特殊用途載體

載體（Vectors）DNA：　1）獨(dú)立的一個(gè)包括啟動(dòng)子（promoter)、編碼區(qū)（encoding region)和終止子（terminator)的基因汉匙，or 組成基因的某個(gè)元件镜盯，一般是不可以進(jìn)入受體細(xì)胞的别凤；　2）采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后似嗤，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。所以泉褐，通過(guò)不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細(xì)胞赐写，并在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。

載體（Vectors）定義：在基因工程操作中膜赃，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體挺邀。

多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記pUCMCSAmpr運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2、為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3跳座、為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件

載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件

目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞端铛，并在其中維持高效表達(dá)，在很大程度上決定于載體疲眷。

基因工程對(duì)載體的要求（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制禾蚕，ori。（2）有選擇性標(biāo)記Ampr狂丝、Tetr换淆、Kanr等。

（3）多克隆位點(diǎn)：外源基因插入的單一限制酶位點(diǎn)几颜。（4）分子量小倍试，可容納較大的外源基因片段。（5）拷貝數(shù)多蛋哭，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增县习。外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制且切點(diǎn)是單一的，這樣可將多個(gè)外源DNA 片段插入其中具壮。避免基因的非控制性擴(kuò)散准颓。（6）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性哈蝇。（7）具有較好的安全性棺妓，不能任意轉(zhuǎn)移。

大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322結(jié)構(gòu)圖克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)遺傳標(biāo)記基因復(fù)制起點(diǎn)?

載體的種類按功能分類克隆載體克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體把一個(gè)基因插入到染色體組中

表達(dá)載體　用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)　整合載體　把一個(gè)基因插入到染色體組中按來(lái)源分類　質(zhì)粒載體　噬菌體載體　柯斯質(zhì)粒載體　人工染色體載體00?

載體的種類和特征質(zhì)粒*?受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli?環(huán)狀＜8kb pUC18/19 , T-載體等λ噬菌體線狀

EMBL系列炮赦，λ gt系列絲狀噬菌體及噬菌粒＜10 kbM13mp系列粘粒載體35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCVBAC (Bacterial Artificial Chromosome)≈300 kbPel oBAC系列YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細(xì)胞線性染色體kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細(xì)胞＞1000 kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞SV40 載體怜跑，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體和細(xì)菌pSVK3質(zhì)粒，PBV, Ti質(zhì)粒

第一節(jié)克隆載體1.?質(zhì)粒載體（plasimid vectors）2.?噬菌體載體（phage vectors）

第一節(jié)克隆載體1. 質(zhì)粒載體（plasimid vectors）2. 噬菌體載體（phage vectors）3. 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）4. 人工染色體載體（B/Y/HAC）

質(zhì)粒的生物學(xué)特性（1）質(zhì)粒的概念的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子吠勘，比病毒更簡(jiǎn)單性芬。

質(zhì)粒是一種廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主的復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡(jiǎn)單剧防。并不是寄主生長(zhǎng)所必需的植锉，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）。

（2）質(zhì)粒的大小差異很大峭拘，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子俊庇，最大的達(dá)到200kb狮暑。質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中“友好”地“借居”，它可以賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀辉饱，以利于寄主的生存搬男。比如，對(duì)抗菌素的抗性彭沼，對(duì)重金屬的抗性等缔逛。（3）質(zhì)粒的生存

嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringent plasmid）(拷貝數(shù)少，為1-5個(gè))?

