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Basic Information

• 英文標題： Macrophage-mediated myelin recycling fuels brain cancer malignancy
• 中文標題：巨噬細胞介導(dǎo)的髓鞘回收為腦癌惡性提供燃料
• 發(fā)表日期：19 September 2024
• 文章類型：Article
• 所屬期刊：Cell
• 文章作者：Daan J. Kloosterman | Leila Akkari
• 文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424008249

Highlights

Para_01

• TAMs 回收富含膽固醇的髓鞘糙臼，并在膠質(zhì)母細胞瘤中獲得富含脂質(zhì)的特征
• 由髓鞘碎片清除引起的表觀遺傳重編程是LLM免疫抑制特征的基礎(chǔ)
• LLMs 將髓鞘來源的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至膠質(zhì)母細胞瘤細胞贵涵，以促進疾病進展
• LLMs與患者侵襲性間質(zhì)亞型和不良預(yù)后相關(guān)

Summary

Para_01

1. 在代謝受挑戰(zhàn)的環(huán)境中生長的腫瘤糠馆，如大腦中的膠質(zhì)母細胞瘤遍膜，特別依賴與腫瘤微環(huán)境（TME）的相互作用來滿足其高能量需求纺阔。
2. 為了研究這種代謝相互作用的復(fù)雜性衔峰，我們使用單細胞和多組學(xué)分析來研究膠質(zhì)母細胞瘤TME的異質(zhì)性屑彻，并識別出具有促腫瘤生成特性的代謝重編程腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）亞群撞蚕。
3. 這些TAM亞群润梯，被命名為脂質(zhì)負荷巨噬細胞（LLMs），以反映其膽固醇積累甥厦，經(jīng)歷了表觀遺傳重編程纺铭，表現(xiàn)出免疫抑制特征，并且在侵襲性間充質(zhì)膠質(zhì)母細胞瘤亞型中富集刀疙。
4. 吞噬富含膽固醇的髓鞘碎片使得TAM的某些亞群獲得LLM表型舶赔。
5. 隨后，LLMs通過LXR/Abca1依賴性方式直接將髓鞘來源的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到癌細胞谦秧，從而為間充質(zhì)膠質(zhì)母細胞瘤的高代謝需求提供燃料竟纳。
6. 我們的工作深入了解了膠質(zhì)母細胞瘤進展過程中的免疫代謝相互作用，從而為揭示膠質(zhì)母細胞瘤中可靶向的代謝脆弱性奠定了基礎(chǔ)疚鲤。

Graphical abstract

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Keywords

• glioblastoma; macrophages; cholesterol; myelin recycling; lipid metabolism; cancer immunity; tumor microenvironment

Introduction

Para_01

1. 大腦中發(fā)生的腫瘤受益于獨特的微環(huán)境锥累，這一環(huán)境隨著惡性特征的擴展而被動態(tài)利用。
2. 膠質(zhì)母細胞瘤是最具侵略性的原發(fā)性腦腫瘤集歇，它是一種無法治愈的疾病桶略，預(yù)后糟糕，并且在腫瘤亞型、微環(huán)境生態(tài)位和免疫景觀方面表現(xiàn)出高度異質(zhì)性际歼。
3. 除了再現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育層次結(jié)構(gòu)外惶翻，膠質(zhì)母細胞瘤亞型還具有影響巨噬細胞極化的不同代謝特征。
4. 由于巨噬細胞在膠質(zhì)瘤生成和治療反應(yīng)中起著重要作用蹬挺，這些細胞已被探索為有潛力的治療靶點维贺。
5. 然而，膠質(zhì)母細胞瘤所表現(xiàn)出的高腫瘤內(nèi)和患者間異質(zhì)性挑戰(zhàn)了針對腦癌的泛巨噬細胞"一刀切"的治療方法巴帮，這要求深入理解它們的巨大可塑性溯泣。

Para_02

1. 確實，巨噬細胞是膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤微環(huán)境（TME）中最豐富的免疫細胞榕茧，并且在發(fā)生學(xué)上是多樣的垃沦，包括駐留在大腦中的小膠質(zhì)細胞（MG）和浸潤的單核細胞來源的巨噬細胞（MDMs）。
2. 盡管最近的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析報告稱用押，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）的亞群可以預(yù)測生存或表現(xiàn)出改變的代謝特征肢簿，但支撐膠質(zhì)母細胞瘤TAM多樣性和功能的分子基礎(chǔ)仍然知之甚少。

Para_03

1. 在這項研究中蜻拨，我們采用多組學(xué)方法來解析TAM亞群的異質(zhì)性和空間多樣性池充，揭示它們與不同膠質(zhì)母細胞瘤亞型之間的特定生態(tài)位相互作用，以及它們在放療（RT）后疾病復(fù)發(fā)中的影響缎讼。
2. 通過使用互補的模型系統(tǒng)和功能分析收夸，我們發(fā)現(xiàn)TAM介導(dǎo)的機制允許膠質(zhì)母細胞瘤細胞克服代謝自主型腦環(huán)境所特有的挑戰(zhàn)。
3. 我們表明血崭，脂質(zhì)在呈現(xiàn)脂質(zhì)負荷表型的間充質(zhì)樣（MES樣）膠質(zhì)母細胞瘤癌細胞和TAM亞群之間的代謝相互作用中扮演著中心角色卧惜。
4. 隨著TAM不斷發(fā)展，獲得這種重新連接的代謝教育夹纫，它們獲得了增強的促腫瘤發(fā)生和免疫抑制特性咽瓷，從而加劇了膠質(zhì)母細胞瘤的惡性。
5. 我們的研究深入揭示了TME中TAM亞群特化的機制舰讹，并確定TAM代謝重編程是膠質(zhì)母細胞瘤中可以利用的治療脆弱性茅姜。

Results

Murine glioblastoma displays dynamic cellular subtype heterogeneity in response to RT

小鼠膠質(zhì)母細胞瘤對放療表現(xiàn)出動態(tài)的細胞亞型異質(zhì)性反應(yīng)

Para_01

1. 為了揭示巨噬細胞與腫瘤細胞之間的相互作用的惡性膠質(zhì)瘤，我們研究了兩個基因工程小鼠模型（GEMMs）的單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組水平上的膠質(zhì)母細胞瘤TME的動態(tài)結(jié)構(gòu)月匣，這兩個模型再現(xiàn)了人類膠質(zhì)瘤發(fā)生和治療反應(yīng)的關(guān)鍵特征匈睁。
2. 這兩種GEMMs涉及在內(nèi)皮素陽性祖細胞中強制表達血小板衍生生長因子-β，背景為Ink4a/ArfKO（PDG-Ink4a）或與腫瘤細胞中短發(fā)夾介導(dǎo)的p53敲低相結(jié)合（PDG-p53）桶错。
3. 正交地，公開可用的膠質(zhì)母細胞瘤患者數(shù)據(jù)集使我們能夠驗證我們小鼠模型的臨床相關(guān)性胀蛮。
4. 我們探討了與局部微環(huán)境相關(guān)的巨噬細胞亞群異質(zhì)性院刁，采用多組學(xué)方法和一系列功能性的ex vivo和in vitro實驗，以揭示在膠質(zhì)母細胞瘤TME中巨噬細胞和腫瘤細胞共進化下的促腫瘤相互作用（圖1A）粪狼。

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• 圖 1. 單細胞分析揭示了膠質(zhì)母細胞瘤間充質(zhì)亞型和GPNMBhigh TAMs的同時存在（A）實驗設(shè)計的示意圖退腥，用于評估巨噬細胞亞群和膠質(zhì)母細胞瘤亞型/生態(tài)位異質(zhì)性和使用膠質(zhì)母細胞瘤GEMM和公共數(shù)據(jù)集的相互作用（見STAR方法）任岸。（B）來自scRNA-seq膠質(zhì)母細胞瘤小鼠數(shù)據(jù)集的主要細胞群體的均勻流形近似和投影（UMAP）表示（DCs，樹突狀細胞狡刘；ECs享潜，內(nèi)皮細胞）。（C）scRNA-seq進行的膠質(zhì)母細胞瘤亞型異質(zhì)性的視覺表示嗅蔬。（D）每個模型中膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型的平均分數(shù)（外圈）剑按。膠質(zhì)母細胞瘤細胞（內(nèi)圈）的偽定位2分配顯示為細胞亞型的百分比。
• （E）MG和MDM亞群的UMAP表示澜术。（F）在（E）中確定的MG和MDM群中描繪的通路的基因集富集分析（GSEA）得分艺蝴。（G）（E）中確定的簇的TAM亞群的偽定位生態(tài)位分配；表示為平均值±SEM鸟废。（H）左中和中間：在膠質(zhì)母細胞瘤模型中復(fù)發(fā)時TAM亞群的不同豐度猜敢。右：TAM亞群與膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型豐度之間的相關(guān)性矩陣。
• （I）GPNMBhigh和GPNMBlow TAM簇之間差異表達的前25個基因（表S1C）盒延。（J）在小鼠和人類膠質(zhì)母細胞瘤scRNA-seq數(shù)據(jù)集中缩擂，GPNMBhigh TAMs與MES膠質(zhì)母細胞瘤細胞之間的相關(guān)性。
• 統(tǒng)計：Kendall趨勢檢驗（H）或簡單線性回歸（J）（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001）添寺。P2RY12胯盯，嘌呤能受體P2Y12；TNF畦贸，腫瘤壞死因子陨闹；GPNMB，糖蛋白Nmb薄坏；CCR2趋厉，C-C趨化因子受體2型；H2-EB1胶坠，組織相容性2君账，II類抗原E Beta。另見圖S1和表S1沈善。與圖1和2乡数、表S2相關(guān)的單細胞RNA測序和VISIUM10x數(shù)據(jù)集的計算機分析相關(guān)基因簽名。與圖1闻牡、表S3相關(guān)的巨噬細胞亞群基因集過表達分析净赴。GPNMB的基因集過表達分析。

Para_01

1. 單細胞RNA測序(scRNA-seq)顯示罩润，來自原始(未經(jīng)治療)和復(fù)發(fā)性(在5×2 Gy分割放療后復(fù)發(fā))腫瘤的CD45+和CD45?熒光激活細胞分選(FACS)純化細胞玖翅，在兩種膠質(zhì)母細胞瘤GEMM模型中均突顯了膠質(zhì)母細胞瘤TME的細胞異質(zhì)性(圖1B)。為了了解膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤細胞異質(zhì)性對巨噬細胞教育的影響，我們首先根據(jù)之前在單細胞水平上報道的特定轉(zhuǎn)錄特征金度，將腫瘤細胞分為與不同分子亞型相關(guān)的分子亞型应媚。
2. 在患者中，這些細胞亞型——類神經(jīng)祖細胞樣(NPC-like)猜极、類少突膠質(zhì)細胞祖細胞樣(OPC-like)中姜、類星形膠質(zhì)細胞樣(AC-like)和MES樣——在每個個體腫瘤中均有表達，這種異質(zhì)性在小鼠膠質(zhì)母細胞瘤模型中得到了再現(xiàn)(圖1C)跟伏。
3. 我們使用了Ivy膠質(zhì)母細胞瘤圖譜項目(GAP)數(shù)據(jù)集丢胚，該數(shù)據(jù)集定義了膠質(zhì)母細胞瘤主要解剖特征的niche-specific轉(zhuǎn)錄特征(LE，前沿酬姆；CT嗜桌，細胞腫瘤；MVP辞色，微血管增殖骨宠；PAN，偽柵欄細胞圍繞壞死)相满，將單個腫瘤細胞分配到一個偽空間位置层亿，并發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型在這些niche中異質(zhì)分布(圖1D)。

Para_02

1. 接下來立美，我們分析了原發(fā)性和復(fù)發(fā)性小鼠膠質(zhì)母細胞瘤中癌細胞腫瘤內(nèi)異質(zhì)性匿又，并探討在放療后的復(fù)發(fā)疾病中，是否如人類腫瘤中所見建蹄，發(fā)生了亞型轉(zhuǎn)變碌更。
2. PDG-p53模型表現(xiàn)出主要的AC樣原發(fā)腫瘤，而在復(fù)發(fā)時轉(zhuǎn)變?yōu)镺PC樣主導(dǎo)組成洞慎，盡管存在高腫瘤間變異性（圖1D）痛单。
3. 與之不同的是，以O(shè)PC樣腫瘤細胞為主導(dǎo)群體的PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤在復(fù)發(fā)時預(yù)測性地向更富含MES表型的方向轉(zhuǎn)變（圖1D）劲腿。
4. 總的來說旭绒，這些結(jié)果顯示異質(zhì)性和動態(tài)的癌細胞亞型變化在小鼠PDG驅(qū)動的腫瘤中以階段和生態(tài)位依賴的方式發(fā)生，與膠質(zhì)母細胞瘤患者的報道結(jié)果相呼應(yīng)焦人。

Macrophage subset dynamics correlate with glioblastoma stage, cellular subtype composition, and local niches

巨噬細胞亞群動態(tài)與膠質(zhì)母細胞瘤階段挥吵、細胞亞型組成和局部生態(tài)位相關(guān)

