細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)敦迄、免疫學(xué)嫩海、實驗醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等多種學(xué)科研究的基礎(chǔ)實驗技術(shù)之一睛驳。通過細(xì)胞培養(yǎng)可以直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動辜梳，聯(lián)合各種技術(shù)進(jìn)行各種物理泡态、化學(xué)生物的研究官疲。
一袱结、準(zhǔn)備工作
細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作是很重要，也很復(fù)雜的一項工作途凫，應(yīng)予以重視垢夹。
1.無菌室及無菌操作臺
無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品维费，例如試管架果元、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置促王，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通而晒。實驗用品以70%
ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)蝇狼。實驗操作應(yīng)在臺面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作欣硼。實驗進(jìn)行前题翰，無菌室及無菌操作臺(laminar
flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70% ethanol擦拭無菌操作抬面诈胜，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后豹障，才開始實驗操作。
2.實驗材料的準(zhǔn)備
2.1玻璃器皿的清洗焦匈、干燥血公、消毒：
1）細(xì)胞培養(yǎng)的和主要是玻璃容器與pasteur pipet，其它均為塑料無菌制品缓熟。
2）實驗用的玻璃容器與pasteur pipet使用前都要進(jìn)行清洗累魔。新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用够滑。
3）用過之玻璃血清瓶垦写，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈彰触，勿加清潔劑清洗梯投。
4）實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘况毅，置于oven中烘干分蓖。實驗用玻璃pasteur pipet以干熱滅菌170℃, 4 小時。
2.2培養(yǎng)容器：種類有Tflask尔许，plates, dishes, roller bottle等么鹤，依實驗需要使用。
2.3 培養(yǎng)基的配制及分裝
1）細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清味廊，液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱蒸甜，避免光照，實驗進(jìn)行前放在37℃水槽中溫?zé)嵴泵恰Ｒ后w培養(yǎng)基（加血清）存放期為六個月迅皇，期間glutamine可能會分解，若細(xì)胞生長不佳衙熔，可以再添加適量glutamine。
2）粉末培養(yǎng)基(以1升為例)之配制體積為900ml搅荞，pH為7.2-7.4红氯。NaHCO3為另外添加框咙，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH之誤差，或局部過堿痢甘。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合喇嘱，然后用CO2氣體調(diào)整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)塞栅，因為氯離子對細(xì)胞生長可能有影響者铜，且貯存時培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。高壓滅菌后添加血清放椰。
3）為避免培養(yǎng)基污染作烟，可以在培養(yǎng)基中添加雙抗(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。若實驗或細(xì)胞不允許砾医，可將培養(yǎng)基少量分裝拿撩。操作均在無菌條件下進(jìn)行。
2.4 抗生素
1）ATCC細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素
2）培養(yǎng)自其它實驗室引進(jìn)之細(xì)胞株如蚜，制作token freeze前培養(yǎng)基須添加抗生素压恒，待token freeze通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素错邦。
3）寄送活細(xì)胞時探赫，須將培養(yǎng)液充滿整個flask時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)撬呢。
4）若要檢測mycoplasma伦吠，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin會抑制mycoplasma生長倾芝。
5）去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml,streptomycin 250ug/ml,neomycin 250ug/ml,bacitracin 2.5units/ml讨勤，注意混合使用后藥物毒性會增強。
6）抗生素使用種類與濃度：
2.5血清
1）血清必須貯存于–20～–70℃晨另，若存放于4℃潭千，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶借尿，可將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中刨晴，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10%，必須預(yù)留此膨脹體積之空間路翻，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形狈癞。
2）一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾茂契。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物蝶桶，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清掉冶。
3）瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天真竖，至室溫下全溶后再分裝脐雪，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)恢共，使溫度與成分均一战秋，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍讨韭，因溫度改變太大脂信，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。
3.培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試
1）CO2鋼瓶之CO2壓力透硝。
2）CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度(5%)狰闪、溫度(37度)、及更換水盤的無菌水(可添加消毒劑(Zephrin 1:750)每周更換蹬铺。
3）無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力尝哆，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時/預(yù)濾網(wǎng)甜攀，3000小時/HEPA)秋泄。
4. 其他試劑的配制及滅菌
4.1 PBS(PH7.4，1L)：稱取8g NaCl规阀、0.2g KCl恒序、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4谁撼，最后加蒸餾水定容至1L即可0.01M歧胁。高壓蒸汽滅菌121℃,15 lb,20分鐘，室溫放冷厉碟，置于4度或常溫保存喊巍。
4.2 無菌水：雙蒸水高壓蒸汽滅菌121℃,15 lb,20分鐘，室溫放冷箍鼓，常溫保存崭参。
二、細(xì)胞傳代培養(yǎng)