（4）質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制姓惑。質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系褐奴。根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)镣σ妫可分為兩大復(fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringent plasmid）(拷貝數(shù)少歉糜，為1-5個(gè))松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxed）(拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝)因此望众，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的匪补。

（5）質(zhì)粒的不相容性兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性。具有不相容性的質(zhì)粒組成的群體稱為不相容群烂翰，一般具有相同的復(fù)制子夯缺。

（6）質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)甘耿，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物踊兜。Conjugative plasmid 接合型質(zhì)粒（自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒）：質(zhì)粒可從一個(gè)細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞佳恬。Non Conjugative plasmid 非接合型質(zhì)粒（不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒）：由于失去控制細(xì)菌配對(duì)和自我轉(zhuǎn)移的基因捏境，質(zhì)粒不能從一個(gè)細(xì)胞自發(fā)的轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞』俅校基因工程一般只能利用非接接合型質(zhì)粒垫言，保證分子操作過(guò)程中質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。

Tra protein from conjugative plasmid

bom siteMob genemob mRNAMob proteinopenrecipient cellhelper plasmid即mob基因的產(chǎn)物可打開(kāi)非接合質(zhì)粒的bom 位點(diǎn)(oriT位點(diǎn))倾剿，借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物筷频，使非接合質(zhì)粒被動(dòng)遷移到受體細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用(mobilization)前痘。

質(zhì)粒DNA的tra基因　E.Coli產(chǎn)生菌毛　宿主與受體細(xì)胞結(jié)合　遺傳物在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移（指令）（遷移）大腸桿菌接合（conjunction）

（7）攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因凛捏，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素芹缔、重金屬離子坯癣、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素最欠、細(xì)菌毒素示罗、有機(jī)堿　這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義

遺傳標(biāo)記基因定義:在基因工程中使用與選擇重組體DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因1. 指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞2. 指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子標(biāo)記基因的作用

標(biāo)記基因的種類1.?抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a. 抗生素抗性基因: Apr 蓬网，Tcr ，Cmr鹉勒，Kanr帆锋，G418r，Hygr 禽额，Neorb. 重金屬抗性基因: Cur 锯厢，Znr ，Cdrc. 代謝抗性基因: TK脯倒，抗除草劑基因2. 營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是參與氨基酸实辑，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁藻丢，如TRP1剪撬，URA3，LEU2，HIS4等。3. 生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)苫亦，如lacZ，GUS梨水，CAT4. 噬菌斑

1.四環(huán)素抗性基因（Tcr）Tetracycline 可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過(guò)程茵臭。四環(huán)素抗性基因編碼一種399 AAs蛋白質(zhì)疫诽，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞旦委。2.氨芐青霉素抗性基因（Apr）Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性奇徒。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化β-內(nèi)酰胺環(huán)的水解缨硝，使氨芐青霉素失活摩钙。3. 氯霉素抗性基因（Cmr）Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50 S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成追葡。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶腺律，使氯霉素乙蹀榷蹋化宜肉，導(dǎo)致乙酰化的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上翎碑。4. 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin谬返，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成日杈。來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使這類抗生素磷酸化遣铝，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)佑刷。20?

質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開(kāi)環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種酿炸。

（8）質(zhì)粒的存在形式質(zhì)粒的存在形式有超螺旋瘫絮、開(kāi)環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）開(kāi)環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）

質(zhì)撂钏叮空間構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同麦萤，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、l DNA次之扁眯、ocDNA最慢壮莹。OC L SC?

天然質(zhì)粒的局限性天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低姻檀、單一酶切位點(diǎn)少命满、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求绣版，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建胶台。

質(zhì)粒載體的命名原則人工組建的質(zhì)粒人工組建的質(zhì)粒的第一個(gè)字母是質(zhì)粒英文名字（plasmid）的第一個(gè)字符p，用小寫杂抽。p后有2個(gè)字母是大寫概作，表示質(zhì)粒的作者和實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號(hào)默怨。如pBR322讯榕，字母p代表質(zhì)粒，BR是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名匙睹，322代表…構(gòu)建的一系質(zhì)粒的編號(hào)愚屁。

質(zhì)粒載體的發(fā)展概況第一階段（1977年前）　天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322痕檬。第二階段　增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度）霎槐，建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體梦谜。第三階段　完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求丘跌，如M13mp系列載體，含T3唁桩，T7闭树，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體荒澡。

質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建基本策略1.加入合適的選擇標(biāo)記基因报辱，如兩個(gè)以上，易于選擇轉(zhuǎn)化體2.增加或減少合適的酶切位點(diǎn)单山，便于重組