Para_01

1. 我們接下來探索了癌癥細胞亞型動態(tài)與巨噬細胞異質(zhì)性的異型相互作用。
2. 無監(jiān)督聚類分析將MDM和MG細胞分成了8種狀態(tài)花椭，包括4種MG和4種MDM亞群（圖1E和S1A）忽匈。
3. 我們檢查了這些不同TAM身份的轉(zhuǎn)錄表型與膠質(zhì)母細胞瘤微解剖生態(tài)位、疾病階段和分子亞型的關(guān)系矿辽。
4. 在兩種TAM亞群中丹允，我們觀察到了從預(yù)先激活（MG1-P2RY12和MDM1-CCR2）到炎癥（MG2-TNF和MDM2-H2-EB1）歪沃、代謝活躍（MG3-GPNMB和MDM3-GPNMB）以及增殖狀態(tài)（MG4-MKI67和MDM4-MKI67）的表型譜（圖1F和S1B-S1D；表S1A嫌松、S1B和S2A-S2H）。
5. 與之前報道的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤TME中MDM含量增加一致奕污，復(fù)發(fā)性腫瘤中MDM4-MKI67的豐度顯著增加萎羔，且MG4-MKI67和MDM4-MKI67群都與MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞的存在呈正相關(guān)（圖1H）。
6. 時間戳轉(zhuǎn)錄特征揭示了從MDM1到MDM3的48小時時間戳逐漸富集碳默，這表明了MDM中發(fā)生了一種分化軌跡贾陷，而不是TME中亞群的擴張（圖S1E）。

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• 圖S1：對膠質(zhì)母細胞瘤中巨噬細胞景觀的深入轉(zhuǎn)錄組分析嘱根，與圖1相關(guān)（A）堆積小提琴圖描繪了在圖1B和1E中展示的MG和MDM群體（52,688個細胞）中定義MG1-4和MDM1-4簇的代表基因的表達髓废；表S1A。所有PDG-Ink4a原發(fā)（n=3）和復(fù)發(fā)（n=3）以及PDG-p53原發(fā)（n=4）和復(fù)發(fā)（n=3）腫瘤樣本中的MG和MDM均有代表该抒。
• 顏色與圖1E中呈現(xiàn)的細胞簇相對應(yīng)慌洪。（B）熱圖顯示從GSEA獲得的與每個巨噬細胞簇相關(guān)的已發(fā)表特征的平均富集分數(shù)，數(shù)據(jù)按列在1和0之間縮放凑保。顯示的特征來自表S1B中引用的已發(fā)表研究冈爹。
• （C和D）條形圖描繪了每個MG（C）和MDM（D）簇特有的相關(guān)通路的調(diào)整后p值。結(jié)果是通過 對每個簇的前30個顯著差異表達基因（padjusted<0.05）進行基因集富集分析產(chǎn)生的（見表S2）欧引。
• （E）線圖描繪了每個MDM簇中12小時和48小時膠質(zhì)母細胞瘤MDM時間戳模塊的平均富集分數(shù)频伤。（F）餅圖表示每個MG亞群占健康腦中總巨噬細胞百分比，通過scRNA-seq捕獲芝此。
• （G）條形圖顯示了與GPNMBlow或GPNMBhigh簇中增加的前30個差異表達基因相關(guān)的顯著富集通路的調(diào)整后p值（表S3）憋肖。統(tǒng)計方法：Fisher精確檢驗與Benjamini-Hochberg方法結(jié)合，用于多假設(shè)檢驗的校正婚苹。
• （H）小提琴圖顯示了每個MG和MDM簇的GPNMBhigh特征富集分數(shù)岸更，顯示了每個簇中分配為GPNMBhigh的巨噬細胞百分比。（I）餅圖表示通過scRNA-seq對所有測序腫瘤中定義為GPNMBhigh TAMs的巨噬細胞亞群組成租副。
• （J）散點圖描繪了T細胞含量（作為CD45+細胞的百分比）與膠質(zhì)母細胞瘤患者樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的GPNMBhigh TAMs豐富度（作為總TAMs的百分比）之間的相關(guān)性坐慰。每個數(shù)據(jù)點代表一個單獨的膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤（n=22）。紅線表示簡單線性回歸用僧。Pearson相關(guān)系數(shù)和p值顯示在右上角结胀。

Para_01

1. 正如預(yù)期的那樣，預(yù)激活的MG1-P2RY12簇责循，與從健康大腦中FACS純化的MG非常相似糟港，預(yù)計在腫瘤LE中與其他MG亞群相比會過度表達，表明腫瘤從MG起源的大腦實質(zhì)中侵入（圖1G和S1F）院仿。
2. 同樣秸抚，類似預(yù)激活的單核細胞滲透到腫瘤部位的MDM1-CCR2簇（圖S1A和S1E）速和，預(yù)計會在MVP區(qū)域富集，這與外周招募的預(yù)期一致（圖1G）剥汤。

Para_02

1. 從這些特定于發(fā)生的簇中颠放，我們鑒定出具有炎癥特征的巨噬細胞。
2. 在微膠質(zhì)（MG）室中吭敢，組成MG2-TNF簇的細胞同樣具有在神經(jīng)炎癥中報道的轉(zhuǎn)錄教育碰凶，因此高表達促炎基因（Tnf、Ccl4和Ccl3）和神經(jīng)炎癥反應(yīng)途徑（圖1F鹿驼、S1B和S1C欲低；表S1B）。
3. 相對應(yīng)的MDM2-H2-EB1簇也表現(xiàn)出了炎癥反應(yīng)基因表達的增加畜晰，盡管性質(zhì)不同砾莱，并且通過增加抗原處理特征（H2-Eb1、H2-Aa和Cd74）區(qū)分開來（圖S1B和S1D凄鼻；表S1A）腊瑟。
4. 有趣的是，MG2-TNF和MDM2-H2-EB1巨噬細胞簇與MES2細胞亞型呈負相關(guān)（圖1H）野宜，表明富含MES的膠質(zhì)母細胞瘤總體上表現(xiàn)出較低的炎癥性TAMs扫步，這與患者中它們的侵略性表型一致。

Para_03

1. MDM3-GPNMB 簇位于 MG 和 MDM 聚集以及 MDM 分化軌跡的頂端（圖 1E 和 S1E）匈子，在 MES 富集的 PDG-Ink4a 復(fù)發(fā)腫瘤中特異性增加（圖 1H）河胎。
2. 與 MG3-GPNMB 細胞一起，這兩個簇主要被預(yù)測位于 PAN（低氧）膠質(zhì)母細胞瘤生態(tài)位中虎敦，MES2 腫瘤細胞偏好居住在這里（圖 1D 和 1G）游岳。
3. 功能上，來自 MDM3-GPNMB 和 MG3-GPNMB 簇的巨噬細胞具有與"脂質(zhì)相關(guān)"巨噬細胞相似的轉(zhuǎn)錄教育（圖 S1B其徙；表 S2C 和 S2G）胚迫。
4. 有趣的是，這些巨噬細胞在轉(zhuǎn)錄上與之前在膠質(zhì)母細胞瘤小鼠模型和患者樣本中具有脂質(zhì)/吞噬教育或具有促腫瘤生成的免疫抑制功能的 TAM 相似唾那。
5. 相比之下访锻，這些簇表現(xiàn)出所有 TAM 亞群中最低的炎癥表型，同時呈現(xiàn)細胞通路活化增加闹获，這些通路涉及泡沫細胞分化（圖 1F）掰曾。
6. 因此雹顺，這些無偏分析突顯了 MDM3-GPNMB 和 MG3-GPNMB TAM 亞群可能的脂質(zhì)相關(guān)或脂質(zhì)負荷表型吞杭。
7. 雖然脂質(zhì)負荷巨噬細胞（LLMs）之前在肥胖或動脈粥樣硬化的背景下觀察到河爹，最近在一小部分癌癥中作為一種促腫瘤生成的 TAM 亞群出現(xiàn)，但它們在大腦中的存在僅在有衰老和神經(jīng)退行性疾病的過程中有報道沙庐。
8. 總的來說鲤妥，我們的發(fā)現(xiàn)表明佳吞，與 LLMs 轉(zhuǎn)錄相似的 GPNMBhigh TAMs 在 MES 富集的膠質(zhì)母細胞瘤中增加，隨著 PDG-Ink4a 膠質(zhì)母細胞瘤在復(fù)發(fā)性疾病中轉(zhuǎn)向這種亞型棉安，并與低氧微解剖生態(tài)位中的 MES 樣癌細胞相關(guān)底扳。
9. 假設(shè)這種異型交叉對話可能會推動膠質(zhì)母細胞瘤的進展和 OPC 向 MES 的轉(zhuǎn)變，我們試圖進一步驗證 LLMs 在膠質(zhì)母細胞瘤中的存在及其意義贡耽。

Para_04

1. 利用區(qū)分MG3-GPNMB和MDM3-GPNMB TAM群落的差異表達基因花盐，我們生成了一個GPNMBhigh特征，以可靠地量化呈現(xiàn)與其它疾病中的LLMs相似的轉(zhuǎn)錄表型的TAMs的百分比（圖1I和S1G菇爪；表S3A和S3B）。
2. 有趣的是柒昏，除了MG3/MDM3群集之外凳宙，被歸類為GPNMBhigh的TAMs還包括屬于其他TAM子集的細胞（圖S1H和S1I）。
3. 與之前的研究一致职祷，相關(guān)分析揭示了MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞與GPNMBhigh巨噬細胞在小鼠和人類膠質(zhì)母細胞瘤中的強烈相關(guān)性氏涩，不受原發(fā)/復(fù)發(fā)性疾病階段的影響（圖1J）。
4. 正如預(yù)期有梆，從它們的抗炎特性（圖1F）來看是尖，GPNMBhigh巨噬細胞與患者樣本中的淋巴浸潤呈負相關(guān)，支持脂質(zhì)負荷表型的巨噬細胞在MES富集的膠質(zhì)母細胞瘤的免疫抑制性中起作用的觀點（圖S1J）泥耀。
5. 總的來說饺汹，我們的結(jié)果表明GPNMBhigh TAMs通過獲得脂質(zhì)負荷、抗炎表型并與侵襲性MES樣亞型相關(guān)聯(lián)痰催，具有功能上的重要性兜辞。

Spatial co-localization of GPNMBhigh macrophages with MES-like cells in hypoxic niches

GPNMBhigh 巨噬細胞與 MES-like 細胞在缺氧生態(tài)位中的空間共定位

Para_01

1. 為了加深我們對巨噬細胞亞群與膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型之間空間相互作用的了解，我們對小鼠膠質(zhì)母細胞瘤組織切片進行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析夸溶。
2. 使用代表巨噬細胞（IBA1）逸吵、微血管周細胞（MVP，CD31）缝裁、普遍缺氧標記（PAN扫皱，缺氧標記物pimonidazole）、低密度細胞（LE捷绑，低密度DAPI）和高密度細胞（CT韩脑，高密度DAPI）的免疫熒光（IF）染色，以可視化不同微解剖膠質(zhì)母細胞瘤生態(tài)位中的TAM存在（圖2A）胎食。
3. 重要的是扰才，這些染色與定義Ivy GAP轉(zhuǎn)錄生態(tài)位特征的分類相重疊（圖2B）。
4. 此外厕怜，針對每種膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型的特定基因列表被用來根據(jù)該位置最代表性的亞型對點進行分類（圖2B）衩匣。
5. 我們使用一個3步分類策略來分配巨噬細胞亞群分布蕾总，以關(guān)聯(lián)生態(tài)位和膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型（圖S2A）。
6. 這種方法揭示了TAM亞群和膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型在原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤中的豐富程度和空間共定位琅捏，這些腫瘤來自兩種膠質(zhì)母細胞瘤GEMMs（圖2C和2D）生百。

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• 圖 2. 類似MES的癌細胞和GPNMBhigh TAMs在缺氧生態(tài)位中共定位（A）代表性免疫熒光染色，用于VISIUM 10X空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的冷凍新鮮腦腫瘤切片柄延。（B）根據(jù)VISIUM 10X測序點（見STAR方法）對主導(dǎo)生態(tài)位和膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型轉(zhuǎn)錄活性的分類可視化蚀浆。（C）空間共存工作流程：將TAM亞群、膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型和生態(tài)位的轉(zhuǎn)錄模塊分配給每個點搜吧，以推斷相關(guān)系數(shù)市俊。（D）中央：TAM亞群轉(zhuǎn)錄模塊與膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型（頂部）或微解剖生態(tài)位轉(zhuǎn)錄模塊（底部）在所有VISIUM 10X樣本中的相關(guān)性矩陣；點顏色和大小對應(yīng)于相關(guān)系數(shù)滤奈。TAM亞群摆昧、腫瘤生態(tài)位或膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型在復(fù)發(fā)性與原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤中的出現(xiàn)LogFC顯示在矩陣的底部和右側(cè)；數(shù)據(jù)表示為平均值+S.D.（E-G）空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的代表可視化蜒程，突出顯示GPNMBhigh匱乏（1）和豐富（2）區(qū)域绅你。將分配為GPNMBlow或GPNMBhigh的點覆蓋在相應(yīng)的IF圖像上（E），并與膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型（F）或微解剖生態(tài)位（G）平行昭躺，如（B）中所定義忌锯。統(tǒng)計：Kendall趨勢檢驗（D）（?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001）。另見圖S2和表S2领炫。

