百香果染色體水平的基因組可提供對香氣生物合成的見解
中文名：百香果染色體水平的參考基因組裝可提供對香氣生物合成的見解
英文名：Chromosome-level reference genome assembly provides insights into aroma biosynthesis in passion fruit (Passiflora edulis)
雜志：Molecular Ecology Resources
發(fā)表時間：2020年12月
影響因子：6.286
Passiflora edulis
passion fruit
一抓韩、研究背景
果樹的種植引起了全世界園藝和農(nóng)學(xué)家的廣泛關(guān)注趋距。高質(zhì)量參考基因組的發(fā)展將為這些重要經(jīng)濟(jì)農(nóng)業(yè)果樹的品種育種濒憋、種質(zhì)保護(hù)和科學(xué)研究提供遺傳基礎(chǔ)军熏。然而，很大一部分果樹基因組有相對較高的雜合子水平且包含豐富的重復(fù)序列辜昵，阻礙了對這些物種的研究掉弛。
全基因組復(fù)制事件 (WGD) 或多倍化使染色體加倍導(dǎo)致基因復(fù)制，隨后導(dǎo)致新功能產(chǎn)生或子功能化热监。幾乎所有果樹植物基因組序列都經(jīng)歷過WGD事件苍苞。WGD事件不僅增加了植物基因組的大小，而且擴(kuò)大了遺傳變異狼纬，提高了轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性羹呵，進(jìn)一步增加了物種多樣性。
Passiflora Linn. (Passifloraceae) 西番蓮屬（西番蓮科）是西番蓮科中最大的屬疗琉，共有520 種冈欢。Passiflora edulis Sims. (Passion fruit)百香果是一種多年生常綠攀緣藤，起源于南美洲熱帶盈简，是西番蓮科中種植最廣泛的西番蓮屬凑耻。由于缺少基因組數(shù)據(jù)，關(guān)于其適應(yīng)機(jī)制柠贤、氣味合成途徑和遺傳進(jìn)化的研究均受到了限制香浩。完成一個最廣泛種植的百香果物種染色體版本的基因組組裝，可以為物種進(jìn)化史和香氣合成背后的遺傳機(jī)制提供新的見解臼勉。
二邻吭、材料和方法
- 樣品收集：百香果根、葉宴霸、莖和四個不同的發(fā)育階段的果實(shí)囱晴，并儲存于-80°C冰箱膏蚓。
- 基因組測序：Illumina HiSeq X Ten測序平臺、PacBio Sequel2測序平臺
- 轉(zhuǎn)錄組測序：Illumina Novaseq測序平臺
- 基因組調(diào)研圖與組裝：hifiasm畸写、Pilon(version1.18)驮瞧、BWA(version0.7.10-r789)、SAMtools(version1.9)枯芬、BUSCO(version3.0)
- Hi-C掛載：LACHESIS论笔、BWA、ALLHiC千所、HiC-pro(version2.10.0)
- 蛋白質(zhì)編碼基因的預(yù)測：TBLASTN狂魔、GeneWise、Scallop(version0.10.4)真慢、SNAP(version2006-07-28)毅臊、GENEMARK (version4.48_3.60_lic)、AUGUSTUS (version3.3.3)
- 功能注釋：BLASTP黑界、InterProScan (version4.8)管嬉、HMMER (version3.3)
- 重復(fù)序列分析：HMMER (version3.3)
- 非編碼RNA鑒定：tRNAscan-SE (version1.3.1)、RNAmmer (version1.2)朗鸠、INFERNAL (version1.1.3)
- 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：OrthoFinder (version2.4.0)蚯撩、MAFFT (version7.407)
- 基因家族的擴(kuò)張和收縮：MCL、CAFE
- 共線性和全基因組復(fù)制分析：The CIRCOS (version0.69-6)烛占、MCScanX
- 水果中特異性表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組分析和鑒定：Trimmomatic胎挎、bowtie (version1.3.0)、RSEM (version1.3.2)
三忆家、結(jié)果
1.百香果基因組的測序和組裝
根據(jù)k-mer計(jì)數(shù)估計(jì)基因組大小約為1.27Gb犹菇，通過流式細(xì)胞技術(shù)估計(jì)基因組大小約為1.41Gb。調(diào)研圖的K-mer峰顯示基因組屬于中等的雜合子水平（0.75%）和高重復(fù)的序列（72.68%）芽卿。為了獲得百香果的參考基因組揭芍，使用CCS 模型生成了223.91Gb的PacBio長讀數(shù)據(jù)，隨后被校正為9.8Gb的有效(HiFi)數(shù)據(jù)卸例。HiSeqXTen平臺也生成約89.12Gb（70×）的短序列称杨。我們最初組裝得到了1.40Gb的contig水平基因組，組裝結(jié)果24088個contigs筷转」迷基于k-mer計(jì)數(shù)策略，使用Khaper進(jìn)一步識別和去除雜合子序列呜舒。所得組裝為1.28Gb锭汛，contig N50為70Kb，最長contig 長度為6.87Mb。
