課程內(nèi)容
3.1.核酸的物理化學(xué)性質(zhì)
3.2. 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)
3.3. 核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)
3.4. DNA supercoil
3.5 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)
C主要知識(shí)點(diǎn)
專業(yè)名詞
Tm; C0t
Hoogsteen 堿基對(duì)
四鏈DNA quadruplex DNA
DNA復(fù)性 DNA Renaturation
DNA變性DNA Denaturation
DNA超螺旋 DNA supercoil
C值 C-value
A-型雙螺旋 A-DNA
B-型雙螺旋 B-DNA
Z-型雙螺旋 Z-DNA
拓?fù)洚悩?gòu)酶 Topoisomerase
核酶 Ribozyme
核酸的分子雜交
二代測(cè)序技術(shù) （Next generation sequencing）
理論與實(shí)驗(yàn)
1) Sanger測(cè)序的原理
2)? 二代測(cè)序的方法
3) 影響DNA變性的因素
4)?? C-Value Paradox
從本次課到第8次課向臀，均是講述DNA相關(guān)的知識(shí)由缆。核酸的結(jié)構(gòu)開始乘碑，到DNA如何組裝為染色體，基因組學(xué)（5-6）渣聚，DNA復(fù)制（7-8）。
3.1. 核酸的物理化學(xué)性質(zhì)
學(xué)習(xí)該部分的榛，希望同學(xué)們掌握描述DNA或是RNA時(shí)租悄，常用的理化參數(shù)或者名詞有哪些谨究；還有就是關(guān)于核酸的常識(shí)。
當(dāng)我們談到核酸時(shí)泣棋，一般會(huì)關(guān)注GC含量记盒、Tm值、大型飧怠（長(zhǎng)度）纪吮。
1). GC含量。一個(gè)核酸分子中萎胰，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率稱為GC含量碾盟。在DNA中，GC含量愈高技竟，DNA的密度也愈高冰肴；形成的雙鏈愈穩(wěn)定，因此熱及堿不易使之變性榔组。根據(jù)這一特性熙尉，可進(jìn)行DNA的分離或測(cè)定。此外搓扯，對(duì)生物的基因組DNA來說检痰，GC含量是一個(gè)固定值。
2). Tm值锨推。
與此相關(guān)的是核酸的變性和復(fù)性铅歼。
DNA在物理或化學(xué)因素作用下(如加熱、酸堿或紫外線照射)换可，可以導(dǎo)致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂椎椰，而核酸分子中的所有共價(jià)鍵(如磷酸二酯鍵、糖苷鍵等)則不受影響沾鳄，稱為DNA變性 (DNA denaturation or DNA melting)慨飘。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定的因素（如加熱、極端的pH译荞、有機(jī)試劑如甲醇瓤的、乙醇、尿素及甲酰胺等)均可引起核酸分子變性磁椒。比如堤瘤，PCR中，會(huì)使用90度以上的高溫讓DNA變性浆熔；分析RNA時(shí)本辐，會(huì)用65度進(jìn)行RNA的變性桥帆；Southern blotting中，會(huì)用0.4N的NaOH對(duì)凝膠中電泳分離的DNA進(jìn)行變性慎皱。
Tm值老虫，就是讓一半的DNA分子發(fā)生變性時(shí)的溫度。DNA的Tm值由以下幾個(gè)因素決定：（1）GC含量茫多，在一定條件下Tm高低與DNA分子中的GC含量成正比祈匙，G-C含量高時(shí)，Tm值比較高天揖，反之則低夺欲。這是因?yàn)镚-C之間的氫鍵較A-T多，解鏈時(shí)需要較多的能量之故今膊。（2）DNA長(zhǎng)度些阅。DNA所處的溶液條件，影響因素包括離子濃度斑唬、pH值和有機(jī)溶劑市埋。
