今天分享DNA測序技術(shù)和原理梳玫，包括illumina和pacbio測序原理掂榔、基本介紹和優(yōu)缺點對比遍希。
Illumina測序技術(shù)
- 原理：邊合成邊測序
- 測序長度：150bp
- 通量：6TB
測序原理
觀看網(wǎng)址：https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
文庫構(gòu)建
DNA片段需要加接頭修飾才能進行上機測序验靡，這個過程稱為二代測序的文庫構(gòu)建
流程及其原理：末端修飾-添加接頭-磁珠純化-PCR擴增-磁珠純化
測序是以單鏈為單位的云稚，建庫完成后的每條DNA的單鏈均一端連有測序引物-Rd1Sp和P5华畏，另一端為Rd2 SP缠借、Index和P7柿估。
Index用來區(qū)分不同的文庫，因為測序儀一個run產(chǎn)生數(shù)據(jù)量巨大岸浑，由于實際情況不同搏存，一次上機常會進行多個文庫測序，因此需要加上Index來區(qū)分矢洲。
上機測序
- 三個系統(tǒng)：
溫度控制系統(tǒng)璧眠；酶控制系統(tǒng)；熒光信號收集系統(tǒng)
- 過程：
首先以寡核苷酸為引物读虏、文庫片段為模板進行DNA復制责静，復制完成后解鏈，將文庫片段洗去盖桥，留在流通池表面的為與文庫模板互補的DNA鏈灾螃。
因為單鏈DNA另一端為不同的接頭序列，可以與相鄰的另一種寡核苷酸互補結(jié)合揩徊，之后進行“橋”式擴增睦焕。
橋式擴增后一個DNA簇都是由最初的一個文庫模板復制而來藐握，但是這時候P7上的序列與P5上的序列是分別從兩端開始的，測序要保證每個片段一致性垃喊，因此再次解鏈線性化，切割并洗去P5上的DNA鏈袜炕，只留P7上的DNA單鏈本谜。
加入測序引物Read1 SP和修飾過的DNA聚合酶，則在測序引物3’端開始DNA復制偎窘。
雙末端測序乌助，進行另一個方向的測序，洗掉前面復制合成的片段陌知，從另一端進行序列讀取他托。
測序數(shù)據(jù)
優(yōu)缺點
- 優(yōu)點： 一次能夠同時得到大量的序列數(shù)據(jù)，相比于一代測序技術(shù)仆葡，通量提高了成千上萬倍赏参； 單條序列成本非常低廉
- 缺點： 序列讀長較短，Illumina平臺最長為250-300bp
Pacbio測序技術(shù)
- 原理：邊合成邊測序
- 測序長度：30kb
-
通量：20GB
測序原理
觀看網(wǎng)址：https://www.youtube.com/watch?v=_lD8JyAbwEo
單分子實時測序SMRT
SMRT 中有很多 ZMW 小孔沿盅。ZMW（Zero-Mode Waveguides）孔把篓，即零模波導孔。每一個SMRT Cell 中含有大量這種圓形納米小孔腰涧，直徑為50~100nm韧掩，該小孔利用了一種物理效應零模波導，外徑比激發(fā)光波長小窖铡，當 DNA 分子進入小孔后疗锐，因激發(fā)光從孔底發(fā)出的光不能穿透小孔進入上方的溶液區(qū)，僅被限制在底部一個足以覆蓋被檢測 DNA 部分的區(qū)域费彼，進而收集該區(qū)域的信號滑臊，將背景噪音降到最低。
在納米孔底部敌买，錨定著測序模板（DNA 單鏈）和 DNA 聚合酶简珠，同時包含著四種被不同熒光基團修飾的 dNTP。由于每次添加的 dNTP 所攜帶的熒光顏色是不同的虹钮，在激光的激發(fā)下可以發(fā)出不同的熒光聋庵，根據(jù)散射出的熒光信號可以判斷添加的堿基類型
HIFI reads
在這種測序模式下，酶讀長一般大于插入片段長度芙粱，因此酶會繞著模板進行滾環(huán)測序祭玉，插入片段會被多次測序。單次測序中造成的隨機測序錯誤春畔，可以通過算法進行自我糾錯校正脱货，最終得到高準確度的 HiFi reads.
Pacbio優(yōu)缺點
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pacbio 的優(yōu)點
1岛都、超長讀長
2、準確性高
3振峻、測序速度快
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pacbio 的缺點
1臼疫、數(shù)據(jù)量小，一張芯片目前最多只有 800 萬個孔扣孟；
2烫堤、單分子測序原始數(shù)據(jù)的錯誤率高，需要重復測序降低錯誤率凤价；
3鸽斟、測序價格較高，SMRT 的成本是二代測序的 6-7 倍利诺；
4富蓄、測序儀成本較高，不適合小規(guī)模組織購買慢逾；
5立倍、提高準確性需要犧牲測序長度和數(shù)據(jù)量；
總結(jié)補充
1·第二代測序是基于PCR發(fā)展的高通量測序技術(shù)氛改，第一代測序末端終止法帐萎，而二代測序使用可逆終止末端，能夠?qū)崿F(xiàn)邊合成邊測序胜卤。
2·特殊標記堿基的熒光信號是確定序列的關(guān)鍵疆导，在測序過程中，必須將單DNA擴增成DNA簇葛躏，目的是增強信號澈段。
3·若讀取長度太長，基因簇的協(xié)同性降低舰攒，準確性下降败富，因此具有高通量，讀長短的特點摩窃。
4·基因組DNA需要使用鳥槍法打成小片段兽叮，測序完成后拼裝，而擴增子等小片段可以直接測序猾愿。
公眾號：生信分析筆記
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