使用BUSCO評估組裝的完整性店乐，其中88.1%是完整基因艰躺，66.8%為單拷貝基因呻袭，21.3%為多拷貝基因眨八。此外，二代數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果進(jìn)行比對左电，短序列比對率為99.21%廉侧，組裝基因組的比對率為99.18%。通過與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較篓足，進(jìn)一步評估了基因組組裝段誊。這些轉(zhuǎn)錄本98.93%的堿基和98.93%的序列成功比對至基因組上。
核型分析表明栈拖，百香果是一種二倍體连舍，有9對染色體。使用75.96 Gb Hi-C數(shù)據(jù)scaffold組裝水平的基因組進(jìn)行掛載涩哟，scaffold N50是126.4 Mb索赏，最長scaffold是281.91 Mb。共有1.27Gb序列掛載在9條假染色體上贴彼，占初始組裝序列的99.22%潜腻。針對Hi-C數(shù)據(jù)評估，顯示7.43%的唯一比對數(shù)據(jù)和59.31%的有效數(shù)據(jù)器仗，對染色質(zhì)相互作用的全基因組分析顯示融涣，沿對角線的Hi-C結(jié)果交互強(qiáng)度高。
2.基因組注釋
通過轉(zhuǎn)錄組預(yù)測精钮、同源預(yù)測和從頭預(yù)測威鹿，注釋了39,309個蛋白質(zhì)編碼基因。平均基因長度為3,650 bp轨香，平均有6.88個外顯子忽你，根據(jù)InterPro、eggNOG和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫對這些基因進(jìn)行了功能注釋弹沽，注釋結(jié)果分別為93.35%檀夹、88.63%和71.42%。使用COG策橘、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步注釋了這些基因炸渡。大約81.81%的基因在COG中有同源基因，70.25%有GO term分類丽已，25.58%的基因可以比對到已知的植物生物途徑蚌堵。BUSCO分析顯示，在注釋結(jié)果中有85.1%的植物保守基因。
轉(zhuǎn)錄因子 (TFs) 在植物發(fā)育及其對環(huán)境的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用吼畏。我們基于PlantTFDB（3.0）從百香果基因組中預(yù)測了1722個轉(zhuǎn)錄因子督赤。這些TFs可分為 52 個家族，其中bHLH（146個基因）泻蚊、MYB（135個基因）躲舌、ERF（121個基因）、FAR1（115個基因）和293個NAC（110個基因）是前五TF家族性雄。
使用INFERNAL將基因組序列通過比對Rfam數(shù)據(jù)庫區(qū)分miRNA, sRNA,和snRNA没卸，使用tRNascan-SE和RNAmmer預(yù)測tRNA和RRNA，預(yù)測到百香果基因組中有86個miRNA秒旋、28個sRNA约计、225個snRNA、939個tRNA和 784個 rRNA迁筛。
百香果基因組序列高重復(fù)煤蚌，共有1104.86Mb重復(fù)序列，占基因組長度的86.3%细卧。LTR是占主導(dǎo)性的重復(fù)類型尉桩，占基因組序列中的963.67Mb（75.35%）。還比較了Pacbio測序數(shù)據(jù)長度與基因組中LTRs的長度酒甸。Pacbio測序數(shù)據(jù)的最大長度和N50長度分別為291,409bp和15,170bp魄健。LTRs的最大長度和N50的長度分別為45,317bp和2,567bp。這表明大多數(shù)PacBio測序數(shù)據(jù)都比LTRs長插勤，足以跨越LTRs沽瘦。LTRs包括兩種主要類型，Ty1/Copia和Ty3/Gypsy农尖，分別占組裝基因組的15.09%和42.67%析恋。非LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，包括LINE和SINE盛卡，占基因組序列的很小部分助隧，分別占4.26%和0.1%。此外滑沧，共有28,229個串聯(lián)重復(fù)序列被識別并村，占基因組序列的53.94Mb（4.22%）。
在百香果染色體上檢測到33個假定的著絲粒片段滓技。除Chr7缺失外哩牍，所有染色體均有分布。還確定了6個假定的端粒片段令漂，其中3個在Chr1上預(yù)測膝昆，而在Chr2和Chr4和Chr8中只檢測到一個丸边。
3.進(jìn)化及全基因組復(fù)制事件分析
為了分析百香果基因組中的共線性關(guān)系，我們使用BLASTP鑒定同源蛋白荚孵，并用MCSCanX識別同源蛋白妹窖。發(fā)現(xiàn)423個共線性塊，有7776個基因?qū)κ找丁IRCOS圖顯示GC含量骄呼、基因密度、TEs分布和基因表達(dá)有協(xié)同關(guān)系滔驾。
To study the evolutionary history and divergence time of passion fruit, we performed comparative genomic analysis of passion fruit with the genomes of the eight selected angiosperm species, including five Malpighiales 金虎尾目 plants (L. usitatissimum, M. esculenta, Po. trichocarpa, R. communis, S. purpurea), a Citrus 柑橘 plant (C. clementina), and two model organisms (A. thaliana and O. sativa).