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• 圖S2.巨噬細胞亞群的空間分析及驗證脂質(zhì)負載巨噬細胞在轉(zhuǎn)錄水平上代表高級別GBM腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)中的GPNMBhigh偶垮，與圖2和圖3相關(guān)（A）使用來自PDG-Ink4a原發(fā)腫瘤的代表性Visium 10X數(shù)據(jù)集，確定巨噬細胞亞群空間分布的3步分類策略示意圖帝洪。
• 在將斑點點確定為泛巨噬細胞特征（Aif1针史、Lgals3、Itga1碟狞、Trem2啄枕、P2ry12和Siglech）陽性后，根據(jù)微glia特異性基因表達（P2ry12和Siglech）將斑點歸類為MG或MDMs族沃。
• 為每個MG或MDM簇使用特定的基因特征（見表S1H）频祝，以分配亞群得分。
• 最高的亞群得分將每個相應(yīng)的點分類到TME中的特定TAM亞群（右圖）脆淹。
• （B）代表性IF圖像常空，顯示新鮮冷凍的PDG-Ink4a小鼠膠質(zhì)母細胞瘤組織切片中的初級組織切片。
• DAPI：核染料（藍色）盖溺；IBA1：泛巨噬細胞（洋紅色）漓糙；PLIN2：脂滴（LDs）（白色）；BODIPY：中性脂質(zhì)標記（黃色）烘嘱。
• IBA1陽性但PLIN2和BODIPY陰性的細胞被鑒定為非LLMs（左放大）昆禽。
• IBA1蝗蛙、PLIN2和BODIPY均陽性的細胞被鑒定為LLMs（右放大）。
• （C）IF定量LLMs（IBA1+細胞醉鳖，表面面積為≥500像素[0.325μm/像素]且含有≥5個PLIN2+斑點[定義為LDs]）作為PDG-Ink4a荷瘤小鼠原發(fā)性及復(fù)發(fā)性腫瘤中總TAMs的百分比捡硅。
• （D）在PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤中，低氧和無低氧區(qū)域中LLMs的定量盗棵。
• 連接的點對代表相同的樣本壮韭。
• （E）代表性流式細胞術(shù)圖，展示復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤中LLM FACS純化的門控策略纹因。
• 活巨噬細胞（CD45+CD11b+Ly6ClowLy6Glow）的每個TAM亞群（MG喷屋；CD49dlow）和MDMs（CD49dhigh）根據(jù)SSC-A（粒度）和BODIPY（中性脂質(zhì)）強度被分類為LLMs或非LLMs（與其起源無關(guān)）。
• （F）熱圖描繪了RNA-seq分析中LLMs和非LLMs之間標準化基因表達的對數(shù)倍變化瞭恰。
• 熱圖中顯示的基因在圖3B中所示的脂質(zhì)負載MG和MDMs中普遍上調(diào)逼蒙。
• 統(tǒng)計方法：兩階段逐步非配對t檢驗（C）或雙尾配對t檢驗（D）。
• 數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（C）寄疏。

Para_01

1. 空間轉(zhuǎn)錄組分析證實，屬于預(yù)激活MG1-P2RY12群集的MG確實在腫瘤LE中富集（圖2D）僵井。
2. 重要的是陕截，盡管所有MDM群集都與MES1亞型相關(guān)，但GPNMBhigh TAMs特異性地與MES2膠質(zhì)母細胞瘤細胞的存在相關(guān)批什，尤其是在PAN生態(tài)位中农曲，這兩種細胞類型都豐富且它們的相互作用增強（圖2D-2G）。
3. 我們識別出在TME中表達脂滴標記物perilipin-2（PLIN2）和中性脂質(zhì)染色BODIPY的TAMs驻债，確認了特定TAM亞群中脂滴的積累（圖S2B）乳规。
4. 與PDG-Ink4a模型中OPC向MES轉(zhuǎn)變后的RT期間GPNMBhigh亞群富集一致（圖1D和2D），在復(fù)發(fā)時觀察到顯示脂質(zhì)負荷表型（PLIN2+脂滴水平高和大小增加）的TAMs顯著增加（圖S2C）合呐。
5. 此外暮的，結(jié)合PLIN2染色和pimonidazole確認了LLMs在缺氧區(qū)積累，尤其是在MES2膠質(zhì)母細胞瘤細胞所在的復(fù)發(fā)環(huán)境中（圖1D和S2D）淌实。
6. 這些發(fā)現(xiàn)突顯了GPNMBhigh TAMs與缺氧生態(tài)位中的MES樣腫瘤細胞之間的復(fù)雜互惠通訊冻辩，并表明GPNMBhigh巨噬細胞顯示出特有的脂質(zhì)負荷表型。

LLMs display metabolic and immunosuppressive programs associated with altered chromatin landscapes and promote glioblastoma relapse post-RT

LLMs顯示出與改變的染色質(zhì)景觀相關(guān)的代謝和免疫抑制程序拆祈，并促進放療后的膠質(zhì)母細胞瘤復(fù)發(fā)

Para_01

1. 為了探索脂質(zhì)負荷的GPNMBhigh TAM的形成起源恨闪，我們首先驗證了GPNMBhigh巨噬細胞與LLMs無法區(qū)分，并對來自PDG-Ink4a腫瘤的FACS純化的脂質(zhì)富集（BODIPYhigh放坏，SSC-Ahigh）MG和MDMs進行了RNA-seq分析（圖3A和S2E）咙咽。
2. 通過比較MG和MDM亞群中的LLMs和非LLMs之間的差異表達基因，我們鑒定出在LLMs和非LLMs之間特有和共享的基因簽名淤年，這些基因來自不同的起源（圖3B钧敞；表S3A和S3B）蜡豹。
3. 在來自組織駐留或單核細胞來源的FACS純化LLMs中普遍上調(diào)的基因與GPNMBhigh TAM轉(zhuǎn)錄簽名中的幾個基因重疊（圖1I和S2F）。
4. 實際上犁享，GPNMBhigh巨噬細胞在轉(zhuǎn)錄上與LLMs重疊余素，證實了GPNMBhigh巨噬細胞在膠質(zhì)母細胞瘤中確實是脂質(zhì)負荷的（圖3C）。
5. 這些發(fā)現(xiàn)促使我們將GPNMBhigh TAMs稱為LLMs炊昆，并使用GPNMBhigh簽名來轉(zhuǎn)錄識別LLMs桨吊。

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• 圖 3. 脂肪負載巨噬細胞的促腫瘤生成表型與染色質(zhì)可及性的丟失相關(guān)（A）脂肪負載巨噬細胞（LLM）多組學(xué)分析的示意圖。（B）FACS 分離的 MG 和 MDM 亞群中非 LLM 和 LLM 的 RNA-seq 識別的差異表達基因的維恩圖凤巨。（C）堆疊小提琴圖描繪了根據(jù) FACS 純化的巨噬細胞亞群 RNA-seq 分析鑒定的基因特征（表 S1D）在圖 1E 中的 TAM 亞群轉(zhuǎn)錄富集情況视乐。（D）不同染色質(zhì)可及性區(qū)域巨噬細胞亞群的平均峰型圖譜（頂部）和熱圖（底部），顯示歸一化的 ATAC-seq（通過測序檢測轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)的分析）信號敢茁。（E）與非 LLMs 相比佑淀，LLM 啟動子區(qū)域基因表達與更高和更低的可及性相關(guān)的 LogFC，基于 MG 和 MDM 亞群中相同基因的表達彰檬。（F）基于 MDM-LLMs 相較于非 LLMs 的啟動子可及性更高或更低相關(guān)的基因表達顯著富集基因集的 Log10(FDR, 假發(fā)現(xiàn)率)伸刃。（G）來自 MDM 亞群的歸一化相關(guān) ATAC-seq 峰信號。（H）巨噬細胞亞群中 H3K27me3 的流式細胞術(shù) MFI逢倍。（I）巨噬細胞亞群中指定細胞表面標記表達的 MFI 的 Log2FC捧颅。統(tǒng)計數(shù)據(jù)見圖 S3J。（J）流式細胞術(shù)定量 LLMs（BODIPYhigh, SSC-Ahigh）较雕。（K）Kaplan-Meier 曲線顯示對照組（DMSO）碉哑；RT（5x2 Gy）和 DMSO；SSO（每天 30 mg/kg 治療）亮蒋；或 RT + SSO 治療組隨時間變化的動物生存情況扣典。（L）來自（K）治療組中 LLMs（BODIPYhigh, SSC-Ahigh）的流式細胞術(shù)定量。統(tǒng)計數(shù)據(jù)：Wilcoxon 符號秩和檢驗（E）慎玖，兩因素方差分析伴 Sídák 多重比較校正（H 和 L）贮尖，兩階段逐步上升未配對 t 檢驗伴 Benjamini、Krieger 和 Yekutiel 多重比較校正（J）趁怔，或?qū)?shù)秩檢驗（K）远舅。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± SEM（H–J 和 L）。另見圖 S2痕钢、S3 和 S4 以及表 S3 和 S4图柏。

Para_01

1. 為了深化我們對驅(qū)動大脂質(zhì)巨噬細胞（LLM）形成的潛在機制的理解，我們檢查了通過FACS純化的含脂質(zhì)和不含脂質(zhì)的MG和MDM的染色質(zhì)狀態(tài)和可及性（圖3A）任连。
2. 我們確認MG和MDM顯示出與它們胚胎起源相關(guān)的基因表達所特有的發(fā)育特異性峰（分別是Sall135和Itga4,10）（圖S3A）蚤吹。
3. 與MG相比，MDM顯示出更多的可及性調(diào)控元件，支持這樣的觀點裁着，即組織印記限制了巨噬細胞向功能特化的可塑性（圖S3B）繁涂。
4. 在非含脂質(zhì)MDM中富集的峰被鑒定為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細胞因子介導(dǎo)的信號通路的基因，而在非含脂質(zhì)MG特有的峰與調(diào)節(jié)組織常駐功能的基因表達相關(guān)（圖S3C和S3D二驰；表S4A-S4H）扔罪。

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• 擴展的特定于個體發(fā)生的富含脂質(zhì)的巨噬細胞染色質(zhì)景觀分析，與圖3相關(guān)（A）與MG特定（Sall1）或MDM特定（Itga4）的可訪問性相關(guān)的基因區(qū)域在LLMs和非LLMs中的MG和MDM亞群中的標準化ATAC-seq信號桶雀。（B）維恩圖描繪了非富含脂質(zhì)的MG和MDM中的ATAC-seq的共識峰數(shù)矿酵。（C和D）直方圖顯示了基于（B）中描繪的差異表達基因的非富含脂質(zhì)的MDM（C）和MG（D）中顯著富集基因集的-log10(FDR)。垂直線在-log10(FDR)=2處表示顯著性閾值矗积。顏色表示差異可訪問基因和基因集之間的重疊全肮。（E）維恩圖描繪了基于ATAC-seq分析確定的MG（頂部）和MDM（底部）中的LLMs與非LLMs之間的共識峰。（F）點圖描繪了源自單核來源的LLMs（左）和非LLMs（右）中所有差異可訪問峰的motif富集分析的-log10(FDR)棘捣。顏色代表差異可訪問峰與所有檢測到的峰（背景）相比的logFC辜腺。相關(guān)的motif簇用藍色突出顯示，與這些motif相關(guān)的TFs在底部面板中給出乍恐。（G）熱圖描繪了基于變量x軸的比較的染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子基因表達的logFC评疗，這是從批量RNA-seq分析（如圖3B所示）確定的。（H）直方圖描繪了來自復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤攜帶小鼠的MG（紫色）和MDM（藍色）亞群中的LLMs和非LLMs的H3K27me3的平均熒光強度（MFI）茵烈。（I）來自原發(fā)性（左）和復(fù)發(fā)性（右）PDG-Ink4a腫瘤攜帶小鼠的MG和MDM亞群中的LLMs和非LLMs的EZH2的平均熒光強度（MFI）的量化百匆。（J）與同一原發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)瘤樣本中的非富含脂質(zhì)的MG和MDM相比，富含脂質(zhì)的MG（左）和MDM（右）中描述的細胞表面標記物的MFI瞧毙。統(tǒng)計方法：兩階段逐步增加的多重配對t檢驗，使用Benjamini寄症，Krieger和Yekutieli校正進行多重測試（H-J）宙彪。數(shù)據(jù)以均值+SEM（H-J）表示。

Para_01

1. 我們接下來評估了與脂質(zhì)負荷表型相關(guān)的染色質(zhì)景觀變化有巧。
2. 無論其發(fā)生學(xué)如何释漆，LLMs 與非LLM對照組相比，失去了對許多染色質(zhì)區(qū)域的訪問權(quán)限篮迎，而獲得的峰明顯較少男图，顯示出更為微妙的變化（圖3D和S3E）。
3. 有趣的是甜橱，只有脂質(zhì)負荷的MDMs中逊笆，染色質(zhì)對啟動子區(qū)域的可及性與基因表達相關(guān)，而在脂質(zhì)負荷的MG中則不然（圖3E）岂傲。
4. 脂質(zhì)負荷MDMs中低染色質(zhì)可及性與炎癥通路相關(guān)基因的表達下調(diào)相關(guān)难裆，例如H2-Eb1和Cd74（圖3F和3G）。
5. 重要的是，與無非脂質(zhì)負荷MDMs相比乃戈，脂質(zhì)負荷MDMs在脂質(zhì)運輸（Abca1）褂痰、吞噬作用和突觸修剪相關(guān)基因中獲得了特定峰，同時失去了與膽固醇生物合成（Dhcr24）相關(guān)基因區(qū)域的可及性（圖3F和3G）症虑。
6. 我們接下來對這些峰進行了基序分析缩歪，結(jié)果顯示在無非脂質(zhì)負荷MDMs中富集了NF-κB（核因子 kappa-輕鏈增強子活化的B細胞）和RUNX（Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子），這兩個轉(zhuǎn)錄因子已知可介導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)（圖S3F）谍憔。
7. 相比之下匪蝙，脂質(zhì)負荷MDMs顯示出富集了已知參與巨噬細胞免疫抑制表型的TFs，如CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）和激活轉(zhuǎn)錄因子3（ATF3）（圖S3F）韵卤。

