Genome-wide methylomic analyses identify prognostic epigenetic signature in lower grade glioma
全基因組甲基組學(xué)分析確定低級(jí)別膠質(zhì)瘤的預(yù)后表觀遺傳特征
發(fā)表期刊：J Cell Mol Med
發(fā)表日期：2022 Jan
DOI:? 10.1111/jcmm.17101
一处坪、背景
????????膠質(zhì)瘤是臨床上最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤之一，約占所有惡性腦腫瘤的80%初烘。根據(jù)WHO 2016年的分級(jí)系統(tǒng)娶耍，膠質(zhì)瘤分為低級(jí)別和侵襲性高級(jí)別膠質(zhì)瘤构诚，即低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）气堕。盡管LGG的預(yù)后相對(duì)較好流纹，但70%的患者在10年內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)楦叩燃?jí)的腫瘤拆挥。
????????基于RNA或蛋白質(zhì)的信息曾被用來(lái)確定癌癥的生物標(biāo)志物薄霜，如EGFR（和PTEN。然而纸兔，由于RNA和蛋白質(zhì)在癌癥生物學(xué)和生物標(biāo)本中的高度動(dòng)態(tài)性惰瓜，所提供的信息有時(shí)是不穩(wěn)定的，在臨床應(yīng)用中存在著缺陷汉矿。鑒于DNA在一段時(shí)間內(nèi)比RNA或蛋白質(zhì)更穩(wěn)定崎坊，基于DNA甲基化的信息可能更可靠。
二洲拇、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來(lái)源
1）DNA甲基化數(shù)據(jù)和LGG患者的相應(yīng)臨床信息奈揍、RNA測(cè)序（RNAseq）數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)曲尸；有485577個(gè)DNA甲基化位點(diǎn)的514個(gè)病例被納入本研究中；三分之二的病例被隨機(jī)選為訓(xùn)練隊(duì)列男翰，以確定和構(gòu)建預(yù)后模型另患，另外三分之一的病例被作為驗(yàn)證隊(duì)列
2）鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集了20個(gè)配對(duì)的石蠟包埋的人類(lèi)LGG組織和相匹配的相鄰正常組織，并進(jìn)行了切片奏篙，用于免疫組化
3）外部數(shù)據(jù)集（GSE104293柴淘，N=132；GSE10850秘通，N = 185）
2.實(shí)驗(yàn)流程
三为严、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 、預(yù)后性DNA甲基化生物標(biāo)志物
????????通過(guò)對(duì)來(lái)自訓(xùn)練隊(duì)列的DNA甲基化水平數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量Cox比例回歸分析肺稀，共篩選出26183個(gè)與OS相關(guān)的DNA甲基化位點(diǎn)第股。這些候選甲基化標(biāo)記被用來(lái)進(jìn)行多變量的Cox回歸分析。最后话原，選擇兩個(gè)預(yù)后生存相關(guān)的DNA甲基化位點(diǎn)的組合模型作為生存預(yù)測(cè)因子夕吻。根據(jù)其估計(jì)的回歸系數(shù)，計(jì)算出每個(gè)患者的組合預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)得分：風(fēng)險(xiǎn)得分=（-6.733×cg00390143的β值）+（-7.902×cg19598875的β值）繁仁。與這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因分別是GALNT9（多肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶9）和TMTC4（靶向鈣粘蛋白4的跨膜O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶）涉馅。
????????同時(shí)，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)來(lái)比較短生存期（<3年）和長(zhǎng)生存期（>3年）組的DNA甲基化水平的差異黄虱。結(jié)果顯示稚矿，長(zhǎng)期生存的患者表現(xiàn)出明顯較高的DNA甲基化水平（圖1A，B）捻浦，這與之前的多變量Cox回歸分析結(jié)果一致晤揣。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GALNT9在LGG組織中的表達(dá)明顯較低（圖1C）朱灿，免疫組化分析顯示GALNT9基因在LGG組織中低表達(dá)（圖1D）昧识，這與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果一致。
02 盗扒、兩個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化特征與OS之間的關(guān)聯(lián)