3.縮短長(zhǎng)度碍现，提高導(dǎo)入效率幅疼，增加裝載量4.改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛昼接，變少拷貝為多拷貝5.根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件

1爽篷、選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒: Ori、選擇標(biāo)記慢睡、MCS

質(zhì)粒構(gòu)建原則1狼忱、選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒: Ori、選擇標(biāo)記一睁、MCS2钻弄、正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒載體的元件：酶切、PCR3者吁、組裝合適的選擇標(biāo)記基因4窘俺、選擇合適的啟動(dòng)子5、提高外源DNA的容量滅活一些有害基因复凳，比如與質(zhì)粒移動(dòng)有關(guān)的基因瘤泪，或影響質(zhì)粒復(fù)制的負(fù)調(diào)控基因等。6育八、需要滅活初始質(zhì)粒上的某些編碼基因7对途、達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過(guò)程應(yīng)力求簡(jiǎn)單

質(zhì)粒載體：作為基因工程載體髓棋，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制的起始區(qū)实檀、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)等部分按声。

質(zhì)粒載體的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000?擴(kuò)增基因

高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù) 擴(kuò)增基因　　低拷貝質(zhì)粒來(lái)自pSC101 拷貝數(shù)小于10 　表達(dá)某些毒性基因　　溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)膳犹、整合等不同性質(zhì)　　測(cè)序質(zhì)粒含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker　　整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)　便于外源基因的整合　　穿梭質(zhì)粒裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子　便于基因克隆　　表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯签则、純化的元件　　探針質(zhì)粒裝有報(bào)告基因　便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選

質(zhì)粒載體的分類（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1须床、pMB1、pMB9?松弛型質(zhì)粒渐裂。具有低分子量豺旬、高拷貝數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。

具有氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)：每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000－3000個(gè)柒凉！用途：適合大量增殖克隆基因族阅、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。

（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體（3）溫控的質(zhì)粒載體由pSC101派生來(lái)的載體扛拨。特點(diǎn)是拷貝數(shù)低耘分。pLG338举塔、pLG339等

適合于克隆含量過(guò)高對(duì)寄主代謝有害的基因绑警。減少蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害求泰。（3）溫控的質(zhì)粒載體一些低拷貝基因是溫度敏感型，如pBEU1计盒、pBEU2溫度低（<37 oC）渴频，拷貝數(shù)很少；溫度增加（>40 oC）北启，拷貝數(shù)很快增加到>1000個(gè)卜朗。

（4）插入失活型質(zhì)粒載體如pDF41、pDF42咕村、pBR322场钉。無(wú)抗生素抗性抗生素抗性

載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。外源DNA片段插入會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因（如tetr懈涛、ampr逛万、cmr等）失活。如pDF41批钠、pDF42宇植、pBR322。外源DNA無(wú)抗生素抗性抗生素抗性

質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型埋心。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)指郁。

（5）正選擇的質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)拷呆∠锌玻可大大降低需要篩選的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，從而減輕實(shí)驗(yàn)的工作量茬斧，提高了選擇的敏感性箫柳。通過(guò)選擇具這種表型特征的轉(zhuǎn)化子，便可大大降低需要篩選的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)啥供。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體悯恍。具有直接選擇記號(hào)并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型，直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞伙狐，提高了選擇的敏感性涮毫。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子贷屎、起始密碼罢防、終止密碼的閱讀正確。并能在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱為表達(dá)載體（expression vectors）唉侄。一種典型的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒載體（圖4-11）的主要組成部分咒吐，包括大腸桿菌的啟動(dòng)子及操縱全點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)恬叹、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因候生。

經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體pSC101質(zhì)粒載體天然質(zhì)粒，屬嚴(yán)緊型低拷貝質(zhì)粒绽昼。9.09 kb唯鸭。四環(huán)素抗性Tetr。

ColE1天然質(zhì)粒硅确，屬松弛型目溉、高拷貝質(zhì)粒，6.6Kb菱农。有氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)缭付，每個(gè)細(xì)胞拷貝

