Nat?Biotech | 埃米級定位揭示細(xì)胞更多細(xì)節(jié)

原創(chuàng)?驕陽似我?圖靈基因?2022-11-18 10:37?發(fā)表于江蘇

收錄于合集#前沿分子生物學(xué)技術(shù)

撰文：驕陽似我

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1盆均、超分辨率技術(shù)在納米范圍實(shí)現(xiàn)了定位精度梯浪。本文報告了在埃米范圍內(nèi)的全光學(xué)，室溫定位灾而。本文建立在MINSTED納米鏡的概念上昭娩，通過用受激發(fā)射耗盡（STED）環(huán)形光束的低強(qiáng)度中心區(qū)域包圍熒光團(tuán)咧欣，同時不斷增加環(huán)形光束的絕對功率臭墨，從而提高精度。

2润讥、通過藍(lán)移STED光束和開啟/開關(guān)分離熒光團(tuán)转锈，與DNA鏈結(jié)合的單個熒光團(tuán)用σ = 4.7??

定位，對應(yīng)于熒光團(tuán)大小的一小部分楚殿，只有2000個檢測光子撮慨。通過瞬時DNA雜交成像和哺乳動物細(xì)胞中核層膜的分布，模擬了具有個數(shù)納米分辨率的MINSTED熒光納米鏡脆粥。

3砌溺、本文實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了一個定位精度的σ = 2.3 ??估計有10,000個檢測光子，預(yù)計這將為細(xì)胞中大分子復(fù)合物的研究開辟新的應(yīng)用領(lǐng)域冠绢。

自20世紀(jì)70年代以來抚吠，熒光顯微鏡一直是研究細(xì)胞中生物分子分布必不可少的手段。在本世紀(jì)之交弟胀，STED顯微鏡打破了衍射屏障，對光學(xué)分辨率施加了明顯無法克服的物理限制喊式，打開了幾十納米尺度的細(xì)胞成像孵户。通過依賴熒光團(tuán)熒光能力的開關(guān)，這種轉(zhuǎn)變成為可能岔留。最近引入的MINFLUX和MINSTED納米鏡又增加了10倍夏哭，從而最終達(dá)到了熒光標(biāo)簽尺度上的分辨率。

近期献联，在Nature?Biotechnology雜志上發(fā)表了一篇名為“MINSTED nanoscopy enters the ?ngstr?m localization range”的文章竖配，報告了MINSTED獲得全光學(xué)熒光團(tuán)定位的精度在埃米范圍何址。對應(yīng)于熒光團(tuán)大小的一部分，這些精度是在室溫下使用STED顯微鏡獲得的进胯。DNA鏈上的單個熒光團(tuán)用σ = 4.7??進(jìn)行定位用爪，通過將單個發(fā)射軌跡分成2000個光子的重疊塊來測量。對于在這些痕跡中實(shí)際探測到的總共10,000個光子胁镐，估計了一個精確的σ = 2.3??偎血。在DNA雜交標(biāo)記的哺乳動物細(xì)胞中成像核孔MINSTED納米鏡，該方法稱為DNA PAINT盯漂。在大鼠海馬神經(jīng)元中突觸蛋白分布的MINSTED圖像中也獲得了類似的分辨率颇玷。這些進(jìn)步之所以成為可能，是因?yàn)榕c標(biāo)準(zhǔn)的STED不同就缆，MINSTED納米鏡一次只使用一個開啟狀態(tài)的熒光團(tuán)帖渠，而焦點(diǎn)區(qū)域的所有其他熒光團(tuán)都是關(guān)閉的。此外竭宰，只有一個活性熒光團(tuán)就可以使STED更有效地實(shí)現(xiàn)阿弃，從而有利于最終的概念。

