材料
RPMI-5 或DMEM-5 完全培養(yǎng)基
新鮮分離的小鼠器官: ≤6 周齡的小鼠胸腺齿尽；6 周至6 個(gè)月齡的小鼠脾臟和淋巴結(jié)
60mmX15mm 培養(yǎng)皿
剪刀和鑷子（保存在70 ％乙醇的燒杯中）
裝有19G 針頭的6ml 注射器
200μm 尼龍濾網(wǎng)
步驟
?將新鮮分離的器官放入盛有3ml RPMT-5 或DMEM-5 完全培養(yǎng)基的60mmX15mm培養(yǎng)皿（每種器官一個(gè)培養(yǎng)皿）中， 用剪刀將器官剪碎灯节。
用6ml 注射器的活塞將組織塊向培養(yǎng)皿底面用力擠壓直到僅剩纖維組織循头。
用裝有19G 針頭的6ml 注射器將組織懸液反復(fù)抽吸數(shù)次缠俺，以進(jìn)一步粉碎組織團(tuán)塊。
將細(xì)胞懸液通過(guò)200μm 尼龍濾網(wǎng)濾入離心管中贷岸。用約4ml 完全培養(yǎng)基洗一次培養(yǎng)皿，如需要?jiǎng)t重復(fù)一次磷雇，之后將洗液通過(guò)濾網(wǎng)加入離心管中偿警。
在離心機(jī)中以1000r/min (200g) 離心10min 后棄上清 。用20ml 完全培養(yǎng)基將沉淀重懸后離心唯笙，再以適量培養(yǎng)基重懸以便計(jì)數(shù) 螟蒸。
如細(xì)胞不能立即處理，最好的保持細(xì)胞活力的辦法是將細(xì)胞懸液置于冰塊中崩掘。這種處理也能減少因細(xì)胞貼壁引起的細(xì)胞損失 七嫌。
如何去除脾臟細(xì)胞懸液中的紅細(xì)胞？
脾臟細(xì)胞懸液在進(jìn)行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)之前最好先去除紅細(xì)胞(RBC) 苞慢。胸腺和淋巴細(xì)胞懸液則不必去除紅細(xì)胞诵原。脾臟細(xì)胞的亞群分離也需先去除紅細(xì)胞。
附加材料
ACK 裂解緩沖液
步驟
每個(gè)脾臟用約5ml 裂解緩沖液懸浮脾臟細(xì)胞挽放；一個(gè)12ml 試管可用于裂解一個(gè)或兩個(gè)脾臟绍赛，也可以用50ml 離心管裂解更多的脾臟。
室溫孵育5min 辑畦，間以搖動(dòng)吗蚌。
加入洗液直至裝滿容器，在低速離心機(jī)上以200g 離心10min 后棄上清纯出。再洗沉淀一次并以適量培養(yǎng)基重懸以便下一步操作（如去除死細(xì)胞蚯妇、細(xì)胞計(jì)數(shù)或者細(xì)胞分離）。
一步梯度法去除死細(xì)胞
下面介紹的方法暂筝，其基本原理是基于活細(xì)胞（密度較新嵫浴）和死細(xì)胞（密度較大）密度不同，從而有助于將活的淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞分離焕襟。
附加材料
高密度溶液：Ficoll-Paque (Ficoll 和泛影酸鈉分扎；Pharmacia LKB) 或Lympholyte-M(Cedarlane)
12ml 或50ml 聚丙烯離心管（比聚苯乙烯離心管好）
注：Ficoll-Paque 和Lympholyte-M 的密度與溫度有關(guān)；該方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液適合在室溫中使用胧洒。因此應(yīng)注意使細(xì)胞懸液畏吓、離心和高密度溶液控制在室溫。否則會(huì)因活細(xì)胞沉入離心管底導(dǎo)致在密度界面上損失活細(xì)胞卫漫。
步驟
用RPMI-5 完全培養(yǎng)基混懸細(xì)胞菲饼， 分裝到離心管中使其細(xì)胞數(shù)達(dá)到 0. 5X10^8~ 1 X10^8個(gè)細(xì)胞／2ml (12ml 離心管）或 1X 10^8~ 5 X 10^8個(gè)細(xì)胞／5 ml (50ml 離心管）。
用移液器吸取3ml （使用12ml 離心管時(shí)）或5ml （使用50ml 離心管時(shí)）高密度溶液列赎， 將槍頭伸到離心管底宏悦，緩慢將高密度溶液加入細(xì)胞懸液下方。
室溫， 800g 離心15min饼煞。為了取得好的分離效果源葫，最好將離心機(jī)的”brake” 開(kāi)關(guān)關(guān)掉。
使用5ml 移液器砖瞧，沿高密度層表面緩慢移動(dòng)移液器槍頭息堂， 吸入漂浮在高密度層上方的活細(xì)胞， 盡量少收集高密度溶液块促。將活細(xì)胞移入另一管中荣堰。
加入RPMI-5 完全培養(yǎng)基（少量細(xì)胞加入10ml , 細(xì)胞量較多時(shí)加入40ml) ，室溫竭翠，200g 離心10min振坚。重復(fù)一次。
以適量培養(yǎng)基混懸細(xì)胞以便進(jìn)行下一步操作斋扰。