為了研究百香果的進(jìn)化史和分化時間谒麦，與 8種被子植物 的基因組進(jìn)行了比較基因組分析俄讹，其中包括(L. usitatissimum, M. esculenta, Po. trichocarpa, R. communis, S. purpurea), (C. clementina), 和 (A. thaliana and O. sativa)哆致。從417,083個基因中鑒定了40,345個基因家族。在百香果基因組中患膛，從39309個基因中鑒定13972個基因家族摊阀，擁有8106個單拷貝基因。
與其他五種植物相比踪蹬，百香果有760個特異的基因胞此。GO富集分析表明，這些特異基因家族與RNA修飾跃捣、DNA整合漱牵、RNA定向DNA聚合酶活性、DNA重組疚漆、鈣依賴性磷脂結(jié)合酣胀、不飽和脂肪酸生物合成過程和防御反應(yīng)相關(guān)。KEGG分析表明娶聘，這些特異基因家族大多聚集于不飽和脂肪酸生物合成闻镶、脂肪酸代謝、異黃酮生物合成丸升、硫胺酮代謝铆农、類黃酮生物合成、苯丙烷生物合成狡耻、氨基糖和核苷酸糖代謝的途徑墩剖。這些百香果特異基因家族的表達(dá)和調(diào)控可能導(dǎo)致其水果的特殊味道。
從上述9個植物基因組中鑒定出了79個高質(zhì)量的單拷貝同源基因夷狰。Ks值顯示岭皂，P. edulis - Po. trichocarpa的Ks峰值分布為0.81。P. edulis - S. purpurea是0.87孵淘，對應(yīng)于63.48mya和68.18mya蒲障，百香果和其他兩種植物之間的分化時間分別105.80mya(Ks=1.35, P. edulis - L. usitatissimum)和66.61mya(Ks=0.85, P. edulis - M. esculenta)。
根據(jù)Ks值的分布，研究了百香果基因組中的WGD事件揉阎。與之前研究一致庄撮，A. thaliana基因組峰值為0.76揭示了一個古老的WGD事件。P. edulis基因組揭示Ks分布的兩個峰毙籽，一個峰在0.59代表~46.24mya發(fā)生的WGD事件洞斯，另一個在1.59代表雙子葉植物的全基因組三倍化事件。植物基因組進(jìn)化過程中坑赡，WGD和多倍化的頻率高于哺乳動物烙如，導(dǎo)致大部分重復(fù)基因和重復(fù)序列存在于植物基因組中。BUSCO分析顯示毅否，兩個WGD事件導(dǎo)致了相對較高的重復(fù)水平（21.3%）亚铁。
基因家族的擴(kuò)展和收縮可能在百香果的進(jìn)化中起到至關(guān)重要的作用，導(dǎo)致表型多樣化螟加、對環(huán)境的適應(yīng)甚至物種形成徘溢。對9株植物的基因家族擴(kuò)張和收縮的比較分析顯示，百香果基因組中有1525個基因家族已經(jīng)擴(kuò)大捆探，5239個已經(jīng)收縮然爆。在50個顯著的進(jìn)化(p值<0.01)基因家族中，33個基因家族顯著的擴(kuò)張黍图，17個基因家族顯著的收縮曾雕。
對顯著擴(kuò)張的基因家族進(jìn)行 Pfam 數(shù)據(jù)庫比對，主要與包括踔唬基輔酶A脫氫酶/氧化酶剖张、凝集素結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸結(jié)構(gòu)域恰起、SAM依賴性羧甲基轉(zhuǎn)移酶修械、鋅指（CCHC型）結(jié)構(gòu)域和植物自溶性S1相關(guān)。KEGG富集 表明检盼，大多數(shù)快速擴(kuò)展的基因家族聚集于類黃酮生物合成肯污、半乳糖代謝、二萜類生物合成吨枉、脂肪酸降解和脂肪酸代謝的途徑蹦渣。這些代謝過程可能與水果的發(fā)育及其味道形成有關(guān)。
4. 轉(zhuǎn)錄組和代謝組結(jié)合分析揭示了香氣合成的遺傳機(jī)制