????????以風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)為連續(xù)變量的Cox回歸分析顯示跪楞，在訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中，兩個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化特征與患者的OS均有明顯關(guān)系侣灶。使用中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（-6.95）作為截?cái)嘀迪芭瑢⒒颊叻譃楦唢L(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組。采用K-M曲線和Log-rank檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估和比較不同組別中患者的OS炫隶。結(jié)果顯示淋叶，這一特征能夠?qū)⒒颊呙黠@地分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，而風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)較高的患者表現(xiàn)出較短的OS（圖2A）伪阶。為了檢驗(yàn)這一預(yù)后指標(biāo)煞檩，計(jì)算了驗(yàn)證隊(duì)列中患者的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)处嫌，并觀察到類(lèi)似的結(jié)果，即高風(fēng)險(xiǎn)患者的OS較差（圖2B）斟湃。作者進(jìn)行了時(shí)間依賴(lài)性的ROC分析熏迹，通過(guò)使用分類(lèi)變量計(jì)算出與甲基化特征相比，OS<3年的AUC值凝赛。在訓(xùn)練組和驗(yàn)證組中注暗，AUC值均超過(guò)0.90（圖2D），顯示該特征在預(yù)測(cè)預(yù)后方面具有良好的鑒別能力墓猎。這些結(jié)果表明捆昏，雙CpG位點(diǎn)DNA甲基化特征在臨床應(yīng)用中具有很大的潛力，可以作為一個(gè)可靠的預(yù)后生物標(biāo)志物毙沾。
????????為了進(jìn)一步評(píng)估該特征的預(yù)后潛力骗卜，下載了一個(gè)額外的數(shù)據(jù)集（GSE104293，N=132）左胞。K-M分析表明寇仓，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分大于訓(xùn)練隊(duì)列中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）明顯短于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者（圖2C）。AUC估計(jì)值為0.736（圖2D）烤宙，表明該特征也是其他獨(dú)立隊(duì)列中LGG患者預(yù)后的一個(gè)有效預(yù)測(cè)因素遍烦。
03 、2-CpG位點(diǎn)特征在OS預(yù)測(cè)中與臨床和病理因素的獨(dú)立性
????????臨床因素躺枕，如性別服猪、年齡、腫瘤等級(jí)屯远、癌癥家族史或IDH突變狀態(tài)都會(huì)影響患者的生存。為了分析特征的獨(dú)立性和適用性捕虽，作者根據(jù)不同的臨床病理特征對(duì)患者進(jìn)行了重新分組慨丐。首先，年齡是癌癥風(fēng)險(xiǎn)最大的單一預(yù)測(cè)因素之一泄私，作者發(fā)現(xiàn)初始診斷年齡與OS之間存在明顯的負(fù)相關(guān)（圖3A）房揭，將患者分為兩個(gè)亞組（小于45歲與45歲或以上）。K-M分析表明晌端，高危組患者的OS與低危組患者相比要差得多捅暴，ROC分析證實(shí)2-CpG位點(diǎn)特征具有很高的預(yù)測(cè)性能（圖3B，C）咧纠。其次蓬痒，以往的研究表明，膠質(zhì)瘤患者的發(fā)病率和結(jié)局都存在性別差異漆羔，男性的發(fā)病率和死亡率都高于女性梧奢，在本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)患者的性別進(jìn)行了重新分組狱掂。結(jié)果顯示，低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者有明顯的較長(zhǎng)的OS亲轨，AUC值>0.90（圖S2）趋惨，表明2-CpG位點(diǎn)特征是獨(dú)立于患者的性別。
????????眾所周知惦蚊，膠質(zhì)瘤的惡性程度隨WHO等級(jí)不同而不同器虾。雖然在疾病進(jìn)展方面有明顯的結(jié)果差異，但它在高危組和低危組患者的OS上有明顯的差異蹦锋，G2和G3組的AUC值分別為0.878和0.912兆沙。同時(shí)，LGG由星形細(xì)胞瘤晕粪、少突膠質(zhì)瘤和混合型少突膠質(zhì)瘤組成挤悉，星形細(xì)胞瘤患者的預(yù)后一般比少突膠質(zhì)瘤患者差。在這里巫湘，無(wú)論組織學(xué)亞型如何装悲，2-CpG位點(diǎn)特征都能很好地區(qū)分低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，高風(fēng)險(xiǎn)組的患者往往有較差的OS（圖S4）尚氛。