大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因（immE1）

選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因（immE1）colicin E1能殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌，形成噬菌斑循未。?colicin E1能殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌蛉腌，形成“噬菌斑”。?唯一的克隆位點(diǎn)EcoR I 正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部只厘±哟裕可以通過(guò)插入失活篩選。

③不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因

ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea + kil基因產(chǎn)物產(chǎn)生菌對(duì)細(xì)菌素有自身免疫性大腸桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素稱為大腸菌素(colicin),它除作用于某些型別的大腸桿菌外,還能作用于親緣關(guān)系相近的志賀菌羔味、沙門氏菌河咽、克雷伯氏菌和巴氏桿菌等。③不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因imm基因

EcoR I位于E1內(nèi)部赋元，插入外源DNA導(dǎo)致E1失活忘蟹，使受體菌不能合成E（ColE1-），但仍表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）搁凸。

唯一的克隆位點(diǎn)EcoR IEcoR I位于E1內(nèi)部媚值，插入外源DNA導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E（ColE1-）护糖，但仍表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）褥芒。Colicin E1外源DNA無(wú)Colicin用對(duì)外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作選擇，操作非常繁雜嫡良。

pBR322：人工構(gòu)建載體p:質(zhì)粒锰扶；BR：質(zhì)粒兩位主要構(gòu)建者姓氏的第一個(gè)字母；322：實(shí)驗(yàn)編號(hào)三個(gè)親本質(zhì)粒：

pSF2124pMB1pSC101三個(gè)親本質(zhì)粒：pMB1:出發(fā)質(zhì)粒(ColE1)pSF2124: AmprpSC101: Tetr把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段寝受，換上合用的表達(dá)組件坷牛，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA很澄，堿基序列已經(jīng)全部清楚京闰。許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成颜及。可見(jiàn)其原型質(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn)蹂楣。

3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活9個(gè)導(dǎo)致Tetr基因失活氨芐青霉素和四環(huán)素抗性24個(gè)單一克隆位點(diǎn)俏站。

pBR322的優(yōu)點(diǎn)①雙抗生素抗性選擇標(biāo)記抗生素抗性基因的插入失活效應(yīng)是檢測(cè)重組體質(zhì)粒的有效方法，分兩次先后選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞?在Amp或Tet中都死亡捐迫。獲得重組載體的寄主細(xì)胞?在Amp或Tet其中之一中死亡乾翔。

不含質(zhì)粒載體含有空質(zhì)粒載體含有重組質(zhì)粒載體AmpAmp＋Tet

pBR322重組克隆的篩選重組克隆的“插入失活”篩選方法　　pBR322—→插入在Tetr中爱葵，基因型為Tets 施戴、Ampr——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)萌丈；　　pBR322—→插入在Ampr中赞哗，基因型為Tetr 、Amps辆雾、——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)肪笋，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長(zhǎng)；　而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)的是非重組型度迂。這種在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源DNA片段藤乙，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活。

②分子小惭墓，克隆能力大③高拷貝數(shù)④安全⑤具有較多的單一酶切位點(diǎn)（24種）

長(zhǎng)度4363bp坛梁，易于純化，可以攜帶6-8Kb的外源DNA片段腊凶。③高拷貝數(shù)氯霉素?cái)U(kuò)增之后划咐，每個(gè)細(xì)胞可1000~3000copies④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移钧萍。載體越小越好褐缠。>10kb的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂。缺失流動(dòng)基因（mob）风瘦。這樣队魏，質(zhì)粒就不會(huì)從一個(gè)細(xì)菌接觸轉(zhuǎn)移到⑤具有較多的單一酶切位點(diǎn)（24種）

pBR322的缺點(diǎn)保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)。能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別万搔，如果再有F質(zhì)粒的參與器躏，就有可能轉(zhuǎn)移！

PBR322的改進(jìn)①刪除mob識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pBR327蟹略、pAT153等）登失。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識(shí)別位點(diǎn)挖炬，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)揽浙。