Para_02

1. 有趣的是骗污，H3K27me3組蛋白去甲基化酶Kdm6b在脂肪負荷的巨噬細胞（MG）和單核細胞衍生的巨噬細胞（MDMs）中均顯著下調(diào)（圖S3G）。
2. 這些發(fā)現(xiàn)表明沈条，Kdm6b介導(dǎo)的H3K27me3抑制性組蛋白標記的丟失是LLM炎癥基因染色質(zhì)可及性降低的基礎(chǔ)需忿。
3. 流式細胞術(shù)分析證實，與未負荷脂肪的MDMs相比蜡歹，脂肪負荷MDMs中的H3K27me3水平升高屋厘。
4. MG中升高的H3K27me3水平與它們較低的染色質(zhì)可及性狀態(tài)相關(guān)，這可能阻礙了原發(fā)性腫瘤和復(fù)發(fā)性腫瘤中來自TME的外在信號的整合（圖3H和S3H）月而。
5. 除了下調(diào)Kdm6b外汗洒，LLMs還顯示出EZH2（Enhancer Of Zeste Homolog 2）水平增加，這是H3K27me3的主要催化酶父款。
6. 與MDMs相比溢谤，MG中較高的EZH2水平與其脂肪負荷表型無關(guān)，這可能是組織駐留MG中H3K27me3基礎(chǔ)水平升高的基礎(chǔ)（圖S3I）憨攒。

Para_03

1. 脂質(zhì)負荷的MG和MDMs與它們的非LLM對應(yīng)物相比顯示出增強的免疫抑制特征世杀，包括CD39和PD-L1（程序性死亡配體1）水平的增加（圖3I和S3J）。
2. 特別是肝集，脂質(zhì)負荷的MDMs下調(diào)了主要組織相容性復(fù)合體（MHC-II）的表達瞻坝，這表明當MDMs獲得LLM表型時，抗原呈遞功能受損（圖3I）杏瞻。
3. 有趣的是所刀，LLMs中的脂質(zhì)受體CD36表達上調(diào)（圖3I），這與我們之前觀察到的LLMs特有的脂滴積累特征相一致（圖S2B）捞挥。
4. 復(fù)發(fā)PDG-Ink4a型膠質(zhì)母細胞瘤中脂質(zhì)負荷MDM的含量增加浮创，與scRNA-seq揭示的OPC向MES的轉(zhuǎn)化相一致（圖1D和3J）。
5. 重要的是砌函，在未經(jīng)治療的NF1驅(qū)動的MES主導(dǎo)的膠質(zhì)母細胞瘤模型42中蒸矛，脂質(zhì)負荷MDM富集與MES樣膠質(zhì)母細胞瘤之間的關(guān)聯(lián)得到了證實（圖3J）。
6. 總的來說，我們的發(fā)現(xiàn)進一步鞏固了MES樣膠質(zhì)母細胞瘤與LLMs之間的關(guān)聯(lián)雏掠，其免疫抑制和脂質(zhì)相關(guān)表型部分是由Kdm6b的下調(diào)和EZH2的上調(diào)驅(qū)動的斩祭。
7. 因此，脂質(zhì)負荷MDMs中H3K27me3抑制性標記的升高與炎癥基因下調(diào)背后的染色質(zhì)可及性的喪失相關(guān)乡话。

Para_04

1. 接下來摧玫，我們評估了LLMs在膠質(zhì)母細胞瘤進展中的功能意義，通過針對CD36绑青，一個主要由含脂質(zhì)的MDMs和MG優(yōu)先表達的脂質(zhì)受體（圖3I诬像、S4A和S4B）。
2. 基于PDG-Ink4a模型中LLM頻率的動力學(xué)（圖S4C）闸婴，我們在放療完成后兩天開始每天縱向治療使用血腦屏障可通透的CD36抑制劑磺基琥珀酰亞胺油酸（SSO）43（圖S4D）坏挠。
3. 重要的是，與單獨放療相比邪乍，SSO治療結(jié)合放療可顯著提高攜帶膠質(zhì)母細胞瘤的小鼠的生存率（圖3K）降狠。
4. 與RT +vehicle相比，RT +SSO中的LLM頻率呈中度下降庇楞，僅MDM-TAM亞群中差異顯著（圖3L和S4E）榜配。
5. 經(jīng)SSO處理的腫瘤顯示出MHC-II+ MDMs的群體顯著增加（圖S4F），而淋巴免疫組成和活化保持不變（圖S4G-S4I）吕晌。
6. 這些實驗建立了針對LLMs的潛在概念驗證蛋褥，促使我們進一步研究它們在膠質(zhì)母細胞瘤TME中出現(xiàn)的機制基礎(chǔ)及其促腫瘤功能。

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• 圖S4：驗證髓鞘來源脂質(zhì)作為TAM表型的調(diào)節(jié)劑睛驳，其可以通過CD36抑制與放療聯(lián)合使用來改變烙心，與圖3和圖4相關(guān)（A）點圖顯示小鼠單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集中最豐富細胞類型的CD36 RNA表達水平。顏色代表平均表達水平乏沸；大小表示表達Cd36的細胞百分比淫茵。
• （B）在實驗終點，對經(jīng)過RT處理的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤中各種細胞群體的CD36平均熒光強度（MFI）進行量化屎蜓。腫瘤細胞：CD45?CD11b?CD31?細胞痘昌；內(nèi)皮細胞：CD45?CD11b?CD31+細胞钥勋。所有巨噬細胞和LLM巨噬細胞：見圖S2E炬转。
• （C）流式細胞術(shù)量化原發(fā)、放療后2天（5×2 Gy）以及復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤中的脂質(zhì)負荷（BODIPYhighSSC-Ahigh）MG（左）和MDMs（右）算灸。
• （D）實驗設(shè)計和治療方案的示意圖扼劈。按照STAR方法描述的方法啟動腫瘤，以產(chǎn)生PDG-Ink4a腫瘤攜帶小鼠菲驴。在腫瘤啟動后4-6周荐吵，通過MRI對腫瘤大小進行量化，并使用區(qū)組隨機化方法根據(jù)腫瘤體積（20–90 mm3）均勻分配小鼠至治療各組。治療組為對照（DMSO）先煎、分割放療（RT贼涩，5×2 Gy）以及DMSO、SSO（每天30 mg/kg）或RT+SSO薯蝎。
• DMSO和SSO治療在聯(lián)合治療組中在最后一次RT劑量后48小時開始遥倦。在出現(xiàn)癥狀或指定的時點處死小鼠。
• （E）圖表展示在實驗終點占锯，經(jīng)過RT+DMSO和RT+SSO治療后袒哥，從復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤中分離的MG（左）和MDMs（右）的脂質(zhì)代謝標記物的平均熒光強度（MFI）。
• （F）流式細胞術(shù)量化MHC-II+ MDMs作為總MDMs的百分比消略，在實驗終點經(jīng)過RT+DMSO和RT+SSO治療的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤堡称。
• （G）量化CD3+淋巴樣細胞群體（作為CD45+細胞的百分比），在實驗終點經(jīng)過RT+DMSO或RT+SSO治療的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤艺演。B細胞：NK1.1?CD19+却紧；CD8T細胞：NK1.1?CD19?CD3+CD8+；CD4T細胞：NK1.1?CD19?CD3+CD4+钞艇。
• （H和I）圖表展示在實驗終點經(jīng)過RT+DMSO或RT+SSO治療的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤中啄寡，CD8 T細胞（H）和CD4 T細胞（I）的所示活化標記物的平均熒光強度（MFI）。
• （J）膽固醇從頭生物合成途徑的示意圖哩照，描繪了膽固醇前體和衍生物以及涉及的酶（斜體）挺物。通過脂質(zhì)組學(xué)（圖4A-4C）和RNA-seq（圖4D）確定的LLMs中增加的酶和中間體用綠色標記，減少的用紅色標記飘弧。
• （K）代表性IF圖像识藤，展示新鮮冷凍的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤組織切片中LLM相對于髓鞘堿性蛋白的位置。DAPI：核染（藍色）次伶；IBA1：泛巨噬細胞（洋紅色）痴昧；PLIN2：脂滴（LDs）（白色）；髓鞘堿性蛋白（MBP）（黃色）冠王。T赶撰，腫瘤；H柱彻，相鄰的正常大腦豪娜。
• （L）餅圖展示從健康小鼠大腦中分離的髓鞘中發(fā)現(xiàn)的每種主要脂質(zhì)物種的平均比例。此圖的數(shù)據(jù)通過NMR量化膽固醇（紅色）以及通過Lipidyzer分析量化其他脂質(zhì)類別（灰色）哟楷。統(tǒng)計方法：混合效應(yīng)分析（B和C）或兩因素方差分析瘤载，Sídák校正進行多重比較（E-I）。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（B和G-I）卖擅，±SEM（C荒勇、E和F）或±SD（L）。

Myelin debris in the TME drives cholesterol accumulation and LXR activation in TAMs

腫瘤微環(huán)境中的髓鞘碎片驅(qū)動 TAMs 中膽固醇積累和 LXR 激活

Para_01

1. 我們研究了LLMs與非LLM對照在體內(nèi)特有的脂質(zhì)體景觀钝尸，這可能是它們促進腫瘤形成的特性的基礎(chǔ)。脂質(zhì)組學(xué)分析顯示LLMs中固醇扣汪、鞘磷脂、膽固醇酯（CEs）和三酰甘油的水平升高（圖4A）锨匆。值得注意的是私痹，LLMs中膽固醇及其前體物質(zhì)的水平升高，例如5α-7,24-膽固醇二烯统刮、羊毛甾醇和脫莫瓦龍酸（圖4B和4C）紊遵。有趣的是，參與膽固醇從頭合成途徑的多個酶的下調(diào)（圖4D和S4J）表明侥蒙，LLMs中觀察到的膽固醇積累來源于TME中的外部來源暗膜，而不是從頭合成。這些發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)退行性疾病中泡沫狀巨噬細胞的表型相呼應(yīng)鞭衩，其中膽固醇豐富的髓鞘碎片吞噬作用觸發(fā)膽固醇積累和膽固醇生物合成關(guān)閉学搜。這種負反饋導(dǎo)致膽固醇前體物質(zhì)如脫莫瓦龍酸的積累，進而激活肝X受體（LXR）论衍，通過增加膽固醇外流來克服膽固醇過載瑞佩。
2. ,

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• 圖4：LLM的形成依賴于髓鞘吞噬作用及隨后的固醇積累（A和B）所示脂質(zhì)類別的標準化水平（圖S6J中的縮寫）以及FACS純化的LLM和非LLM中固醇的校正面積比。（C）根據(jù)（B）中的脂質(zhì)組學(xué)分析評估的FACS純化的LLM和非LLM中的脫氫膽固醇濃度坯台。（D）根據(jù)圖3B中的FACS純化的LLM和非LLM的膽固醇合成途徑基因的標準化表達炬丸。（E）從腫瘤中分離出的髓鞘中存在的主要脂質(zhì)種類的平均比例。（F）初級PDG-Ink4a腫瘤切片的代表性電子顯微鏡圖像蜒蕾〕砭妫框1.2和2.2分別是框1.1和2.1的高倍圖像。（G）初級PDG-Ink4a腫瘤切片的代表性IF圖像咪啡。DAPI：核染料（藍色）首启；IBA1：泛巨噬細胞（洋紅色）；PLIN2：脂滴（白色）撤摸；MBP：髓鞘堿性蛋白（黃色）毅桃。（H）初級PDG-Ink4a腫瘤中TAM亞群的平均MBP強度定量（如圖S4K所示）。每個點代表單個TAM（IBA1+）准夷，大小對應(yīng)細胞面積钥飞。（I）代表一個IBA1+PLIN2+LLM的視覺IF圖像，以及用于注釋單個TAM（IBA1+）作為MBP+（與MBP的最小距離小于0像素）冕象，靠近MBP（0-5像素）或遠離MBP（>5像素）的距離到髓鞘代承。（J）根據(jù)（I）中描述的每個TAM的最小距離與MBP+染色的相關(guān)性汁蝶，定量每個TAM中存在的脂滴總數(shù)渐扮。（K）圖S5C所示的體外LLM的流式細胞術(shù)定量论悴。（L）根據(jù)（K）中使用的FACS純化的dTomato+BMDMs的RNA-seq確定的差異表達基因（表S5A）。（M）根據(jù)（L）得出的特征進行GSEA富集的相關(guān)途徑的p值（表S5B-S5J）墓律。統(tǒng)計方法：兩因素方差分析膀估，采用Sídák校正進行多重比較（A和B），雙尾配對t檢驗（C和D）耻讽，成對比較分析成對的多種群均值（H）察纯，成對比較分析成對的多種群均值（J），單因素方差分析针肥，采用Sídák校正進行多重比較（K）饼记，結(jié)合Benjamini-Hochberg校正的Fisher精確檢驗（M）。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（A-D和K）或±SD（E）慰枕。另見圖S4和S5及表S5具则。

