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?之前我們講了測序以及第一代測序技術(shù)，還沒看的小伙伴可以先去補(bǔ)補(bǔ)課（你真的搞懂測序技術(shù)了嗎——測序精置、第一代測序）驳庭。今天我們接著講第二代測序技術(shù)。

? 上回我們說到，Sanger測序的缺點(diǎn)主要是速度慢和成本高饲常，為了解決這些問題蹲堂，新的測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。既然最先出現(xiàn)的Sanger測序是第一代測序贝淤，那么之后出現(xiàn)的就只能依次稱為第二代柒竞、第三代測序或者是下一代、下下代測序了播聪，不得不說朽基，這個命名方式也有點(diǎn)過于直白了。

? 第二代測序技術(shù)又稱下一代測序技術(shù)（next generation sequencing, NGS）离陶，由于通量高——一次測序能讀取成千上萬個短DNA片段（Sanger測序一次只能測一條DNA片段）稼虎，又被稱為高通量測序技術(shù)（high throughput sequencing, HTSeq）。

? 目前市場上主流的二代測序儀有很多招刨，比如Illumina測序儀霎俩、羅氏454測序儀、還有國產(chǎn)的華大智造測序儀等沉眶，每種測序儀都有其比較獨(dú)特的測序原理打却，這里我們以介紹市場占比最高的Illumina測序儀為主，其主要包括文庫制備谎倔、橋式PCR擴(kuò)增柳击、測序三個步驟，具體如下：

1片习、文庫制備:

1）將待測DNA隨機(jī)打斷為一定長度的片段（如圖1）捌肴。

圖1

2）對片段的兩個末端進(jìn)行處理，如圖2所示藕咏，最終產(chǎn)生的每條DNA單鏈的5’端均連有P7哭靖、index、Rd2SP（Read2 Sequencing Primer）侈离，3’端均連有P5和Rd1SP（Read1 Sequencing Primer）试幽，這些DNA單鏈即組成樣品文庫。

圖2

? 這里就需要解釋一下P5/P7卦碾、index铺坞、Rd1SP和Rd2SP分別是什么了。

? P5/P7：Illumina測序使用的微陣列芯片叫做流通池(flow cell)洲胖，其表面固定了無數(shù)條寡核苷酸鏈（P5’,P7）,分別可以與P5济榨、P7’互補(bǔ)結(jié)合。這樣绿映，當(dāng)樣品文庫中的DNA單鏈進(jìn)入流通池后擒滑，就通過其3’端的P5結(jié)合到了附著在流通池表面的P5’上腐晾。

? index：我們知道第二代測序是高通量測序，一次測序能讀取成千上萬個短DNA片段丐一，當(dāng)這些片段來自不同的樣本時我們該如何區(qū)分呢藻糖？那就給來自不同樣本的DNA片段添加上一段不同的序列，有序列A的就是來自A樣本的DNA片段库车，有序列B的就是來自B樣本的DNA片段巨柒，像A、B序列這種用于區(qū)分來自不同樣本的DNA片段的標(biāo)簽序列就叫做index柠衍。

? Rd1SP和Rd2SP分別是第一輪測序引物和第二輪測序引物洋满。為什么需要兩輪測序呢？第二代測序有單端測序珍坊、雙端測序牺勾，顧名思義，單端測序就是只從一端讀取DNA的序列（→）阵漏，雙端測序就是從兩端相向讀取DNA的序列（→←）驻民，那自然就需要在待測DNA的兩端都加上引物了。

2袱饭、橋式PCR擴(kuò)增

1）前面我們提到，樣品文庫中的DNA單鏈進(jìn)入流通池后呛占，就通過其3’端的P5結(jié)合到了附著在流通池表面的P5’上虑乖。由于樣品文庫經(jīng)過稀釋后濃度足夠低，因此晾虑，可以認(rèn)為各DNA單鏈均勻的結(jié)合在流通池表面疹味，且相距足夠遠(yuǎn)（圖3）。

圖3? 底部帶有黑色橫線的序列代表附著在流通池表面

2）以其中一條DNA單鏈為例帜篇，在適宜的條件下糙捺，以P5’為引物、文庫DNA單鏈為模板進(jìn)行復(fù)制后笙隙，洗去文庫DNA單鏈洪灯，就獲得了一條附著在流通池表面的DNA單鏈（如圖4）。