工作人員穿戴實驗衣及手套進(jìn)入無菌室款咖，小心取用實驗物品何暮，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口铐殃，亦不要在打開之容器正上方操作實驗海洼。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身富腊，傾斜約45°角取用坏逢，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class
II)词疼。操作過程中俯树，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生帘腹，小心毒性藥品贰盗，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等阳欲。
細(xì)胞生長至高密度時舵盈，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3至1:6球化，依細(xì)胞種類而異秽晚。具體步驟：
粘附細(xì)胞：
1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
2. 用PBS洗滌細(xì)胞一至二次筒愚。
3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)赴蝇，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察巢掺，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時句伶，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA陆淀，則在trypsin-EDTA作用后考余，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液)轧苫。
4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落楚堤，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊含懊，混和均勻后身冬，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)岔乔。
懸浮細(xì)胞：
1.吸出細(xì)胞培養(yǎng)液酥筝，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘重罪。
2. 吸掉上清液樱哼，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后剿配，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中搅幅，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
三呼胚、細(xì)胞冷凍保存
步驟：
1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基茄唐，觀察細(xì)胞生長情形。
2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10％沪编，混合均勻呼盆，置于室溫下待用。
3. 按細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作蚁廓，收集培養(yǎng)之細(xì)胞访圃，取少量細(xì)胞懸浮液((約0.1 ml)計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
4. 離心相嵌，去除上清液腿时，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5x106cells/ml饭宾，混合均勻批糟，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中1ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測看铆。
5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16～18小時(或隔夜)→液氮槽vapor phase長期儲存徽鼎。
6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于含異丙醇的程序降溫盒中，直接放入-80℃弹惦，1～2天后再放入液氮槽中否淤。
注意事項：
1. 欲冷凍保存的細(xì)胞應(yīng)在生長良好且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度肤频。
2. 冷凍前檢測細(xì)胞仍保有其特有性質(zhì)叹括。
3.冷凍保護(hù)劑DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色宵荒，以5~10ml小體積分裝汁雷，4℃避光保存，勿作多次解凍报咳。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級侠讯，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用暑刃，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性厢漩。
4. 冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件岩臣，在做冷凍保存之同時溜嗜，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗架谎。
四炸宵、細(xì)胞復(fù)蘇
步驟：
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中谷扣，并不時搖動令其盡快融化土全。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液裹匙，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液瑞凑，混勻；
3. 離心概页，1000rpm籽御，5min；
4. 棄去上清液绰沥，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞篱蝇，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度徽曲，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)麸塞；
5. 次日更換一次培養(yǎng)液秃臣，繼續(xù)培養(yǎng)。
注意事項：
1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套哪工，防止冷凍管可能爆裂之傷害奥此。
2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊雁比，由于熱脹冷縮過程稚虎，此時蓋子易松掉。
3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 ℃水槽中回溫偎捎，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之蠢终，移入無菌操作臺內(nèi)。
五茴她、細(xì)胞計數(shù)與存活測試
1.存活測試之步驟為dye exclusion寻拂，利用染料會滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整丈牢，染料無法滲入而不會呈色祭钉。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue己沛，則用紅色之Erythrosin bluish慌核。
2. 步驟：
2.1. 取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue (or Erythrosin bluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
2.2. 取少許混合液(約15μl)自細(xì)胞計數(shù)版上方凹槽加入申尼，于100倍倒立顯微鏡下觀察垮卓，或于細(xì)胞計數(shù)儀中自動檢測活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色- Erythrosinbluish)晶姊。
2.3. 計數(shù)四個大方格之細(xì)胞總數(shù)扒接，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)钾怔，最后乘以104碱呼，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上宗侦，只計上線與右線之細(xì)胞(或計下線與左線之細(xì)胞)愚臀。
4 大格*細(xì)胞總數(shù)x2x104/4=細(xì)胞數(shù)/ml