Para_01

1. 為了探討髓鞘作為賦予TAMs LLM表型的脂質(zhì)關(guān)鍵來源的潛力，我們首先使用髓鞘堿性蛋白（MBP）作為標志物具帮，探查了腫瘤組織中髓鞘的存在博肋。
2. 在TME中，與PLIN2+LLMs相鄰的區(qū)域蜂厅，發(fā)現(xiàn)了類似髓鞘碎片的結(jié)構(gòu)匪凡，其構(gòu)型與健康腦組織中的髓鞘相比發(fā)生了扭曲（圖S4K）。
3. 重要的是掘猿，從膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤中分離出的髓鞘的脂質(zhì)組學(xué)分析病游，證實了膽固醇的過度表達，與非腫瘤負荷大腦中的髓鞘相似（圖4E和S4L）稠通。
4. 探測脫髓鞘和再髓鞘化的轉(zhuǎn)錄特征45顯示與膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤呈正相關(guān)礁遵，而與相鄰正常腦組織無關(guān)，證實了髓鞘碎片在膠質(zhì)母細胞瘤中的積累（圖S5A和S5B）采记。
5. 這些發(fā)現(xiàn)暗示脫髓鞘和再髓鞘化途徑在膠質(zhì)母細胞瘤中被觸發(fā)佣耐，可能是TME中髓鞘碎片存在的基礎(chǔ)。
6. 重要的是唧龄，電子顯微鏡（EM）成像在體內(nèi)確認了髓鞘碎片存在于巨噬細胞吞噬體中（圖4F）兼砖。
7. 此外，髓鞘吞噬和MBP在TAMs中的積累與尺寸增加和脂質(zhì)積累相連貫既棺，表明巨噬細胞吞噬并回收髓鞘成脂質(zhì)（圖4G-4J）讽挟。
8. 這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了巨噬細胞需要清除髓鞘碎片，以在膠質(zhì)母細胞瘤TME中獲得LLM表型丸冕。

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Para_01

1. 為了確認局部髓鞘碎片攝取在LLM形成中的作用耽梅，我們建立了一個離體共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中dTomato+骨髓來源的巨噬細胞（BMDMs）暴露于分離的小鼠膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤中胖烛，這些腫瘤之前有或沒有經(jīng)過髓鞘耗竭處理（圖S5C）眼姐。
2. 有趣的是诅迷，整個分離的腫瘤或僅髓鞘碎片均導(dǎo)致了顯著的LLM形成，而在沒有髓鞘的情況下众旗，這種效應(yīng)消失了（圖4K和S5D）罢杉，這突顯了髓鞘作為脂質(zhì)來源對TAMs獲取富含脂質(zhì)的表型的重要作用。
3. 有趣的是贡歧，與僅含髓鞘的情況相比滩租，添加整個腫瘤（含髓鞘）使總的脂質(zhì)含量增加了3倍，而僅含髓鞘的情況下增加了2倍（圖S5D）利朵，這表明TME在啟動巨噬細胞LLM表型中有所貢獻律想。

Para_02

1. 為了解析來自腫瘤微環(huán)境（TME）或髓鞘本身的信號線索對LLM形成的貢獻，我們對來自體外共培養(yǎng)實驗的dTomato+ BMDMs進行了FACS分離并進行了RNA-seq（圖4L和S5C绍弟；表S5A-S5L）蜘欲。
2. 有趣的是，參與吞噬作用和補體激活的通路的上調(diào)提示TME賦予了"吃我"信號晌柬，指導(dǎo)巨噬細胞增強其吞噬能力（圖S5E）姥份。
3. 重要的是，這些信號可能調(diào)節(jié)髓鞘的特異性攝取年碘，因為條件培養(yǎng)基（CM）教育的巨噬細胞中CD36的抑制阻礙了髓鞘的吞噬澈歉，但并未損害微球體的吞噬（圖S5F）。
4. 正交地屿衅，髓鞘暴露誘導(dǎo)了參與膽固醇代謝和脂質(zhì)運輸?shù)耐繁磉_埃难，同時下調(diào)了膽固醇生物合成（圖S5E），與體內(nèi)LLM特征相似（圖4D）涤久。
5. 有趣的是涡尘，TME和髓鞘來源信號指導(dǎo)巨噬細胞教育的交叉點包括吞噬脂質(zhì)、吞噬作用和LXR通路激活的通路的上調(diào)响迂，以及與脂質(zhì)輸出相關(guān)的基因（Abca1）表達的增加（圖4M）考抄。
6. 令人驚訝的是，在髓鞘存在的情況下蔗彤，TME特異性的教育促進巨噬細胞的炎癥反應(yīng)被抑制（圖4M）川梅，推斷膠質(zhì)母細胞瘤誘導(dǎo)的炎癥被這種脂質(zhì)源所阻礙，從而促進了LLM的免疫抑制表型（圖3I）然遏。
7. 總的來說贫途，這些發(fā)現(xiàn)揭示TME來源的信號使巨噬細胞清除髓鞘碎片作為脂質(zhì)源。反過來待侵，吞噬的髓鞘碎片驅(qū)動膽固醇前體的積累丢早，激活LXR，從而減弱炎癥活動并上調(diào)LLM中的脂質(zhì)輸出秧倾。

MES-like glioblastoma cells enhance TAM-mediated myelin recycling and lipid export into the TIF

類似于MES的小膠質(zhì)母細胞增強TAM介導(dǎo)的髓鞘回收和脂質(zhì)向TIF的輸出

Para_01

1. 我們接下來旨在探究髓鞘回收在LLM（低級別孤立性腦膜瘤）與膠質(zhì)母細胞瘤細胞交互作用中的功能意義怨酝。為了在體外模擬這種相互影響傀缩，我們從原發(fā)或復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤中分別產(chǎn)生了類似OPC（少突膠質(zhì)細胞前體）和MES（間充質(zhì)樣）的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系。
2. 原發(fā)/OPC樣和復(fù)發(fā)性/MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞表達了它們所代表亞型的特征性基因凫碌，MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞顯示糖酵解活動顯著增加，代表它們在體內(nèi)的特性（見圖5A和S5G-S5J）胃榕。
3. 當BMDMs（骨髓來源的巨噬細胞）被膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤條件化培養(yǎng)基（TCM）教育后盛险，髓鞘碎片吞噬作用增強，而非一般吞噬作用（見圖S5K和S5L）勋又，導(dǎo)致脂質(zhì)積累增加（見圖5C和S6A）苦掘，這與體內(nèi)LLM表型相似（見圖S2B和S2E）。
4. 類似地楔壤，TCM介導(dǎo)的原代MG（小膠質(zhì)細胞）的啟動增加了對髓鞘碎片反應(yīng)的LLM形成（見圖S6B）鹤啡，強調(diào)髓鞘介導(dǎo)的LLM表型不僅限于MDMs（單核細胞來源的巨噬細胞）。
5. 盡管OPC樣和MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞都能指導(dǎo)BMDMs中的LLM形成蹲嚣，但MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞的高度糖酵解特征（見圖5A和S5J）影響了此過程递瑰，如通過抑制糖酵解導(dǎo)致LLM生成減少所示（見圖S6C）。
6. 此外隙畜，暴露于髓鞘（而非TCM）觸發(fā)了H3K27me3的上調(diào)（見圖5D）抖部，強化了髓鞘在調(diào)控基因表達變化以獲得巨噬細胞LLM表型中的作用。

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• 圖 5. LLM 中的 LXR 信號通路激活促進 TME 內(nèi)的脂質(zhì)交換（A）在由原發(fā)/OPC 樣（n = 4）或復(fù)發(fā)性/MES 樣（n = 4）PDG-Ink4a 腫瘤生成的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系上進行 Seahorse 糖酵解活性實驗议惰，隨時間變化的細胞外酸化速率（ECAR）慎颗。（B）BMDMs 中髓鞘羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）攝取（MFI）的相對倍數(shù)變化言询。（C）BMDMs 在髓鞘暴露下相對于對照組（無髓鞘）的 BODIPY MFI 相對倍數(shù)變化俯萎。（D）BMDMs 在單培養(yǎng)（±髓鞘）或與 MES 樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞共培養(yǎng)時 H3K27me3 MFI 的相對倍數(shù)變化。（E 和 F）通過定量實時 PCR（RT-qPCR）評估 BMDMs 暴露于（E）對照培養(yǎng)基或 MES 樣 TCM 以及（F）MES 樣 TCM ± 髓鞘時的 LXR 信號通路基因的相對表達运杭。（G）在小鼠單細胞 RNA 測序數(shù)據(jù)集（圖 1B）中確定的最多細胞類型的脂質(zhì)輸出和脂蛋白受體基因的表達水平夫啊。（H）BMDMs 在體外與髓鞘接觸 24 小時后，上清液中游離膽固醇的量化辆憔。（I）實驗設(shè)計說明從膠質(zhì)母細胞瘤中收集 TIF（參見 STAR 方法）涮母。（J）TIF 中檢測到的總脂質(zhì)（峰值的總和）的相對水平。（K）TIF 中膽固醇酯（CE）水平與 Ntb 組織（對照）相比的倍數(shù)變化躁愿。統(tǒng)計方法：Friedman 測試配合 Dunn 多重比較校正（B叛本、C、J 和 K）彤钟，單因素方差分析配合 Sídák 校正（D）来候，雙因素方差分析配合 Sídák 多重比較校正（E 和 F），或雙尾配對 t 檢驗（H）逸雹。數(shù)據(jù)表示為平均值 + SEM（A-C）或 ± SEM（D-F营搅、H云挟、J 和 K）。另見圖 S5 和 S6转质。

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• 圖S6. 分析巨噬細胞中髓鞘誘導(dǎo)的LXR激活园欣，該細胞在TME中協(xié)調(diào)脂質(zhì)交換，與圖5相關(guān)（A）代表來自BMDMs的流式細胞術(shù)圖休蟹，BMDMs暴露于MES樣TCM±髓鞘沸枯，如圖S5K所示。門控設(shè)置在BODIPYhigh和SSC-Ahigh的BMDMs上赂弓，以識別LLMs in vitro绑榴。（B）流式細胞術(shù)定量LLMs（BODIPYhigh，SSC-Ahigh）作為先前暴露于對照培養(yǎng)基或MES樣TCM的主要小膠質(zhì)細胞（MG）的百分比盈魁，髓鞘碎片暴露后24小時（3小時）翔怎。（C）MES樣TCM培養(yǎng)的BMDMs暴露于髓鞘（3小時）后的BODIPY MFI倍數(shù)變化，與未暴露于髓鞘的情況相比杨耙。MES樣TCM取自用糖酵解抑制劑2-DG處理或不處理的細胞（圖S5K）赤套。通過流式細胞術(shù)使用BODIPY染色評估BMDMs對髓鞘攝取的脂質(zhì)積累。（D和E）通過qPCR評估代表LLM特征的基因的表達（如圖1I所示）珊膜，BMDMs暴露于（D）MES樣TCM±髓鞘1小時或24小時于毙，（E）對照培養(yǎng)基或MES樣TCM單獨。（F）通過qPCR評估BMDMs在MES樣TCM條件下暴露于髓鞘±LXR抑制劑時Abca1辅搬、Abcg1唯沮、Dhcr24和Nr1h3的相對表達。（G和H）對Filipin（膽固醇染色）進行了體外BMDMs的免疫熒光染色堪遂，BMDMs在MES樣TCM±LXR抑制劑（LXRi）條件下培養(yǎng)24小時介蛉，并暴露或未暴露于髓鞘（3小時）。直方圖描繪每個BMDM（G）或BMDMs中的每個脂質(zhì)滴（H）的Filipin平均強度溶褪。線條代表中位數(shù)和四分位數(shù)币旧。（I）小提琴圖描繪了從小鼠單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集中提取的膽固醇外流相關(guān)基因Abca1、Abcg1猿妈、Apoc1和Apoe在LLMs和非LLMs中的標準化基因表達水平吹菱。（J）通過脂質(zhì)組學(xué)分析，在原發(fā)性/OPC樣和復(fù)發(fā)性/MES樣PDG-Ink4a腫瘤的TIF中定量所示的脂質(zhì)類與非腫瘤大腦（Ntb）組織相比的倍數(shù)變化彭则。BRSE鳍刷，菜油酸酯；CASE俯抖，菜油酸酯输瓜；CL，心磷脂；CE尤揣，膽固醇酯搔啊；Cer_BS，神經(jīng)酰胺β-羥基脂肪酸-鞘磷脂北戏；Cer_NS负芋，神經(jīng)酰胺非羥基脂肪酸-鞘磷脂；CoQ嗜愈，輔酶Q旧蛾；DG，二酰甘油芝硬；FA蚜点，游離脂肪酸轧房；LPC拌阴，溶血磷脂酰膽堿；LPI奶镶，溶血磷脂酰肌醇迟赃；MGDG，單半乳糖基二酰甘油厂镇；PA纤壁，磷脂酸；PC捺信，磷脂酰膽堿酌媒；PE，磷脂酰乙醇胺迄靠；PE_Cer秒咨，神經(jīng)酰胺磷脂酰乙醇胺；PG掌挚，磷脂酰甘油雨席；PI，磷脂酰肌醇吠式；PI_Cer陡厘，神經(jīng)酰胺磷脂酰肌醇；PS特占，磷脂酰絲氨酸糙置；SHexCer，硫苷脂是目；SM罢低，鞘磷脂；SSulfate，固醇硫酸酯网持；TG宜岛，三酰甘油；CAR功舀，跗汲基肉堿；ST辟汰，固醇列敲。（K）Ntb小鼠、原發(fā)性/OPC樣和復(fù)發(fā)性/MES樣PDG-Ink4a腫瘤的間質(zhì)液中神經(jīng)酰胺（Cer）物種水平的相對倍數(shù)變化帖汞。（L）在Ntb戴而、原發(fā)性、RT復(fù)發(fā)性和SSO處理的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤的間質(zhì)液中檢測到的總脂質(zhì)水平（總峰面積）翩蘸。圖5J中的Ntb所意、原發(fā)性和復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a組的數(shù)據(jù)點。（M）在Ntb催首、原發(fā)性扶踊、RT復(fù)發(fā)性和SSO處理的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤的腫瘤間質(zhì)液（TIF）中定量膽固醇酯（CE）的相對水平。圖5K中的Ntb郎任、原發(fā)性和復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a組的數(shù)據(jù)點秧耗。統(tǒng)計：雙向方差分析，Sídák校正進行多重比較（B舶治、D-F分井、J和K），兩階段逐步配對t檢驗（C）霉猛，或混合效應(yīng)分析尺锚，Sídák校正進行多重比較（G、H韩脏、L和M）缩麸。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（B、C和F）和±SEM（D赡矢、E和J-M）杭朱。