②改造EcoR I 位點(diǎn)pBR325：使EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。在pBR322位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn)馅巷。

pUC系列載體在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成膛虫。屬正選擇載體。pUC7钓猬、pUC8稍刀、pUC9、pUC10敞曹、pUC11账月、pUC18、pUC19

加入一個(gè)在5端帶有10個(gè)多克隆位點(diǎn)的基因lacZ’

（1）元件來(lái)源a .ori來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)b.?標(biāo)記基因（ampr）:pBR322的Ampr基因

Lacz基因編碼的半乳糖苷酶是四聚體澳迫。Lacz’基因含有l(wèi)acz基因的前59個(gè)密碼子局齿，a序列，編碼a肽橄登。c. lacz’基因：大腸桿菌lac操縱子DNA區(qū)段抓歼，編碼β-半乳糖苷酶a-肽鏈，是LacZ氨基端的一個(gè)片段.載體用于可編碼半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞拢锹。d. MCS 多克隆位點(diǎn)谣妻。

（2）克隆位點(diǎn)具有MCS（多克隆位點(diǎn)）區(qū)段：位于lacZ’基因的5’端。10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)卒稳，但它不破壞該基因功能蹋半。

有mcs的存在，lacz’基因仍然能編碼a肽展哭。如果外源基因插入此mcs區(qū)湃窍，該基因失活。

x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷匪傍，為生色底物您市，半乳糖苷酶+ x-gal?藍(lán)色

菌落藍(lán)白選擇的原理：IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，乳糖類似物役衡，又稱為安慰誘導(dǎo)物茵休，可代替乳糖誘導(dǎo)乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，即可誘導(dǎo)lacz’所編碼的半乳糖苷酶氨基末端片段（α－肽）的合成手蝎。x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷榕莺，為生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal藍(lán)色x－gal水解后呈現(xiàn)藍(lán)色

α-互補(bǔ)：pUC類載體帶有l(wèi)acz’基因棵介，編碼半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽）钉鸯，此片段與宿主細(xì)胞所編碼的羧基端半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，形成有功能的半乳糖苷酶邮辽，稱α-互補(bǔ)唠雕。

α-互補(bǔ)（α-complementation）α-互補(bǔ)是指lacZ 基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase 贸营，由1024 個(gè)氨基酸組成）陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。α-互補(bǔ)是基于在兩個(gè)不同的缺陷β-半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的岩睁。大腸桿菌的乳糖lac 操縱子中的lacZ 基因編碼β-半乳糖苷酶钞脂，如果lacZ 基因發(fā)生突變，則不能合成有活性的β-半乳糖苷酶捕儒。例如冰啃，lacZ△M15 基因是缺失了編碼β-半乳糖苷酶中第個(gè)氨基酸的lacZ 基因，無(wú)酶學(xué)活性刘莹。對(duì)于只編碼N-端140 個(gè)氨基酸的lacZ 基因（稱為lacZ'）阎毅，其產(chǎn)物也沒(méi)有酶學(xué)活性。但這兩個(gè)無(wú)酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)栋猖，可恢復(fù)β-半乳糖苷酶的活性净薛，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)汪榔。

菌落藍(lán)白斑選擇的原理：在基因克隆時(shí)蒲拉，細(xì)菌在含有IPTG和x－gal的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒的lacz’基因產(chǎn)生α-肽痴腌，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶的羧基端片段雌团。兩種片段形成有功能的半乳糖苷酶，從而使x－gal水解士聪，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)锦援，使非重組菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)外源基因插到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后剥悟，使lacz’失活灵寺，不能表達(dá)α-肽，破壞了互補(bǔ)作用区岗，細(xì)胞內(nèi)無(wú)有活性半乳糖苷酶略板，使帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。

互補(bǔ)顯色反應(yīng)?

a?具有更小的相對(duì)分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)慈缔，平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)500-700個(gè)拷貝

PUC載體的優(yōu)點(diǎn)：a 具有更小的相對(duì)分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)叮称，平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)個(gè)拷貝b 具有MCS片段，可把具有兩種不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC類載體上藐鹤。2.6kbc 可以用組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體（藍(lán)白斑篩選）.