本文研究背后的物理原理可以概述如下（圖1）羞延。在幾乎所有的STED顯微鏡中渣淳，λSTED被調(diào)諧到熒光光譜的非常紅色的邊緣。對于發(fā)出紅橙色的熒光團(tuán)伴箩，通常選擇流行的近紅外λSTED= 775 nm入愧。原因是，在室溫下嗤谚，大多數(shù)熒光團(tuán)的激發(fā)光譜深入延伸到發(fā)射峰棺蛛。因此，λSTED較短的STED環(huán)形光束傾向于“直接”激發(fā)抗Stokes模式下的許多旁觀者熒光團(tuán)巩步，從而在環(huán)形區(qū)域產(chǎn)生大量熒光旁赊。因此，這種熒光影響了熒光團(tuán)分離所需的開關(guān)對比度（圖1b椅野，c）终畅。隨著受激發(fā)發(fā)射的熒光團(tuán)橫截面?隨發(fā)射光譜的變化，將λSTED遠(yuǎn)移到紅色邊緣會降低?竟闪，從而降低每單位STED光束功率的STED效率离福。隨著功率的增加來補(bǔ)償?的減少，顯然有（熱負(fù)荷）限制炼蛤，當(dāng)在最好的尺度上定位時變得明顯妖爷。

然而，當(dāng)開/關(guān)對比度由STED以外的過程提供時理朋，就像當(dāng)單個熒光團(tuán)在活性和非活性狀態(tài)之間切換時一樣絮识，λSTED可以被調(diào)諧到更接近發(fā)射最大值绿聘，從而使?變得更大。在這種情況下次舌，STED環(huán)形光束“直接”激發(fā)引起的背景并不重要熄攘，因?yàn)樗械臒晒鈭F(tuán)，除了被定位的熒光團(tuán)垃它，都是不活躍的（圖1c）鲜屏。較大的?使較低的STED光束功率，從而避免禁止加熱国拇，并使用脈沖二極管激光器（圖1d）洛史。圖1：藍(lán)移MINSTED。

藍(lán)移λSTED也改變了光學(xué)裝置的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（E-PSF）（圖1b)酱吝。E-PSF是λEXC（和λSTED）激發(fā)和λSTED去激發(fā)的歸一化概率的乘積也殖，代表熒光團(tuán)在焦點(diǎn)區(qū)域某一坐標(biāo)發(fā)射的概率。一般情況下务热，隨著?和環(huán)形光束強(qiáng)度的增加忆嗜，E-PSF的半最大值全寬（FWHM）變窄。另一方面崎岂，由于環(huán)形光束的“直接”激發(fā)捆毫，藍(lán)移的λSTED導(dǎo)致了一個基座（圖1b）。雖然這種基座影響了整體STED成像（圖2a冲甘，b）绩卤，但在處理單獨(dú)發(fā)射體時，這并不重要江醇。

對于發(fā)射峰值在≈為570nm的熒光團(tuán)Cy3B濒憋，本文實(shí)現(xiàn)了λSTED?= 636 nm，使?達(dá)到其全球最大值的28%陶夜。這應(yīng)該與將流行的λSTED?= 775 nm應(yīng)用于Atto647N等紅色發(fā)射熒光團(tuán)時獲得的≈5%形成對比凛驮。共對準(zhǔn)的λEXC?= 560 nm激發(fā)和STED光束，分別具有電子同步脈沖200 ps和1.4ns的脈沖条辟，通過1.4數(shù)值孔徑的油浸物鏡聚焦到樣品中黔夭。因此，在STED脈沖能量為1 nJ時捂贿，獲得了一個24nm橫向FWHM的E-PSF（圖2c纠修，d）。相比之下厂僧，在λSTED?=為775 nm處，需要≈為10nJ的脈沖才能獲得與Atto 647N相同的FWHM了牛。在使用的10mhz重復(fù)頻率下颜屠，這種藍(lán)移導(dǎo)致平均STED光束功率從100 mW減少到10 mW辰妙，從而大大降低了熱負(fù)荷。注意甫窟，將FWHM從共聚焦持續(xù)調(diào)整到最小FWHM是每個MINSTED熒光團(tuán)定位的一個組成部分密浑。圖2：藍(lán)移STED的對比度和分辨率。