研究表明貌亭，酯和萜烯是百香果香氣背后的主要揮發(fā)性成分柬唯。為了研究在芳香相關(guān)生物合成途徑中發(fā)揮重要作用的基因，對四個不同發(fā)育階段的果實(shí)（綠色圃庭、中間锄奢、輕度成熟的果實(shí)和成熟的果實(shí)）和其他植物器官失晴，包括莖、根和葉等營養(yǎng)器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析拘央。我們首先鑒定了376個基因涂屁，它們至少在一個水果樣本（FPKM>30）中高表達(dá)，但在的其他器官中下調(diào)且FPKM低于4灰伟。GO和KEGG分析顯示376個特異性表達(dá)基因在類黃酮生物合成拆又、含花青素復(fù)合生物合成和白氰苷氧酶活性中顯著富集±刚耍花青素是天然的著色劑帖族，賦予水果紅色以及額外的營養(yǎng)價值。
根據(jù)前期研究挡爵，我們進(jìn)一步收集了22個與水果發(fā)育和香氣生物合成相關(guān)的基因竖般。在這些基因中，45個在百香果果實(shí)中高表達(dá)了讨。我們將這45個基因分為香氣形成捻激、水果成熟和碳水化合物代謝三個功能類別。香氣形成類別中的大多數(shù)基因在水果樣本中顯示出階段特異性的表達(dá)模式前计。對于編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶的HMGR，在水果第1階段特別性高表達(dá)垃杖，證明了其在百香果發(fā)育早期生成異戊二烯類化合物中的重要作用男杈。兩個TPS基因（TPS1和TPS6）在水果第2階段高度上調(diào)，很可能是百香果中類固醇積累的基礎(chǔ)调俘。兩個ADH（alcohol dehydrogenases）基因（ZX.01G0025650 和ZX.01G0084850）在水果階段3中特異性表達(dá)伶棒，可能在水果將六烯醇轉(zhuǎn)化為醇過程中發(fā)揮重要作用。此外彩库，AAT1肤无、ADH3、LOX5和TPS10的表達(dá)水平在水果成熟過程中（從水果1到4階段）逐漸增加了骇钦，這意味著它們在類萜醇和揮發(fā)性酯化合物的積累中發(fā)揮了重要的作用宛渐，最終導(dǎo)致百香果宜人的香氣。
同時還分析了與水果成熟及碳水化合物代謝相關(guān)的基因眯搭。SAMS2,催化半胱氨酸為S-腺苷甲硫氨酸窥翩，在水果發(fā)育早期的顯示出高表達(dá)水平。在階段2和3階段分別富集了2份CYP71B34和2份PMEI鳞仙。與此同時寇蚊，三份ACO1，一份BLX1和ACS可能導(dǎo)致了水果成熟棍好，參與碳水化合物代謝的三個基因(PFK仗岸、NpAIdP1和MCSA1)在第3階段或第4階段高度表達(dá)允耿，說明了它們在百香果成熟中潛在的重要功能。
四扒怖、結(jié)論
（1）作者利用 PacBio 的 HiFi 測序模式和 Hi-C 技術(shù)進(jìn)行了百香果的染色體水平基因組組裝右犹；
（2）1.28Gb的百香果基因組包含39,309個蛋白質(zhì)編碼基因和1.1Gb重復(fù)序列，其中LTRs是最主要的轉(zhuǎn)座因子姚垃，占基因組序列的75.35%念链。
（3）兩個全基因組復(fù)制事件導(dǎo)致基因擴(kuò)展和新功能化，可能導(dǎo)致脂質(zhì)代謝和特殊香氣的積累积糯。
（4）比較轉(zhuǎn)錄組分析確定了水果中376個可能與水果發(fā)育和成熟相關(guān)的特異表達(dá)基因掂墓，其中45個候選基因在果實(shí)發(fā)育過程中的乙烯和芳香合成途徑中發(fā)揮了重要作用工秩。
本文提供的基因組數(shù)據(jù)不僅促進(jìn)百香果品種的分子育種菱农，也為今后果實(shí)香氣形成的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
