shè)計模型拓?fù)浜驮O(shè)計的異源低聚物狀態(tài)非常一致（圖3 C和D）。對于這兩種設(shè)計呻拌，D3軸清晰可見葱轩，獲得了與設(shè)計模型幾乎相同的高分辨率軸結(jié)構(gòu)。D3-C3軸轉(zhuǎn)子組件的C1藐握、C3和D3的三維重建在7.8 -分辨率下顯示出與軸中間的轉(zhuǎn)子相對應(yīng)的可見密度靴拱，C3轉(zhuǎn)子臂明顯可見（圖3C）。D3-C5設(shè)計的3D重建也顯示了轉(zhuǎn)子的清晰密度猾普，但其分辨率無法進一步提高袜炕，因為相對于軸的二級結(jié)構(gòu)布局似乎是可變的（圖3D）。對冷凍電鏡?3D重建的檢查還表明初家，轉(zhuǎn)子臂沿著旋轉(zhuǎn)軸填充了多個位置（圖3 C和D）偎窘。通過旋轉(zhuǎn)和平移轉(zhuǎn)子相對于軸產(chǎn)生的能量圖表明，大范圍的方向在能量上是可接近的（圖3B）笤成，轉(zhuǎn)子軸剛性方向在分子動力學(xué)（MD）模擬中波動评架，與D3-C3組件相比，D3-C5組件顯示出更大的位移（圖3B）炕泳。沿設(shè)計自由度的構(gòu)象可變性的建模對于生成與實驗2D類平均值非常相似的計算投影是必要的（圖3纵诞、C和D）。綜上所述培遵，cryo EM數(shù)據(jù)浙芙、Rosetta模型和分子動力學(xué)模擬與軸和轉(zhuǎn)子組件的約束機械耦合設(shè)計目標(biāo)一致。在第二種方法生成的組件中籽腕，C3-C3組件的電鏡分析得出了軸和轉(zhuǎn)子清晰可見的2D級平均值（圖4A）嗡呼。軸的擴散密度和轉(zhuǎn)子的良好分辨率密度之間的對比可能反映了構(gòu)象的變化（圖4 C和D）谤狡。軸轉(zhuǎn)子組件主要可以對旋轉(zhuǎn)自由度而非平移自由度進行采樣（圖4B）间涵，旋轉(zhuǎn)平均增加了設(shè)計模型的預(yù)測與實驗數(shù)據(jù)（圖4 C和D）之間的相似性。綜上所述雷则，數(shù)據(jù)與旋轉(zhuǎn)自由度沿線的可變性一致，符合設(shè)計的能量景觀万伤，該景觀在60°旋轉(zhuǎn)距離處有三個能量最小值（圖4B）窒悔。與該景觀中的深度極小值一致，獲得了~5.9-?分辨率的電鏡圖敌买，該圖接近設(shè)計模型（圖4简珠、C和D）。使用cryoSPARC進行的3D可變性分析計算表明虹钮，轉(zhuǎn)子臂要么對齊聋庵，要么偏移，這兩種狀態(tài)幾乎是等概率的芙粱，如乙烷的重疊和交錯排列（圖4 D和E）祭玉。綜上所述，這些結(jié)果表明宅倒，側(cè)鏈相互作用和深度能量極小的顯式設(shè)計降低了純靜電相互作用觀察到的構(gòu)象狀態(tài)的簡并度攘宙，并支持能量景觀和觀察到的構(gòu)象可變性之間的對應(yīng)關(guān)系屯耸。