為了通過開/關(guān)開關(guān)進(jìn)行分離粗井，首先選擇了在被稱為DNA PAINT的方法中實(shí)現(xiàn)的機(jī)制：通過DNA雜交尔破，熒光團(tuán)與感興趣的生物分子目標(biāo)的瞬時結(jié)合。當(dāng)熒光團(tuán)與目標(biāo)結(jié)合浇衬，從同一坐標(biāo)發(fā)出時懒构，它處于“打開”。相反耘擂，當(dāng)熒光團(tuán)在周圍的介質(zhì)中擴(kuò)散時胆剧，它就會“關(guān)閉”，只產(chǎn)生一個微弱的背景（圖3）醉冤。這種通過結(jié)合和擴(kuò)散進(jìn)行的開/關(guān)調(diào)制使能夠避免光可激活和光可切換的熒光團(tuán)秩霍，而是使用常規(guī)的熒光團(tuán)，特別是Cy3B蚁阳。

因此铃绒，PAINT允許使用首選的波長上非常適合STED的染料。DNA PAINT的開/關(guān)調(diào)制也使多次測量單個結(jié)合位點(diǎn)成為可能螺捐，這有助于對單個結(jié)合位點(diǎn)的定位精度進(jìn)行統(tǒng)計分析颠悬。一般來說，STED與DNA雜交標(biāo)記的結(jié)合具有高度的協(xié)同作用归粉，因?yàn)楫?dāng)定位結(jié)合的熒光團(tuán)時椿疗，STED環(huán)形光束抑制了擴(kuò)散熒光團(tuán)的背景。STED的使用只是通過添加另一種斷開機(jī)制來增加DNA標(biāo)記的對比度糠悼。同樣地届榄，與標(biāo)準(zhǔn)的高分辨率DNA涂料應(yīng)用相比，這種放大的關(guān)閉開關(guān)有利于使用更高濃度的擴(kuò)散標(biāo)簽倔喂，從而可以加速成像铝条。

為了量化藍(lán)移MINSTED定位和納米鏡學(xué)，使用矩形DNA折紙陣列進(jìn)行了測量席噩，在12nm周期距離下為單個熒光團(tuán)提供3×3結(jié)合位點(diǎn)班缰。選擇擴(kuò)散Cy3B熒光團(tuán)的濃度，每次只有一個熒光團(tuán)對接到焦點(diǎn)區(qū)域內(nèi)的網(wǎng)格點(diǎn)悼枢，而其他熒光團(tuán)在溶液中自由擴(kuò)散(圖3b和4a-c）埠忘。首先驗(yàn)證了隨著STED脈沖能量E的增加，信號-背景比（SBR）的增益（圖3b）。為此莹妒，光柵掃描了2μm×2μm視場名船，激發(fā)平均功率為1.5μW。由單獨(dú)結(jié)合的熒光團(tuán)呈現(xiàn)的熒光峰值從結(jié)果圖像中的熒光最大值中提取旨怠，而背景則從每像素的平均熒光信號中提取渠驼。

關(guān)閉激發(fā)光束使能夠量化STED光束的“直接”激發(fā)。發(fā)現(xiàn)主要的背景成分確實(shí)是由于激發(fā)光束誘導(dǎo)了來自擴(kuò)散熒光團(tuán)的熒光鉴腻。然而迷扇，隨著STED脈沖能量E的增加，該成分迅速下降爽哎，因?yàn)榄h(huán)形光束限制了允許熒光的區(qū)域蜓席。STED束的“直接”激發(fā)隨E的增加，但仍可接受（圖3b）倦青∥痛玻總之，在1 nJ下得到的SBR = 60比標(biāo)準(zhǔn)共聚焦顯微鏡（E = 0）獲得的SBR高10倍产镐，也沒有像典型的微流量最后定位步驟那樣被犧牲隘庄，為高精度定位奠定了基礎(chǔ)。圖3：結(jié)合STED與開關(guān)和DNA雜交標(biāo)記癣亚。

通過比較單定位估計σest和聚類分析精度σcluster丑掺，能夠評估40分鐘測量中結(jié)合位點(diǎn)的有效位置不確定性，作為過程中涉及的穩(wěn)定性的代理述雾。通過對σcluster?(M)?進(jìn)行建模街州，得到了一個s=為0.72 nm的值，證明了該系統(tǒng)的長期穩(wěn)定性玻孟。精度和穩(wěn)定性的結(jié)合使我們的藍(lán)移MINSTED系統(tǒng)能夠清晰地分辨出接近4 nm的折紙結(jié)合位點(diǎn)唆缴，這大約是Cy3B分子大小的兩倍（圖4b-f）。用L > Nc注冊所有本地化解決了整個折紙模式黍翎。圖4：MINSTED納米鏡定位精度和分辨率面徽。