DNA復(fù)性。復(fù)性（renaturation）恕刘，也稱退火（annealing）缤谎，就是兩條單鏈DNA分子之間依據(jù)Waston-crick堿基互補(bǔ)配對(duì)的規(guī)則，變成雙鏈的過程褐着。復(fù)性的最佳溫度一般在比Tm低25度左右坷澡。此外，如果將DNA高溫變性后献起，立刻放在冰上降溫洋访，DNA會(huì)保持變性的單鏈狀態(tài)镣陕，(稱為淬火谴餐，quelling）。同DNA變性一樣呆抑，影響DNA復(fù)性的因素包括：DNA濃度岂嗓、復(fù)性的時(shí)間、DNA序列的復(fù)雜度等鹊碍。鑒于DNA的復(fù)性的時(shí)間與DNA復(fù)雜度有關(guān)厌殉，因此可以通過用C0t值來描述DNA序列的復(fù)雜度。序列復(fù)雜度低侈咕，重復(fù)序列多公罕，復(fù)性就快，C0t值低耀销；復(fù)雜度高楼眷，復(fù)性慢，C0t就高。
DNA的變性和復(fù)性是許多實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)罐柳，比如PCR和分子雜交實(shí)驗(yàn)掌腰。例如我們?cè)赑CR中遇到高GC含量的模板時(shí)，DNA變性可能不完全张吉，會(huì)利用一些添加劑來降低Tm值齿梁，提高PCR效率。這次課的作業(yè)就是與此有關(guān)肮蛹。
另外就是經(jīng)典的分子雜交實(shí)驗(yàn)勺择。分子雜交：指兩條單鏈核酸分子間復(fù)性變?yōu)闉殡p鏈的過程。分子雜交技術(shù)伦忠，利用DNA變性酵幕、復(fù)性來檢測(cè)核酸的技術(shù)。分子雜交可以發(fā)生在DNA單鏈之間缓苛，也可以是DNA單鏈和RNA之間芳撒，或者RNA之間都可以進(jìn)行分子雜交。2）復(fù)性的兩個(gè)DNA或RNA單鏈之間未桥，序列可以不完全一致笔刹。比如DNA引物與模板之間有一個(gè)錯(cuò)配，實(shí)際上也能結(jié)合為部分雙鏈（如DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中的R型環(huán)突冬耿，R-loop）舌菜。
Southern blotting（Southern印跡）
1975年由英國(guó)人southern創(chuàng)建，是檢測(cè)DNA和繪制DNA圖譜的基本技術(shù)亦镶。其基本原理是：具有一定同源性的兩條單鏈核酸在一定的條件下日月，可按堿基互補(bǔ)的原則特異性地雜交形成雙鏈。其中一條鏈?zhǔn)枪潭ㄔ谥С治锷系拇龣z測(cè)DNA缤骨，另一個(gè)是用同位素標(biāo)記（或其他方式標(biāo)記）的DNA單鏈（即探針）爱咬。在實(shí)際操作中，一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的待檢測(cè)的DNA樣品绊起，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上精拟，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與序列已知的探針進(jìn)行雜交虱歪，用放射自顯影（或酶反應(yīng)顯色）來檢測(cè)探針是否與目標(biāo)樣品結(jié)合蜂绎，從而檢測(cè)樣品中是否具有和探針同源的序列。
Southern雜交一般用來檢測(cè)目標(biāo)DNA序列（基因）在待分析的樣品中是否存在笋鄙。例如轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)师枣。同時(shí)還可以知道目標(biāo)序列經(jīng)酶切后的大小，從而繪制目標(biāo)DNA區(qū)段的圖譜（DNA指紋）萧落。
另外還有践美，Northern blotting （Northern 雜交）劳殖，用DNA或者RNA探針檢測(cè)RNA分子。過程和原理與Southern blotting一樣拨脉。
3). DNA大小哆姻。
核酸的大小主要用堿基對(duì)（base pair，bp）來表示玫膀。常用的單位有Kb (kilo base pairs)矛缨，Mb (mega base pairs)，Gb (giga base pairs) 等帖旨。在這部分中箕昭，需要了解C-值悖論。