圖4

3）進(jìn)行橋式PCR：

①新合成的附著在流通池表面的DNA單鏈彎曲竟痰，其3’端的P7’與流通池表面的P7互補(bǔ)結(jié)合签钩，在適宜的條件下，以P7為引物坏快，彎曲的DNA分子為模板進(jìn)行復(fù)制（如圖5）铅檩。

圖5

②附著在流通池表面的DNA單鏈再彎曲與P5’或P7互補(bǔ)結(jié)合，再進(jìn)行復(fù)制（如圖6）莽鸿。

圖 6

③25-28個循環(huán)后昧旨，原來散布在流通池表面的文庫DNA單鏈變成了DNA簇拾给，為保證同一簇內(nèi)只有一種DNA單鏈，以及為了先從Rd1SP開始測DNA的序列兔沃，因此蒋得，先把P5’上的DNA鏈切割并洗脫，只保留P7上的DNA鏈粘拾，這樣在flow cell表面就形成了數(shù)以億計(jì)的DNA分子簇（cluster）窄锅，每個cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇（如圖7）。為什么要把DNA單鏈擴(kuò)增為DNA簇呢缰雇？我們后面再回答入偷。

圖7

3、測序：

1）加入能與Rd1SP互補(bǔ)結(jié)合的引物Rd1SP’械哟，DNA聚合酶疏之，以及特殊的dNTP（帶有阻斷基團(tuán)，當(dāng)被添加到DNA末端時可阻斷延伸反應(yīng)暇咆；4種dNTP帶有4種不同的熒光基團(tuán)可發(fā)出不同的熒光信號）锋爪，在適宜的條件下，開始測序（如圖8）爸业。延伸（阻斷基團(tuán)使反應(yīng)終止）→洗掉多余的dNTP→掃描添加到DNA末端的dNTP發(fā)出的熒光信號[后續(xù)再通過分析就能知道這個位置添加上的是哪種dNTP其骄，這就是邊合成邊測序（sequencing by synthesis， SBS）技術(shù)]→切去熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)扯旷，再加入反應(yīng)物拯爽，又可以繼續(xù)延伸（這就是可逆終止技術(shù)）→洗掉......→掃描......→......，如此循環(huán)钧忽，把每個位置添加上的堿基都測出來毯炮，拼在一起就是這條DNA的序列。完成第一輪測序耸黑，洗去合成鏈桃煎。

看到這里關(guān)于為什么要把DNA單鏈擴(kuò)增為DNA簇這個問題你應(yīng)該已經(jīng)有答案了——使單鏈的DNA復(fù)制轉(zhuǎn)換為多條相同鏈的同步復(fù)制，從而放大光信號大刊。但是隨著復(fù)制的進(jìn)行为迈，cluster中各個DNA分子復(fù)制的協(xié)同性降低，因此缺菌，第二代測序的缺點(diǎn)就是讀長短曲尸。

圖8

2）再加入Rd2SP’（如圖9），測出index的序列男翰，洗去另患。

圖9

3）再進(jìn)行橋式PCR，這次保留P5’上的DNA鏈蛾绎，進(jìn)行第二輪測序昆箕，加入Rd2SP鸦列，這次從Rd2SP開始測DNA的序列，實(shí)現(xiàn)雙端測序（如圖10）鹏倘。

圖10

小結(jié)：

①第二代測序技術(shù)又稱為下一代測序技術(shù)薯嗤、高通量測序技術(shù)。

②illumina測序是一種基于單分子簇的邊合成邊測序技術(shù),基于專有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)原理纤泵。測序時將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面(即flow cell),這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后,在flow cell 上形成了數(shù)以億計(jì)cluster骆姐，每個cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸,通過可逆性終止的邊合成邊測序技術(shù)對待測的模板DNA進(jìn)行測序

③優(yōu)點(diǎn)：速度快捏题、成本低玻褪、通量高、準(zhǔn)確性高公荧。缺點(diǎn)：讀長短带射。

好了，測序技術(shù)的系列文章就更到這了循狰，如果還有什么疑問窟社，可以在評論下方提問。

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