為了探索藍(lán)移MINSTED納米技術(shù)在生物樣品中的性能，制備了表達(dá)核孔蛋白NUP96的哺乳動物（HeLa）細(xì)胞匣掸，作為sfGFP標(biāo)記的多肽趟紊，作為抗GFP納米體的結(jié)合位點(diǎn)。由于核孔復(fù)合體（NPC）在焦平面上的八倍對稱性碰酝，像NUP96這樣的NPC支架組件經(jīng)常被用來評估納米鏡方法的性能霎匈。針對這些NUP96多肽的GFP標(biāo)簽的納米體攜帶一條DNA對接鏈，與Cy3B熒光團(tuán)的互補(bǔ)DNA鏈能夠通過雜交結(jié)合送爸，其中70%的圖像估計中位數(shù)σ<為1nm（圖5a-d）铛嘱。

從數(shù)據(jù)集中手動選擇所有可識別的NPC（328個NPC包含8116個定位暖释，占數(shù)據(jù)集中所有定位的78%），并進(jìn)一步分析它們的定位分布弄痹，得到的平均站點(diǎn)占用率為6.8個預(yù)計的八倍排列（圖5e)饭入。從這個數(shù)據(jù)集中嵌器，所有有8個被占據(jù)位點(diǎn)的NPC都被用于進(jìn)一步分析肛真，以確保沿孔隙輪廓的良好覆蓋。在估計其橢圓度時爽航，排除了所有長徑比>1.25的NPC蚓让。從剩下的81個NPCs中，包括2361個定位讥珍，確定了平均直徑為112±6nm（圖5f）历极。

接下來研究了MINSTED圖像如何與提供NUP96結(jié)構(gòu)信息的三個低溫電子顯微鏡（低溫-em）數(shù)據(jù)集相匹配。每個NPC的32個全長NUP96多肽的x-y投影結(jié)構(gòu)是根據(jù)它們與低溫研磨的DLD-1 NPC的低溫電子顯微鏡圖的擬合進(jìn)行排列的衷佃。附加標(biāo)簽所在的NUP96c端（氨基酸937）被突出顯示（圖5g)趟卸。從選擇的81個NPC中，創(chuàng)建了一個疊加圖像氏义，復(fù)制了通過NUP96可視化的NPC的8倍對稱性（圖5h）锄列。這個覆蓋層被用來估計與從低溫電子顯微鏡數(shù)據(jù)推導(dǎo)出的NUP96位置的擬合。

因?yàn)镚FP納米體實(shí)體是通過柔性連接肽附加到NUP96c端惯悠，它可以跨越旋轉(zhuǎn)自由邻邮，一個二維（2D）可能的熒光團(tuán)位置的圓形區(qū)域。在估計的平均長度為7 nm時克婶，包括連接體筒严、GFP和納米體，其中68%的≈定位包含在這些區(qū)域內(nèi)（圖5i）情萤。每個NUP96定位簇的細(xì)長外觀沿著外圍鸭蛙，如疊加圖所示，可以解釋為表明NUP96多肽在每個NPC的八角形亞基中輕微交錯排列筋岛∪⑹樱考慮到可能的旋轉(zhuǎn)半徑為7 nm的熒光團(tuán)位置，低溫電子顯微鏡結(jié)構(gòu)與MINSTED得到的數(shù)據(jù)很一致（圖5j）泉蝌。圖5：核孔藍(lán)移MINSTED成像歇万。