不同生物解阅，基因組DNA的大小差異非常大落竹，從只有幾千bp的病毒到十億以上堿基對(duì)的植物、動(dòng)物货抄。一般將單倍體基因組總DNA的含量可作為一個(gè)物種的特征述召，稱為C值。按照常理推斷蟹地，DNA的堿基多积暖，攜帶的信息就多，基因的數(shù)目就多怪与，能夠完成的生命活動(dòng)也會(huì)更復(fù)雜夺刑。在低等生物中的確存在這樣的規(guī)律，一個(gè)物種的DNA多分别，往往編碼的基因就多遍愿，能夠適應(yīng)更復(fù)雜的自然環(huán)境。但在真核生物中耘斩，DNA含量的和它編碼基因的數(shù)目是沒有嚴(yán)格的關(guān)聯(lián)沼填，和生物進(jìn)化的復(fù)雜性也沒有嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系。比如煌往，青蛙的基因組是人的7倍倾哺；在植物種，擬南芥基因組只有100多Mb刽脖，水稻是400Mb左右，玉米和小麥?zhǔn)荊b以上忌愚，但這幾種植物的復(fù)雜性曲管、進(jìn)化的程度，其實(shí)是等同的硕糊。這就引出了C值悖論（C-value paradox）院水，即一個(gè)物種的C-值與它的進(jìn)化沒有嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系腊徙。
要完整的回答C-value paradox，可能等大家學(xué)完基因組學(xué)以及后面的課程檬某，才能系統(tǒng)地解釋出現(xiàn)C-值悖論地原因撬腾。簡(jiǎn)單的說，C-值大地物種中可能有大量的非編碼DNA恢恼，還有就是大量的重復(fù)序列（如轉(zhuǎn)座子）民傻，因此C值雖大，但并沒有包含更多地基因（或是編碼更多的蛋白）场斑。那是不是這些非編碼DNA和重復(fù)區(qū)域就是不需要的漓踢，是基因組上的“垃圾DNA”，這個(gè)問題不容易回答漏隐。我們?cè)谘芯恐写_實(shí)發(fā)現(xiàn)有些DNA區(qū)域喧半，或者一些有些不表達(dá)的重復(fù)基因，去掉以后對(duì)植物沒什么影響青责。但大家回憶一下第一次課的小幽默挺据。遺傳學(xué)家將“安全帶”去掉，正常情況對(duì)汽車的行駛不會(huì)由任何影響脖隶，只有在撞車時(shí)才會(huì)發(fā)現(xiàn)它是必要的吴菠。我們現(xiàn)在將某個(gè)基因或某段DNA去掉，并不能完全確定對(duì)植物沒有影響浩村，也許是在特定條件下才會(huì)出現(xiàn)做葵；當(dāng)然，有一些DNA的確就是“進(jìn)化”的遺跡心墅，是可以拋棄的酿矢。
3.2 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指各個(gè)核苷酸結(jié)構(gòu)單元或堿基的排列順序，存儲(chǔ)了生物的遺傳信息怎燥。此部分的重點(diǎn)是學(xué)習(xí)DNA測(cè)序的原理瘫筐。
1）Sanger測(cè)序
最經(jīng)典的是Sanger測(cè)序，也稱鏈終止測(cè)序（chain termination method）铐姚。它利用DNA合成反應(yīng)過程中策肝，雙脫氧核苷酸的加入使DNA鏈的合成終止，將終止的DNA鏈電泳后隐绵，來讀取DNA序列之众。
1.進(jìn)行四組平行反應(yīng), 每一組反應(yīng)混合物含有四種dNTP, 每一組反應(yīng)含有一種少量的ddNTP
2.進(jìn)行DNA合成反應(yīng)棺禾。在多數(shù)情況下，聚合酶使用正常的核苷酸峭跳，DNA合成正常延伸膘婶；有時(shí)缺前，聚合酶使用ddNTP，而導(dǎo)致末端終止悬襟。每一組反應(yīng)中ddNTP的隨機(jī)插入留下一系列長(zhǎng)度不等的以該雙脫氧核苷酸結(jié)尾的DNA鏈衅码。
3.對(duì)每一組反應(yīng)混合物進(jìn)行凝膠電泳。DNA片段將按大小分離脊岳。片段越短逝段，電泳越快，就越靠近凝膠的底部
4.序列讀取逸绎。對(duì)凝膠電泳進(jìn)行放射自顯影惹恃，從凝膠的底部向上讀出序列