Para_01

1. 接下來，我們進一步研究了LLM和MES樣膠質(zhì)母細胞之間的相互作用吹散，這是基于我們觀察到的這兩種細胞類型在轉(zhuǎn)錄水平和空間水平上的強烈相關(guān)性（圖1J和2D）弧械。
2. 當BMDM暴露于MES樣TCM+髓鞘碎片時，會誘導(dǎo)BMDM獲取LLM特異基因空民，而這種誘導(dǎo)作用僅靠MES樣TCM是無法實現(xiàn)的（圖S6D和S6E）刃唐。
3. 盡管MES樣TCM能增加編碼LXR-α蛋白的Nr1h3基因表達（圖5E）羞迷，但在此背景下需要髓鞘的存在來上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Abca1和Abcg1（均為LXR激活的下游分子）的表達，并下調(diào)Dhcr24的表達（圖5F）画饥，
4. 正如體內(nèi)觀察到的衔瓮，這是細胞內(nèi)膽固醇和desmosterol積累的標志，繼髓鞘攝取后發(fā)生（圖4B–4D和S4J）抖甘。
5. 如預(yù)期那樣热鞍，由于desmosterol在泡沫狀巨噬細胞形成過程中激活LXR的激動作用，LXR的藥理抑制阻礙了髓鞘誘導(dǎo)的脂質(zhì)輸出基因Abca1和Abcg1的表達（圖S6F）衔彻，導(dǎo)致膽固醇在巨噬細胞中積累（圖S6G和S6H）薇宠。
6. 這些膽固醇流出轉(zhuǎn)運體主要在TAMs中表達（圖5G），并在膠質(zhì)母細胞瘤LLMs中上調(diào)（圖S6I）艰额。
7. 與這種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運體表達增加一致澄港，巨噬細胞在體外攝取髓鞘后能有效流出膽固醇（圖5H）。
8. 這一發(fā)現(xiàn)促使我們評估原發(fā)/OPC樣和復(fù)發(fā)/MES樣膠質(zhì)母細胞瘤的腫瘤間質(zhì)液（TIF）中的脂質(zhì)含量（圖5I）柄沮。
9. 脂質(zhì)組學(xué)分析顯示回梧，MES樣、LLM富集腫瘤的TIF中檢測到的總脂質(zhì)量增加（圖5J和S6J）铡溪，包括CEs（圖5K）漂辐，之前發(fā)現(xiàn)LLMs中CEs水平升高（圖4A）泪喊。
10. 由于CEs是高密度脂蛋白（HDLs）的主要成分棕硫，而HDL介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運活性在髓鞘暴露后巨噬細胞中上調(diào)（圖S5E），這些結(jié)果表明LLMs中HDL介導(dǎo)的膽固醇流出增加袒啼。
11. 此外哈扮，MES樣富集的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤顯示出神經(jīng)酰胺水平升高（圖S6K），這是一種與脫髓鞘有關(guān)的脂質(zhì)類別蚓再。
12. 總的來說滑肉，這些數(shù)據(jù)揭示了一種調(diào)節(jié)機制，其中髓鞘碎片增加的水平是MES樣膠質(zhì)母細胞瘤中LLM積累的基礎(chǔ)摘仅。
13. 值得注意的是靶庙，經(jīng)SSO處理的阻礙LLM形成的復(fù)發(fā)性腫瘤（圖3K，3L和S4E）顯示出TIF總脂質(zhì)水平降低（圖S6L）娃属，包括CEs（圖S6M）六荒。

Para_02

1. 總之，這些發(fā)現(xiàn)揭示了大脂質(zhì)分子不僅含有多種脂質(zhì)類別的增加水平矾端，而且通過腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的LXR途徑的激活掏击，將髓鞘來源的脂質(zhì)輸出到腫瘤間質(zhì)中。
2. 這些結(jié)果促使我們進一步研究大脂質(zhì)分子介導(dǎo)的膽固醇外流對膠質(zhì)母細胞瘤癌細胞的惡性特征的意義秩铆。

Myelin-induced LLMs fuel MES-like glioblastoma cell malignancy

髓磷脂誘導(dǎo)的LLMs促進類似MES的膠質(zhì)母細胞瘤細胞惡性

Para_01

1. 為了確定膠質(zhì)母細胞瘤細胞在吞噬和加工髓鞘后如何從LLM衍生的脂質(zhì)中獲益砚亭，我們檢查了需要此類外部脂質(zhì)源的不同膠質(zhì)母細胞瘤亞型的代謝特征。
2. 盡管腫瘤細胞普遍顯示出膽固醇從頭合成途徑的高轉(zhuǎn)錄活性（圖S7A），但MES樣細胞捅膘，尤其是MES2亞型添祸，顯示出最低的膽固醇生物合成活性。
3. 實際上寻仗，與其它癌細胞亞型相比膝捞，MES樣細胞在多種脂質(zhì)生物合成途徑中表現(xiàn)出低活性（圖6A和6B），這一特征在患者樣本中也觀察到（圖S7B和S7C）愧沟。
4. 相反蔬咬，MES2細胞表達了高水平的Vldlr（圖6B），這是一種HDL的膜受體沐寺，可能有利于它們清除含有LLM衍生的膽固醇的脂蛋白（圖S5E）林艘。
5. 這使我們推測，以脂質(zhì)攝取和交換為中心的代謝串擾是MES樣細胞與LLM相互作用的核心混坞。
6. 實際上狐援，髓鞘中的脂質(zhì)并不容易獲得腫瘤細胞（圖S7D），當暴露于髓鞘后究孕，腫瘤細胞的增殖在巨噬細胞耗竭的ex vivo中減少了（圖S7E和S7F）啥酱。
7. 重要的是，通過重新引入巨噬細胞厨诸，可以挽救髓鞘對膠質(zhì)母細胞瘤癌細胞的脂毒性效應(yīng)镶殷，揭示了巨噬細胞在回收髓鞘碎片以保護并使腫瘤細胞受益中的重要性（圖S7F）。
8. 通過追蹤共培養(yǎng)中加載了可點擊膽固醇的BMDM中的脂質(zhì)命運（圖S7G）微酬，我們發(fā)現(xiàn)直接轉(zhuǎn)移發(fā)生在MES樣而不是OPC樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞中（圖6C）绘趋。
9. 為了探究腫瘤細胞是否清除LLM介導(dǎo)的髓鞘回收產(chǎn)生的脂質(zhì)，我們設(shè)計了一個多組學(xué)共培養(yǎng)實驗颗管，在不同條件的髓鞘暴露下陷遮，隨后對FACS純化的膠質(zhì)母細胞瘤癌細胞進行定量脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（圖S7H）。
10. 在單培養(yǎng)中垦江，暴露于髓鞘的MES樣細胞并未顯示脂質(zhì)含量改變（圖6D）帽馋，這與它們無法吞噬髓鞘碎片的能力相符（圖S7D）。
11. 然而比吭，在這種條件下绽族，與細胞應(yīng)激相關(guān)的過程被上調(diào)，而與增殖相關(guān)的途徑被降低（圖S7I和S7J）梗逮，強調(diào)了髓鞘對腫瘤細胞的脂毒性特征（圖S7F项秉；表S6A和S6B）。
12. 特別地慷彤，當與巨噬細胞共培養(yǎng)并在髓鞘存在下寥院，多種脂質(zhì)類別逐漸在MES樣腫瘤細胞中積累，包括膽固醇和甘油三酯（TGs）（圖6D和6E）身腻。
13. 在轉(zhuǎn)錄上二拐，MES樣腫瘤細胞上調(diào)了多種參與增殖和細胞周期的途徑（圖S8A和S8B；表S6C-S6F）。
14. 總的來說，這些分析揭示了TAM/癌細胞相互作用的分子機制，通過這些機制哗蜈，LLM處理的髓鞘衍生的脂質(zhì)促進腫瘤生長。

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• 圖S7：在鼠腫瘤中保存的人間充質(zhì)膠質(zhì)母細胞瘤代謝特性坠韩，這是MES樣腫瘤細胞外包脂質(zhì)需求的底層距潘，與圖6相關(guān)（A）點圖顯示在鼠單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集中識別的最豐富細胞類型中從頭合成膽固醇生物合成基因的表達水平（圖1B）。顏色代表平均表達只搁；大小表示表達每個特定基因的細胞百分比音比。（B）點圖顯示在患者單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集中識別的膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型中從頭合成膽固醇生物合成和導(dǎo)入基因的表達水平。點顏色代表平均表達氢惋；大小表示表達每個特定基因的細胞百分比洞翩。（C）雷達圖描繪了從患者單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集中提取的OPC、MES焰望、NPC和AC膠質(zhì)母細胞瘤癌細胞之間表示的代謝途徑（KEGG）的標準化GSEA評分（基于每個途徑在0到1之間）骚亿。灰色區(qū)域代表所有腫瘤細胞中每個代謝途徑的平均活性熊赖。（D）圖表顯示BMDMs或OPC樣和MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞中CFSE標記的髓鞘攝取的MFI来屠。（E）ex vivo實驗的示意圖，用于EdU和Annexin V染色秫舌，如圖F及圖6K和S8G-S8I所示的妖。從PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤荷瘤小鼠中提取原發(fā)腫瘤绣檬，并在磁珠介導(dǎo)的髓鞘去除和/或CD11b+細胞耗竭之前分離成單細胞足陨。然后將分離的腫瘤放置在培養(yǎng)中24小時，更換培養(yǎng)基以去除細胞碎片娇未，并在指定時加入LXRi墨缘、ABCA1i或BMDMs。腫瘤細胞增殖（EdU染色）或活力（Annexin V-零抬，Zombie-）在48小時后通過流式細胞術(shù)評估镊讼。（F）直方圖顯示與無CD11b+ Abca1/Abcg1KO BMDMs±髓鞘的腫瘤細胞相比，S期（EdU+）腫瘤細胞的倍數(shù)變化平夜。培養(yǎng)條件在（E）中描述蝶棋。（G）體外LLM/膠質(zhì)母細胞瘤細胞共培養(yǎng)實驗設(shè)計的示意圖：如前所述（圖S5K），在OPC樣或MES樣TCM中培養(yǎng)的BMDMs過夜暴露于（1）可點擊的膽固醇或（2）髓鞘3小時忽妒，并與膠質(zhì)母細胞瘤細胞共培養(yǎng)玩裙。（1）通過流式細胞術(shù)測量BMDMs向膠質(zhì)母細胞瘤細胞轉(zhuǎn)移膽固醇的攝取/轉(zhuǎn)移兼贸，在共培養(yǎng)0、1和3小時后進行Click-iT反應(yīng)（見STAR Methods）吃溅。（2）共培養(yǎng)48小時后（EdU染色）通過流式細胞術(shù)測量膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖溶诞。（H）體外LLM/MES樣膠質(zhì)母細胞瘤癌細胞共培養(yǎng)設(shè)計示意圖，研究巨噬細胞介導(dǎo)的髓鞘回收對腫瘤細胞脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)錄組的影響：在添加BMDMs（或不添加）進行共培養(yǎng)之前决侈，MES樣腫瘤細胞在2%無脂質(zhì)FBS DMEM中生長螺垢。24小時后，根據(jù)需要在MES樣腫瘤細胞和BMDMs FACS分離之前添加髓鞘不同的持續(xù)時間（0赖歌、6或24小時）枉圃，然后進行下游批量RNA測序或脂質(zhì)組學(xué)分析（見STAR Methods）。（I）火山圖顯示MES樣腫瘤細胞在髓鞘碎片中培養(yǎng)24小時或未培養(yǎng)的差異性表達基因庐冯。顏色對應(yīng)于顯著增加（紅色）或減少（藍色）的基因讯蒲。通過如圖H所示的FACS純化的MES樣腫瘤細胞的批量RNA測序識別基因。（J）條形圖顯示MES樣腫瘤細胞在單培養(yǎng)中對髓鞘暴露做出反應(yīng)時肄扎，與基因下調(diào)（藍色）或上調(diào)（紅色）相關(guān)的相關(guān)途徑的調(diào)整p值墨林。統(tǒng)計方法：單向ANOVA（D）或雙向ANOVA與Sídák校正進行多次比較（F）或Fisher精確檢驗結(jié)合Benjamini-Hochberg方法進行多假設(shè)檢驗校正（J）。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM（D和F）