通過這項(xiàng)測試后，MINSTED納米鏡被應(yīng)用于沒有表現(xiàn)出與NPC類似對稱排列的結(jié)構(gòu)勋陪。具體來說贪磺，用抗層膜A/C抗體標(biāo)記COS-7細(xì)胞，這些抗體在靠近抗體結(jié)合袋的糖基化位點(diǎn)上有兩條DNA對接鏈诅愚。對接鏈通過DNA雜交用于Cy3B標(biāo)記寒锚。該抗體針對層膜蛋白A/C的Ig-fold結(jié)構(gòu)域劫映。記錄熒光團(tuán)及其位置68分鐘，就得到了層膜分布的納米級分布（圖6a）刹前。雖然該樣品對分離和定位提出了更多的挑戰(zhàn)泳赋，但估計的中位數(shù)σ為<1 nm。最后用一/二抗夾層標(biāo)記突觸蛋白2喇喉，應(yīng)用MINSTED來觀察培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元軸突末端密集的突觸囊泡的分布祖今。所得到的MINSTED圖像顯示了直徑為38 ± 23 nm的熒光團(tuán)簇，與代表突觸囊泡的預(yù)期一致（圖6b）拣技。圖6：層膜和突觸囊泡的藍(lán)移MINSTED成像千诬。

總之，本文發(fā)現(xiàn)藍(lán)移MINSTED能夠用400個檢測光子定位單個熒光團(tuán)膏斤，σ = 1 nm徐绑，這是一個創(chuàng)紀(jì)錄的低數(shù)量。需要注意的是莫辨，為了實(shí)現(xiàn)這種精度傲茄，理想的無背景質(zhì)心定位需要≈11000個光子，這強(qiáng)調(diào)了以強(qiáng)度為零定位熒光團(tuán)的好處沮榜。減少所需的檢測數(shù)量也減少了運(yùn)動和漂移的影響盘榨。接近4 nm的熒光團(tuán)可以完全分離，還不需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)后處理或漂移校正敞映。這一成功是因?yàn)椋?1) MINSTED以STED環(huán)形光束最小值提供樣品中的參考坐標(biāo)较曼，(2)不斷移動靠近熒光團(tuán)，使去激發(fā)速率保持不變振愿；(3) STED和共焦檢測抑制熒光背景捷犹；(4)低功率光束可以避免通過加熱而產(chǎn)生的細(xì)微干擾。

最后注意到所獲得的精度記錄仍然可以改進(jìn)冕末，而不修改最低限度的概念萍歉。由于檢測率與二極管激光器的脈沖重復(fù)率成正比，將速率從目前的10 MHz增加到50-100MHz應(yīng)該幾乎相應(yīng)地加快定位档桃。隨著激光技術(shù)的快速發(fā)展枪孩，這種情況可能很快就能在毫秒域內(nèi)實(shí)現(xiàn)1nm精度的精確定位，從而適應(yīng)更快的運(yùn)動和漂移藻肄。同樣地蔑舞，具有1-?精度的熒光團(tuán)定位也應(yīng)該成為一種常規(guī)方法。

教授介紹：

Stefan W. Hell?

Stefan Hell嘹屯，全稱Stefan Walter Hell攻询，（1962年12月23日出生于羅馬尼亞阿拉德），羅馬尼亞出生的德國化學(xué)家州弟，因使用熒光分子繞過光學(xué)顯微鏡固有的分辨率限制而獲得2014年諾貝爾化學(xué)獎钧栖。他與美國化學(xué)家W.E. Moerner和美國物理學(xué)家Eric Betzig分享了該獎項(xiàng)低零。

1978年，Stefan Hell和他的家人從羅馬尼亞移民到德國拯杠。他在海德堡大學(xué)學(xué)習(xí)物理學(xué)掏婶，1987年獲得文憑，1990年獲得博士學(xué)位潭陪。從1991年到1993年雄妥，他是海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員，從1993年到1996年畔咧，他是芬蘭圖爾庫大學(xué)激光顯微鏡小組的首席科學(xué)家茎芭。他于1997年回到德國，成為哥廷根馬克斯普朗克生物物理化學(xué)研究所的研究小組組長誓沸。2002年，他成為該研究所所長壹粟。

參考文獻(xiàn)：

Weber, M., von der Emde, H., Leutenegger, M.et al.MINSTED nanoscopy enters the ?ngstr?m localization range.Nat Biotechnol(2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01519-4