軸轉(zhuǎn)子組件的概念驗證表明拐迁，現(xiàn)在可以系統(tǒng)地設(shè)計具有內(nèi)部機械約束的蛋白質(zhì)納米結(jié)構(gòu)。這一進展的關(guān)鍵是能夠計算設(shè)計具有復(fù)雜互補形狀疗绣、對稱性和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組分线召。對這些形狀互補的同源寡聚體成分組裝成具有內(nèi)部自由度的高階異質(zhì)寡聚體結(jié)構(gòu)的研究，為復(fù)雜蛋白質(zhì)納米機器的設(shè)計提供了見解多矮。首先缓淹，組件之間接口的計算造型可用于促進具有選定內(nèi)部自由度的約束系統(tǒng)的自組裝。其次塔逃，由此產(chǎn)生的能量景觀的形狀和周期性由成分的對稱性讯壶、界面的形狀互補性以及疏水堆積和構(gòu)象混雜的靜電相互作用之間的平衡決定。一般來說湾盗，軸和轉(zhuǎn)子之間的界面表面積與對稱的子單元數(shù)量成比例伏蚊，較大的表面積提供了可用于設(shè)計的較大能量動態(tài)范圍。D3-C3格粪、D3-C5和C3-C3設(shè)計的電鏡數(shù)據(jù)中明顯的構(gòu)象變異性和MD模擬的組合躏吊，D8-C4設(shè)計觀察到的離散狀態(tài)表明，這些組件填充了多種旋轉(zhuǎn)狀態(tài)帐萎。cryo-EM分析無法區(qū)分構(gòu)象變化是否反映了旋轉(zhuǎn)運動或軸轉(zhuǎn)子組裝期間捕獲的狀態(tài)比伏，并且沒有報告能量屏障高度；需要在單分子水平上的時間分辨顯微鏡來揭示不同狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換動力學(xué)疆导，并將旋轉(zhuǎn)能景觀的計算造型與布朗動力學(xué)聯(lián)系起來赁项。作者的機械耦合軸轉(zhuǎn)子系統(tǒng)的內(nèi)部周期性但不對稱的旋轉(zhuǎn)能量景觀提供了兩個必需的元素之一。蛋白質(zhì)系統(tǒng)可以通過基因編碼在細(xì)胞內(nèi)或體外進行多組分自組裝。綜上所述悠菜，這些方法可以使一系列用于醫(yī)學(xué)紫新、材料科學(xué)或工業(yè)生物過程的納米設(shè)備工程化。更重要的是李剖，從頭設(shè)計提供了一個自下而上的平臺芒率，探索納米機器功能的基本原理和機制，補充了對自然進化產(chǎn)生的復(fù)雜分子機器的長期研究篙顺。

教授介紹

D. Baker教授的研究集中在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)偶芍、蛋白質(zhì)折疊機制、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用德玫、蛋白質(zhì)-核苷酸相互作用和蛋白質(zhì)-配體相互作用的預(yù)測和設(shè)計上匪蟀。方法是通過實驗來理解這些問題背后的基本原理，根據(jù)這些見解開發(fā)簡單的計算模型宰僧，并通過結(jié)構(gòu)預(yù)測和設(shè)計來測試模型材彪。努力通過在計算和實驗研究不斷改進方法。最近的幾個例子說明了D. Baker教授計算預(yù)測和設(shè)計方法的成功應(yīng)用：（i）使用計算蛋白質(zhì)設(shè)計方法創(chuàng)建了一個人工球狀蛋白質(zhì)琴儿，新的蛋白質(zhì)可以在原子水平上精確設(shè)計段化，目前的工作旨在利用這些技術(shù)設(shè)計具有新功能的新蛋白質(zhì)。（ii）重新設(shè)計了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的特異性造成，并證明這種特異性變化在體外和體內(nèi)都適用显熏。（iii）從頭計算蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測。在最近的CASP4和CASP5國際蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法盲測試中晒屎，進行了前所未有的精確從頭結(jié)構(gòu)預(yù)測喘蟆。

參考文獻

Courbet A, Hansen J, Hsia Y, et al. Computational design of mechanicallycoupled axle-rotor protein assemblies. Science. 2022;376(6591):383-390.doi:10.1126/science.abm1183