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• 圖6. LLM介導(dǎo)的脂質(zhì)輸出為脂質(zhì)匱乏的膠質(zhì)母細胞瘤TME中的MES樣細胞惡行提供燃料（A）來自小鼠單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集的膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型中的歸一化GSEA評分犯祠⌒竦龋灰色區(qū)域=每個通路的平均代謝活動。（B）來自小鼠單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集的膠質(zhì)母細胞瘤細胞亞型中的膽固醇生物合成和導(dǎo)入基因的表達水平衡载。（C）膽固醇含量在膠質(zhì)母細胞瘤細胞與預(yù)先加載了可點擊膽固醇的BMDMs共培養(yǎng)后的流式細胞術(shù)MFI量化搔耕。（D）在MES樣腫瘤細胞與TAMs+髓鞘共培養(yǎng)或單培養(yǎng)中，與無髓鞘比較痰娱，描繪的脂質(zhì)類別的倍數(shù)表達變化（x軸）和-log10 p值（y軸）弃榨。（E）MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞在單培養(yǎng)或與BMDMs共培養(yǎng)暴露于髓鞘時的膽固醇和甘油三酯（TG）水平。（F）在MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞中梨睁，基于脂質(zhì)ng/μg蛋白的標記13C在各可量化脂質(zhì)類別中的相對分布鲸睛，在給予CE13C-FA后24小時。（G）在檢測到U13C-FA18:1的脂質(zhì)種類中坡贺，每種脂質(zhì)種類代謝的CE13C-FA的量化官辈。（H）在與TCM處理的BMDMs±髓鞘共培養(yǎng)48小時后，膠質(zhì)母細胞瘤細胞在S期（EdU+）的百分比遍坟。（I）電子顯微鏡代表圖像拳亿，描繪MES樣腫瘤細胞（T）與載有髓鞘的BMDMs（M）之間的接觸點。LD愿伴，脂滴肺魁；CV，涂層囊泡隔节；MD鹅经，髓鞘碎片胡桨。（J）在與TCM處理的BMDMs±髓鞘，±CD36抑制劑（SSO）±ABCA1抑制劑valspodar（ABCA1i）共培養(yǎng)48小時后瞬雹，MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞在S期（EdU+）的百分比昧谊。（K）在分離的膠質(zhì)母細胞瘤中，維持（+CD11b+）或體外耗竭（-CD11b+）（圖S7E）±ABCA1i或LXR抑制劑GSK2033（LXRi）的情況下酗捌，活膠質(zhì)母細胞瘤細胞（ZombieNIR-呢诬，Annexin V-）占總腫瘤細胞的百分比。統(tǒng)計：雙向方差分析（C胖缤，E尚镰，H和K）和帶Sídák校正的混合效應(yīng)分析進行多重比較（J）。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（C哪廓，E狗唉，G，H涡真，J和K）分俯。另見圖S7和S8及表S6。

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• 圖S8哆料。關(guān)于巨噬細胞介導(dǎo)的髓鞘回收在保護腫瘤細胞免受脂毒性侵害以及以LXR-Abca1/Abcg1依賴方式為MES樣細胞供能的擴展分析缸剪，與圖6相關(guān)（A）維恩圖描繪了在與BMDMs共培養(yǎng)的MES樣腫瘤細胞中，在無（對照）或存在髓鞘碎片（+髓鞘碎片）的情況下东亦，與單培養(yǎng)的MES樣腫瘤細胞相比差異表達的基因（表S6）杏节。基因通過圖S7H所述的FACS純化的MES樣腫瘤細胞的批量RNA-seq確定典阵。（B）條形圖描繪了MES樣腫瘤細胞與BMDMs（±髓鞘碎片）共培養(yǎng)時奋渔，與單培養(yǎng)的MES樣腫瘤細胞相比下調(diào)（左）和上調(diào)（右）的通路p值（圖S7H）。（C）代表性IF圖像壮啊，顯示了MES樣腫瘤細胞在不同時間點（添加Click-CE后的0嫉鲸、8和24小時）暴露于含有膽固醇（左，黃色）或脂肪酸（右他巨，粉紅色）的膽固醇酯（CEs）充坑。（D）代表性流式細胞術(shù)繪圖，描述了EdU增殖分析的門控策略染突，其中EdU+細胞表示S期的細胞，如圖（E）辈灼、（F）和圖6H份企、6J所示。（E）圖表描繪了與預(yù)先暴露于髓鞘（3小時）或未暴露的TCM預(yù)處理的BMDMs共培養(yǎng)48小時后巡莹，處于S期（EdU+）的活膠質(zhì)母細胞瘤細胞的百分比司志。（F）圖表描繪了與野生型或Abca1/Abcg1 KO BMDMs共培養(yǎng)48小時后甜紫，在MES樣TCM±髓鞘（3小時）預(yù)先培養(yǎng)的MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞中S期（EdU+）細胞的百分比。（G）在體外實驗中骂远，將活膠質(zhì)母細胞瘤細胞（ZombieNIR?囚霸，Annexin V?）占總腫瘤細胞（CD45?CD11b?細胞）的百分比進行量化（圖S7E）。從攜帶腫瘤的小鼠中分離出PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤激才，并將其解離成單細胞拓型，在補充了富含脂質(zhì)的FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從解離的腫瘤中保持（+CD11b+）或耗盡（?CD11b+）髓樣細胞瘸恼，并加入ABCA1抑制劑valspodar（ABCA1i）或LXR抑制劑GSK2033（LXRi）劣挫。（H和I）在體外實驗中，將活膠質(zhì)母細胞瘤細胞（ZombieNIR?东帅，Annexin V?）占總腫瘤細胞（CD45?CD11b?細胞）的百分比進行量化（圖S7E）压固。從攜帶腫瘤的小鼠中分離出PDG-Ink4a膠質(zhì)母細胞瘤，并將其解離成單細胞靠闭，在補充了無脂質(zhì)FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)帐我。在將野生型或Abca1/Abcg1 KO BMDMs（預(yù)先暴露于髓鞘碎片或未暴露）添加到解離的腫瘤中之前，耗盡髓樣細胞（?CD11b+）±LXR抑制劑GSK2033（LXRi）愧膀。(I)中的未處理（無處理）對照組數(shù)據(jù)取自（H）焚刚。統(tǒng)計方法：Fisher精確檢驗與Benjamini-Hochberg方法結(jié)合用于多重假設(shè)檢驗校正（B），兩因素ANOVA與Sídák校正用于多重比較（E和G-I）扇调，或混合效應(yīng)分析配合Tukey校正用于多重比較（F）矿咕。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（E-I）

Para_01

1. 巨噬細胞主要運輸膽固醇的酯化形式，這促使我們追蹤膽固醇/膽固醇酯在類似間充質(zhì)腫瘤細胞內(nèi)的整合狼钮，使用帶有可點擊手柄的膽固醇酯碳柱，這種手柄要么位于膽固醇組分上，要么位于脂肪酸鏈上熬芜。值得注意的是莲镣，膽固醇早期就定位在類似脂質(zhì)滴的結(jié)構(gòu)中，除了在24小時后明顯整合到膜狀結(jié)構(gòu)中外（圖S8C）涎拉。與之不同的是瑞侮，脂肪酸最初彌漫分布，這表明它們整合進入了細胞質(zhì)鼓拧，而隨著時間的推移半火，脂肪酸在脂質(zhì)滴中積累（圖S8C）。另外季俩，我們使用均勻標記的油酸（U13C-FA18:1）作為膽固醇油酸酯（CE13C-FA）中脂肪酸組的碳追蹤劑钮糖，結(jié)果表明U13C-FA18:1在類似間充質(zhì)癌細胞中整合后大部分未發(fā)生代謝，既沒有延長也沒有縮短（圖6F）酌住。油醯旯椋基卡尼脱质恪（CAR 18:1）的微標記，這是將U13C-FA18:1導(dǎo)向線粒體代謝所必需的中間體消痛，以及三羧酸循環(huán)中間體檸檬酸且叁、蘋果酸和天冬氨酸的未檢測標記，表明CE衍生的脂肪酸并未整合進入三羧酸循環(huán)進行脂肪酸氧化或能量生產(chǎn)（圖6F）秩伞。相反逞带，代謝的CE13C-FA衍生的脂肪酸被整合進入磷脂（主要是磷脂酰膽堿[PCs]）（圖6G），這表明它們作為細胞膜構(gòu)建塊的角色稠歉，與基于點擊化學(xué)的免疫熒光染色結(jié)果一致（圖S8C）掰担。總的來說怒炸，這些結(jié)果表明带饱，通過代謝髓鞘，LLMs不僅保護癌細胞免受脂毒性阅羹，而且還積極為它們提供髓鞘衍生的甾醇和脂肪酸勺疼，這些物質(zhì)要么被儲存，要么作為細胞膜生物合成的構(gòu)建塊被使用捏鱼。

Para_02

1. 我們接下來研究了LLM將髓鞘來源的脂質(zhì)直接轉(zhuǎn)移給膠質(zhì)母細胞瘤MES樣細胞的功能后果执庐。
2. 在共培養(yǎng)中，負載髓鞘的BMDMs以細胞-細胞接觸依賴的方式增強了MES樣細胞的增殖（圖6H和S8D）导梆。
3. 細胞-細胞接觸的需求進一步得到了電子顯微鏡成像的支持轨淌，揭示了BMDMs與MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞之間的緊密相互作用，以及兩種細胞類型之間包被囊泡的釋放/攝瓤茨帷（圖6I）递鹉。
4. 這些結(jié)果表明，腫瘤細胞對LLM來源的髓鞘脂質(zhì)的攝取既涉及被動機制也涉及主動機制藏斩。
5. 實際上躏结，通過藥物抑制脂肪受體CD36或脂肪出口蛋白ABCA1，兩者在LLM中上調(diào)（圖3I和S6I）并受LXR途徑調(diào)控狰域，取消了LLM賦予MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞的促增殖效應(yīng)（圖6J）媳拴。
6. 這些結(jié)果使用從LysM-Cre Abca1/Abcg1fl/fl小鼠中分離的BMDMs進行了遺傳驗證（圖S8F）。

Para_03

1. 有趣的是兆览，抑制ABCA1或LXR可以顯著降低ex vivo腫瘤細胞活力屈溉，尤其是在脂質(zhì)自由培養(yǎng)基共培養(yǎng)的條件下，這種條件下腫瘤細胞在攝取髓鞘后依賴LLM供應(yīng)的脂質(zhì)（圖6K和S8G）拓颓。
2. 這些結(jié)果顯示语婴，LXR和ABCA1阻斷對腫瘤細胞生長的抑制依賴于LLM和腫瘤細胞之間的脂質(zhì)交換，因為這些抑制劑并未阻礙脂質(zhì)豐富培養(yǎng)基或缺乏巨噬細胞時膠質(zhì)母細胞瘤細胞的活力驶睦。
3. 這一機制在使用LysM-Cre Abca1/Abcg1fl/fl巨噬細胞的ex vivo共培養(yǎng)中進一步得到驗證砰左，證實了LLM對MES樣癌細胞增殖促進作用依賴于Abca1/Abcg1和LXR（圖S8H和S8I）。
4. 總的來說场航，這些發(fā)現(xiàn)揭示了LLM和MES樣腫瘤細胞之間的共生關(guān)系缠导，其中膠質(zhì)母細胞瘤細胞通過促進其脂質(zhì)攝取能力來指導(dǎo)LLM的形成。
5. 反過來溉痢，負載髓鞘的LLM通過ABCA1介導(dǎo)的膽固醇/膽固醇酯流出和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移來促進MES樣膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖僻造。
6. 因此，阻止LLM向膠質(zhì)母細胞瘤細胞轉(zhuǎn)移脂質(zhì)可以抑制LLM的促腫瘤生成作用孩饼。

LLMs predict glioblastoma survival and response to immunotherapy

LLMs 預(yù)測膠質(zhì)母細胞瘤生存期和對免疫治療的反應(yīng)

Para_01

1. 為了評估我們發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化潛力髓削，我們使用癌癥基因組圖譜（TCGA）和膠質(zhì)瘤縱向分析（GLASS）聯(lián)盟數(shù)據(jù)集，研究了LLM標志物的預(yù)后價值（圖1I）镀娶。
2. 我們將原發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤樣本分為LLMlow和LLMhigh組立膛，并確定LLMhigh患者的預(yù)后明顯更差（圖7A）。
3. 如預(yù)期的那樣梯码，包含在LLMhigh標志物組中的大多數(shù)膠質(zhì)母細胞瘤樣本被歸類為MES富集（圖7B-7E）宝泵。
4. 然而，當從這些分析中排除MES腫瘤時轩娶，膠質(zhì)母細胞瘤患者的LLMhigh分類仍與生存期縮短相關(guān)（圖7F）儿奶。
5. 總的來說，這些數(shù)據(jù)強調(diào)了LLM作為診斷和分類工具的潛力鳄抒，最終可能適用于將膠質(zhì)母細胞瘤患者分層為個性化治療方法的策略闯捎。