pGEM載體總長(zhǎng)度為2743bp?含有一個(gè)氨卞青霉素抗性編碼基因和一個(gè)lacZ’編碼基因

一段含有EcoR I瓤檐、Sat I、Kpn I娱节、Ava I挠蛉、Sma I、BamH I肄满、XbaI谴古、Sall绍移、AccI、Hinc I讥电、Pst II蹂窖、Sph I和Hind II等識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)。此序列結(jié)構(gòu)幾乎與pUC18克隆載體的完全一樣恩敌。

pGEM系列與pUC系列之間的主要差別pGEM具有兩個(gè)來(lái)自噬菌體的啟動(dòng)子瞬测，即T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異性的識(shí)別位點(diǎn)纠炮。由于這兩個(gè)啟動(dòng)子分別位于Lac z’基因中多克隆位點(diǎn)區(qū)的兩側(cè)月趟，故若在反應(yīng)體系中加入純化的識(shí)別T7或SP6啟動(dòng)子的RNA聚合酶，便可將已克隆的外源基因在體外轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA恢口。質(zhì)粒載體pGEM-3Z和pGEM-4Z在結(jié)構(gòu)上基本相似孝宗，兩者之間的差別僅僅在于SP6和T7這兩個(gè)啟動(dòng)子的位置互換、方向相反而已耕肩。pGEM 系列與pUC 系列之間的主要差別是因妇，它具有兩個(gè)來(lái)自噬菌體的啟動(dòng)子，即T7 啟動(dòng)子和SP6 啟動(dòng)子猿诸，它們?yōu)镽NA 聚合酶的附著提供特異性識(shí)別位點(diǎn)婚被。由于這兩個(gè)啟動(dòng)子分別位于lacZ‘ 基因中多克隆位點(diǎn)區(qū)的兩側(cè)，若在反應(yīng)體系中加入純化的T7 或SP6 RNA 聚合酶梳虽，便可以將已經(jīng)克隆的外源基因在體外轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA 址芯。質(zhì)粒載體pGEM-3Z 和pGEM-4Z 在結(jié)構(gòu)上基本相似，兩者之間的差別僅僅在于SP6 和T7 這兩個(gè)啟動(dòng)子的位置互換窜觉、方向相反而已谷炸。

pGEM-3Z：多拷貝裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’?裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子用于外源基因的高效表達(dá)

注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶禀挫，如：E.coli BL21（DE3）等

穿梭質(zhì)粒載體這種質(zhì)粒分子上含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因旬陡，因此能在兩種不同種屬的受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)，例如既能在原核生物中復(fù)制,又能在真核生物中復(fù)制的載體特咆。這類載體既具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因,還有真核生物的自主復(fù)制序列(ARS)以及選擇標(biāo)記性狀通常穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆,擴(kuò)增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表達(dá)分析.穿梭載體(shuttle vector)是指含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子季惩，能在兩種不同的生物中復(fù)制的。例如既能在原核生物中復(fù)制,又能在真核生物中復(fù)制的載體.這類載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因,還有真核生物的自主復(fù)制序列(ARS)以及選擇標(biāo)記性狀,具有多克隆位點(diǎn).通常穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆,擴(kuò)增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表達(dá)分析.61?

用Taq酶的PCR產(chǎn)物3’端加上了一個(gè)A腻格。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出一種線性質(zhì)粒画拾，其5’端突出的T，它們之間可以連接菜职，即TA克隆青抛。

When it comes to treating diseases like cancer, modern medicine has an impressive arsenal. And one of its most versatile weapons are Y-shaped proteins called monoclonal antibodies. Our immune systems already produce their own antibodies (plasma cell), they come in billions of variations, each matching a specific target, such as a particular toxin, bacteria or virus. When they bind to their target, they send a signal, this bacterium is now marked for destruction. These naturally- produced antibodies are pretty effective. In the 1970s, scientist figured out how to mass produce them.