我們一般使用的是自動(dòng)化sanger測(cè)序儀，用四種不同的熒光分子棺牧，分別標(biāo)記ddATP巫糙、ddCTP，ddTTP和ddGTP颊乘。測(cè)序反應(yīng)后参淹，利用激光掃描儀直接讀取熒光分子的顏色，獲得堿基信息乏悄。（視頻： https://v.youku.com/v_show/id_XMjk5ODA3ODc2MA==.html?spm=a2h0k.11417342.soresults.dtitle）
2). 二代測(cè)序方法
即使自動(dòng)化的Sanger測(cè)序浙值，在前期需要大量的準(zhǔn)備工作，并且測(cè)序通量有限檩小，一次電泳也只能進(jìn)行384個(gè)片段的測(cè)序反應(yīng)开呐。2005 年 Roche 公司發(fā)布的 454 測(cè)序系統(tǒng)標(biāo)志著測(cè)序技術(shù)跨人高通量并行測(cè)序的時(shí)代。第二代 DNA 測(cè)序（next generation sequencing规求，NGS）技術(shù)又稱大量并行測(cè)序技術(shù)(massive parallel sequencing,MPS)筐付、高通量測(cè)序技術(shù)(high—throughputsequencing,HTS)。
NGS其特點(diǎn)是一個(gè)反應(yīng)能同時(shí)測(cè)定成千上萬的DNA片段的序列阻肿，但讀取序列的長(zhǎng)度有限瓦戚。最早只能讀取幾十個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的小片段，到現(xiàn)在能夠并行讀取300-500bp的DNA片段的序列丛塌。對(duì)于不同的測(cè)序技術(shù)较解，需要同學(xué)可以去查閱資料，到各個(gè)測(cè)序公司的官網(wǎng)了解這些測(cè)序方法的原理和性能赴邻。這里這是點(diǎn)到為止印衔。
焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）,? 454測(cè)序儀。加入某一核苷酸時(shí)乍楚，檢測(cè)DNA合成時(shí)是否產(chǎn)生PPi（焦磷酸）來判斷堿基序列当编。
Illumina/Solexa測(cè)序：熒光標(biāo)記和分子陣列。即在一張芯片上同時(shí)進(jìn)行大量的類似Sanger的測(cè)序反應(yīng)徒溪。由于使用的末端終止世紀(jì)時(shí)可逆的忿偷，在完成一個(gè)堿基的讀取后，可持續(xù)進(jìn)行DNA鏈的延伸和測(cè)序臊泌。
Ion Torrent測(cè)序（半導(dǎo)體測(cè)序）：利用半導(dǎo)體芯片捕獲DNA合成過程中產(chǎn)生pH值的變化鲤桥。
3). 三代測(cè)序
即單分子測(cè)序技術(shù)，在測(cè)序過程中不需要涉及PCR擴(kuò)增渠概，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序茶凳。三代測(cè)序技術(shù)具有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，還擁有不需要模板擴(kuò)增播揪、運(yùn)行時(shí)間較短贮喧、直接檢測(cè)表觀修飾位點(diǎn)、較高的隨機(jī)測(cè)序錯(cuò)誤等特點(diǎn)猪狈。它彌補(bǔ)了第二代測(cè)序讀長(zhǎng)短箱沦、受GC含量影響大等局限性，已在小型基因組從頭測(cè)序和組裝中有較多應(yīng)用雇庙。包括以下幾個(gè)公司的技術(shù)谓形。
Helicos （最早，2012年破產(chǎn)）
OxfordNanopore 納米孔測(cè)序（Nanopore）
Pacific Biosciences的SMART測(cè)序疆前，PacBio測(cè)序