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• 圖 7.富含脂質(zhì)的巨噬細胞預(yù)測患者的臨床結(jié)果( A )根據(jù)原發(fā)性異檸檬酸脫氫酶野生型( IDHWT )膠質(zhì)母細胞瘤患者中低、高 LLM 標志物富集將膠質(zhì)母細胞瘤患者 54 , 55 分層 的 Kaplan-Meier 曲線许溅。 ( B 和 C )盒須圖描繪了所有 IDHWT 膠質(zhì)母細胞瘤樣本的單樣本 (ss) GSEA 評分瓤鼻，根據(jù)它們的主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄亞型 (CL，經(jīng)典型闹司； MES娱仔，間充質(zhì)型； PN游桩，前神經(jīng)型) 在 ( B ) TCGA 54 和 ( C ) GLASS 數(shù)據(jù)集中進行分類牲迫。 55 ( D 和 E )基于 ssGSEA 評分將原發(fā)性 IDHWT 膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤分為低 / 高 LLM 富集評分的熱圖。 ( F )在排除間充質(zhì)膠質(zhì)母細胞瘤的情況下借卧，根據(jù)低盹憎、高 LLM 標志物富集對原發(fā)性 IDHWT 膠質(zhì)母細胞瘤患者進行分層的 Kaplan-Meier 曲線。 ( G )左圖：泛癌癥 TAM 分析的示意圖铐刘。 5,19,56 右圖：小提琴圖顯示了 TAMs 中 LLM 標志物評分的平均值陪每。 ( H )未經(jīng)治療、復(fù)發(fā)性以及新輔助抗 PD-1 治療的膠質(zhì)母細胞瘤患者樣本的單細胞 RNA-seq 數(shù)據(jù)集中 LLMs 的百分比。 57 ( I )在接受 ICB 治療之前檩禾，響應(yīng)者和非響應(yīng)者黑色素瘤患者中非 LLM 或 LLM TAMs 的百分比挂签。 58 ( J )受試者工作特征曲線，比較腫瘤突變負荷盼产、LLMs饵婆、非 LLMs 和總巨噬細胞占 CD45 +細胞的百分比預(yù)測黑色素瘤 ICB 反應(yīng)的價值。 統(tǒng)計分析： log-rank 檢驗 (A 和 F) 戏售，Kruskal-Wallis 檢驗和成對比較的 Wilcoxon 檢驗 (B 和 C) 侨核，單因素方差分析加 Sídák 多重比較校正 (H) ，雙尾配對 t 檢驗 (I) 或不成對雙尾引導(dǎo)檢驗 (J) 灌灾。 數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM (H 和 I) 搓译。

Para_01

1. 為了將LLMs的流行情況置于更廣泛的視角并評估這些細胞在不同癌癥類型范圍內(nèi)的意義，我們對pan-cancer骨髓細胞scRNA-seq中的LLM轉(zhuǎn)錄基因簽名表達進行了查詢锋喜。
2. 值得注意的是些己，富含LLM簽名的TAMs在膠質(zhì)母細胞瘤、肺癌和卵巢癌患者之間的比例差異很大跑芳，而黑色素瘤患者總體上LLMs水平較低轴总，盡管其中一部分表現(xiàn)出較高的LLM富集（圖7G）。
3. 鑒于LLMs的免疫抑制特征（圖3I和S1J）博个，我們評估了LLM簽名是否可以預(yù)測癌癥患者針對T細胞的免疫檢查點阻斷（ICB）反應(yīng)怀樟。
4. 在最近的一項臨床試驗中，新輔助性抗PD-1（程序性細胞死亡蛋白1）被納入可切除的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤治療中盆佣，并與輔助治療相比往堡，顯示出顯著的生存益處。
5. 我們查詢了接受此類治療的患者scRNA-seq數(shù)據(jù)集共耍，結(jié)果顯示虑灰，新輔助性抗PD-1治療的膠質(zhì)母細胞瘤與未經(jīng)治療的或復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤相比，TAM-LLMs的比例顯著降低（圖7H）痹兜。
6. 因此穆咐，我們假設(shè)膠質(zhì)母細胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)的LLMhigh轉(zhuǎn)錄簽名可能是其對抗ICB反應(yīng)差的原因，這一假設(shè)仍有待驗證字旭，因為尚無針對膠質(zhì)母細胞瘤患者的已建立的ICB應(yīng)答者和非應(yīng)答者數(shù)據(jù)集对湃。
7. 因此，我們查詢了公開可用的黑色素瘤患者免疫治療數(shù)據(jù)集遗淳，以評估LLM富集是否可以預(yù)測對ICB反應(yīng)良好的患者群體的治療效果拍柒。
8. 令人驚訝的是，LLMs的含量預(yù)測了黑色素瘤的治療反應(yīng)屈暗，而總的TAM水平則沒有（圖7I）拆讯。
9. 此外脂男，使用LLMs作為ICB反應(yīng)的生物標志物比總TAM含量或常用的腫瘤突變負擔（TMB）具有更高的預(yù)測價值（圖7J）。
10. 總的來說种呐，這些發(fā)現(xiàn)支持LLMs作為一種預(yù)測膠質(zhì)母細胞瘤患者生存和免疫治療反應(yīng)的細胞類型的相關(guān)性宰翅。

Discussion

Para_01

1. 組織駐留型和浸潤型巨噬細胞的多方面表型是由多種因素塑造的，包括它們所處的腫瘤微環(huán)境（TME）中的代謝景觀陕贮。
2. 在本研究中堕油，我們不僅描述了膠質(zhì)母細胞瘤TME的多組學(xué)特征潘飘，還揭示了腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）與癌細胞之間的復(fù)雜代謝交互肮之，這種交互依賴于對富含膽固醇的髓鞘碎片進行再循環(huán)。
3. 膠質(zhì)母細胞瘤細胞利用神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)功能為自己謀利卜录，例如通過神經(jīng)元擬態(tài)戈擒。
4. 同樣，我們提出艰毒，膠質(zhì)母細胞瘤細胞劫持并加劇了巨噬細胞在發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過程中協(xié)調(diào)脫髓鞘和再髓鞘的能力筐高。
5. 這是通過共謀促進吞噬髓鞘碎片的細胞通路來實現(xiàn)的，導(dǎo)致TAMs因長期暴露于髓鞘碎片而出現(xiàn)脂質(zhì)過載丑瞧。
6. 這種代謝相互作用有利于類MES膠質(zhì)母細胞瘤細胞柑土，TAMs攝取、回收和處理髓鞘產(chǎn)生自由可用脂質(zhì)的能力為它們的存活和增殖提供了燃料绊汹。
7. 值得注意的是稽屏，這種脂質(zhì)在骨髓細胞和癌細胞之間的交換已在前列腺癌和肺癌中觀察到。

Para_02

1. 鑒于循環(huán)膽固醇不能穿越血腦屏障西乖，并且大腦環(huán)境在代謝上是自主的狐榔，我們的數(shù)據(jù)顯示類似MES的膠質(zhì)母細胞瘤細胞高度依賴局部膽固醇代謝，因此需要利用寄居細胞的穩(wěn)態(tài)功能來發(fā)展成惡性腫瘤获雕。
2. 這種代謝交互在缺氧區(qū)域尤其豐富薄腻，那里是偏好利用外源性脂質(zhì)、而不是從頭合成脂質(zhì)的類似MES的脂質(zhì)營養(yǎng)缺陷型膠質(zhì)母細胞瘤細胞優(yōu)先歸巢的地方届案。
3. 復(fù)雜的膠質(zhì)母細胞瘤微環(huán)境是治療抵抗的基石庵楷，最終形成一個在復(fù)發(fā)性腫瘤中，尤其是MES腫瘤楣颠，動態(tài)適應(yīng)的腫瘤微環(huán)境尽纽。
4. 我們在這種背景下發(fā)現(xiàn)的LLMs富集提出了一個疑問，即它們是否是這種轉(zhuǎn)變的主要驅(qū)動因素球碉，指揮支持膠質(zhì)母細胞瘤治療后復(fù)發(fā)的適應(yīng)性機制蜓斧。

Para_03

1. LLMs表現(xiàn)出免疫抑制特征，并與對ICB的反應(yīng)呈負相關(guān)睁冬，支持LLMs積極參與膠質(zhì)母細胞瘤免疫抑制微環(huán)境的觀點挎春。
2. 這些發(fā)現(xiàn)與先前在多發(fā)性硬化癥中的研究一致看疙，顯示巨噬細胞中的髓鞘吞噬作用直接抑制T細胞增殖和神經(jīng)炎癥。
3. 然而令人驚訝的是直奋，對LLMs進行體內(nèi)靶向后能庆，并未在晚期腫瘤中引起淋巴細胞的頻率發(fā)生明顯變化。
4. 考慮到脂質(zhì)在免疫激活中的作用存在爭議脚线，仔細研究TAM介導(dǎo)的髓鞘回收對淋巴細胞功能的（間接）作用將是設(shè)計增強抗腫瘤反應(yīng)的聯(lián)合治療策略的關(guān)鍵搁胆。

Para_04

1. 總之，我們對膠質(zhì)母細胞瘤中一種促腫瘤發(fā)生的LLM亞群進行了深入的 功能分析邮绿，包括從研究它們的轉(zhuǎn)錄教育到染色質(zhì)改變渠旁，再到它們的重新配置的脂質(zhì)體。
2. 我們發(fā)現(xiàn)船逮，脂質(zhì)負載TAMs的促腫瘤功能主要是由過量 的顾腊、TME指導(dǎo)的髓鞘碎片攝取所驅(qū)動的。
3. LLMs在促進膠質(zhì)母細胞瘤惡性中的作用發(fā)現(xiàn)挖胃，需要對 TAM亞群中獲得特定促腫瘤功能的代謝共進化過程進行更有效的策略研究杂靶。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_05

1. 本研究確定了巨噬細胞介導(dǎo)的髓鞘回收是膠質(zhì)母細胞瘤中其促腫瘤表型的機制之一，主要關(guān)注膽固醇和脂肪酸在這一過程中的作用酱鸭。
2. 然而吗垮，髓鞘由一系列脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，這些成分也可能影響巨噬細胞的表型和功能凹髓。
3. 進一步實驗聚焦于髓鞘回收和轉(zhuǎn)移的確切機制烁登，對于定義脂質(zhì)負荷表型的其他重要調(diào)節(jié)因子將是非常重要的。
4. 另外扁誓，在體外或離體模擬巨噬細胞與類似MES的腫瘤細胞之間的代謝交叉對話防泵，可能無法完全捕捉到腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，其中多個變量蝗敢，如氧氣和營養(yǎng)的可利用性捷泞，極大地影響細胞間的相互作用。

STAR★Methods

Key resources table

關(guān)鍵資源表

Resource availability

資源可用性

Lead contact

主要聯(lián)系人

Para_01

1. 進一步的信息和資源及試劑的請求應(yīng)直接聯(lián)系負責人Leila Akkari（l.akkari@nki.nl）寿谴，并由其負責滿足需求锁右。

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究中使用的材料和試劑列于關(guān)鍵資源表中。
2. 本研究中或之前研究中我們實驗室生成的試劑可應(yīng)要求提供讶泰。
3. 擴展的圖例說明已在https://github.com/djkloosterman/Kloosterman_et_al_Cell_2024上提供咏瑟。

Data and code availability

數(shù)據(jù)和代碼的可獲得性

Para_01

• 本研究中生成的數(shù)據(jù)使用小鼠參考基因組mm10進行了比對，并存儲在GSE266149中痪署。本研究中使用的膠質(zhì)母細胞瘤生態(tài)位和亞型元模塊基因列表可從Ivy膠質(zhì)母細胞瘤圖譜項目（GAP）或Neftel等人獲嚷肱ⅰ（表S2）。膠質(zhì)母細胞瘤患者的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集由麥吉爾大學(xué)的Kevin Petrecca博士友情提供狼犯。本研究中使用的公開可用的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集余寥，包括髓系細胞圖譜领铐、黑色素瘤治療相關(guān)數(shù)據(jù)集以及膠質(zhì)母細胞瘤患者對新輔助aPD157的反應(yīng)，可分別從GEO獲人蜗稀：GSE154763绪撵、GSE120575和GSE154795。TCGA膠質(zhì)母細胞瘤數(shù)據(jù)從http://gdac.broadinstitute.org/獲取祝蝠，使用UCSCXenaTools包音诈。原始計數(shù)使用EdgeR進行處理。GLASS數(shù)據(jù)集從https://www.synapse.org/#!Synapse:syn17038081/wiki/585622下載绎狭，其中選擇了膠質(zhì)母細胞瘤和IDH野生型患者细溅。

• 原始的小鼠單細胞RNA測序和Visium空間轉(zhuǎn)錄組分析代碼可訪問https://github.com/djkloosterman/Kloosterman_et_al_Cell_2024獲取。

• 本文報告數(shù)據(jù)的重新分析所需的任何額外信息坟岔，可應(yīng)要求向主要聯(lián)系人索取谒兄。