3.3. 核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是各種形式的雙螺旋寒跳，除了最常見的B-型雙螺旋，此外還有A-型雙螺旋竹椒、Z-型雙螺旋童太。B-型雙螺旋也就是Watson和Crick提出的DNA結(jié)構(gòu)模型，是生物體內(nèi)DNA的主要形態(tài)胸完。DNA還存在三鏈螺旋和四鏈螺旋书释。由于DNA的特殊性質(zhì)，DNA可以組裝成各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的納米材料（DNA Origami）舶吗。我們感興趣是有生物學(xué)意義的核酸結(jié)構(gòu)征冷。
在DNA復(fù)制， 轉(zhuǎn)錄誓琼，重組等階段检激，雙螺旋DNA還能形成多樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)，比如分支型的DNA（在DNA修復(fù)中會(huì)出現(xiàn)）腹侣，DNA復(fù)制時(shí)形成Y性的復(fù)制叉等
部分特殊的DNA序列哈能形成三螺旋DNA和四股螺旋DNA叔收。
三股螺旋DNA
四螺旋DNA，也稱G-quadruplex傲隶，在GGG重復(fù)序列組成的DNA鏈中容易形成的四螺旋DNA饺律，發(fā)現(xiàn)于端粒、啟動(dòng)子等區(qū)域跺株。近年研究發(fā)現(xiàn)G-quadruplex可能具有非常廣泛的生物學(xué)功能复濒，參與轉(zhuǎn)錄脖卖、翻譯等環(huán)節(jié)的調(diào)控。
3.4 核酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)
??????? 在細(xì)菌巧颈、病毒畦木、真核細(xì)胞線粒體、葉綠體中砸泛，DNA多呈現(xiàn)雙鏈環(huán)狀分子十籍，是沒有自由末端的閉合雙鏈結(jié)構(gòu)（covalently closed circle DNA， cccDNA）唇礁。DNA分子可以在雙螺旋的基礎(chǔ)上勾栗，進(jìn)一步繞同一中心軸扭轉(zhuǎn)，造成額外的螺旋盏筐。形成超螺旋的結(jié)構(gòu)围俘。超螺旋本身具有方向性，因此當(dāng)旋轉(zhuǎn)方向不同時(shí)机断，可產(chǎn)生正超螺旋和負(fù)超螺旋兩種形式的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)楷拳。右手超螺旋（順時(shí)針），稱為負(fù)超螺旋（與DNA雙螺旋的旋轉(zhuǎn)方向相反的扭轉(zhuǎn)）吏奸；反之形成的左手超螺旋（逆時(shí)針）稱為正超螺旋（與DNA雙螺旋的旋轉(zhuǎn)方向相同的扭轉(zhuǎn)）欢揖。
在生物體內(nèi)，DNA主要以負(fù)超螺旋的形式存在奋蔚，并通過拓?fù)洚悩?gòu)酶來調(diào)整DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)她混。DNA超螺旋與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄都有關(guān)（可見DNA復(fù)制部分）。
真核生物染色體雖然是線性分子泊碑，但其DNA與蛋白質(zhì)相互結(jié)合坤按，以許多大環(huán)的形式存在，許多個(gè)環(huán)的基部聚合在一起形成類似環(huán)的結(jié)構(gòu)馒过。此外臭脓，真核生物DNA在細(xì)胞中高度壓縮成染色體結(jié)構(gòu)，在后面的章節(jié)中會(huì)介紹腹忽。
3.5 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)
RNA為單鏈来累，非常容易分子內(nèi)或是分子間形成雙鏈，進(jìn)而形成各類二級(jí)結(jié)構(gòu)窘奏。RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)跟它的功能有密切聯(lián)系嘹锁，比如核糖體RNA、snoRNA着裹、tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)领猾，siRNA來源于雙鏈RNA，miRNA來源于同一個(gè)RNA分子形成的stem-loop結(jié)構(gòu)等。這節(jié)的另外一部分內(nèi)容就是希望大家熟悉各類RNA相關(guān)的名詞摔竿。