異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變狀態(tài)是LGG的一個(gè)已知的預(yù)后指標(biāo)诀诊，與IDH1野生型相比，IDH突變的患者表現(xiàn)出有利的生存結(jié)果阅嘶。在這里属瓣，發(fā)現(xiàn)在TCGA隊(duì)列和另一個(gè)GEO數(shù)據(jù)集（GSE10850，N = 185）中讯柔，IDH狀態(tài)的AUC值分別為0.750和0.668抡蛙，表明在預(yù)測(cè)OS方面，2-CpG位點(diǎn)特征可能比IDH狀態(tài)具有更高的性能魂迄。然后研究了該特征是否可以用來(lái)區(qū)分不同IDH突變狀態(tài)的患者的生存風(fēng)險(xiǎn)粗截，發(fā)現(xiàn)可以區(qū)分低風(fēng)險(xiǎn)或高風(fēng)險(xiǎn)的患者，無(wú)論他們是否有IDH突變（圖S5）捣炬。此外熊昌，根據(jù)是否給予放療將患者分為亞組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-CpG位點(diǎn)特征的預(yù)測(cè)性能與患者是否接受輔助放療之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)湿酸。家族史也是膠質(zhì)瘤的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素婿屹，膠質(zhì)瘤患者的一級(jí)親屬患膠質(zhì)瘤的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加（圖S6）。這里推溃，有132名患者有癌癥家族史昂利。無(wú)論家族史如何，該特征都有助于將患者區(qū)分為具有不同結(jié)果的亞組（圖S7）。
????????此外页眯，還進(jìn)行了分層分析梯捕，分別使用2-CpG位點(diǎn)特征風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和年齡或性別或WHO分級(jí)或組織學(xué)亞型或IDH突變狀態(tài)作為協(xié)變量。結(jié)果表明窝撵，2-CpG位點(diǎn)特征傀顾、2-CpG位點(diǎn)特征以及作為協(xié)變量的臨床因素在回歸模型中沒(méi)有顯著差異，表明2-CpG位點(diǎn)特征可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素碌奉。
04短曾、2-CpG位點(diǎn)特征與其他已知的預(yù)后標(biāo)志物的比較
????????最近，已經(jīng)確定了幾個(gè)LGG的預(yù)后標(biāo)志物赐劣。例如嫉拐，NF-κB已被確定為L(zhǎng)GG的OS和惡性PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。PD-1啟動(dòng)子甲基化已被證明是彌漫性LGG IDH突變患者的一個(gè)預(yù)后因素魁兼。有研究發(fā)現(xiàn)婉徘，21種mRNA的表達(dá)水平可以作為L(zhǎng)GG患者的預(yù)后生物標(biāo)志物進(jìn)行組合。為了將本研究預(yù)后特征與已知模型進(jìn)行比較咐汞，作者在TCGA驗(yàn)證和GEO數(shù)據(jù)集中對(duì)2-CpG位點(diǎn)特征和其他模型進(jìn)行了時(shí)間依賴(lài)的ROC曲線分析盖呼。結(jié)果顯示，在TCGA驗(yàn)證隊(duì)列（圖4A）和GEO隊(duì)列（圖4B）中化撕，我們的特征比幾乎所有其他已知模型（包括所有臨床因素几晤、mRNA標(biāo)記、DNA甲基化標(biāo)記）的AUC值都高植阴，說(shuō)明2-CpG位點(diǎn)特征在預(yù)測(cè)LGG患者的OS方面有令人滿意的效果蟹瘾。
????????最近，使用針對(duì)程序性細(xì)胞死亡1（PD-1）掠手、程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）憾朴、程序性細(xì)胞死亡配體2（PD-L2）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）的免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）的癌癥免疫療法在癌癥中提供了顯著的臨床效益。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的與癌癥有關(guān)的細(xì)胞死亡類(lèi)型喷鸽，并在癌癥進(jìn)展和治療期間發(fā)揮重要作用众雷。在此，為了進(jìn)一步研究甲基化特征在ICB治療和癌癥進(jìn)展中的可能作用魁衙，對(duì)這些已知的免疫治療相關(guān)基因报腔、鐵死亡調(diào)節(jié)基因和兩個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化特征進(jìn)行了一對(duì)一的相關(guān)分析株搔。結(jié)果顯示剖淀，免疫檢查點(diǎn)分子PD-1、PD-L1纤房、PD-L2和CTLA-4共同表達(dá)纵隔，2-CpG位點(diǎn)特征與PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4明顯正相關(guān)（圖4C和圖S8）捌刮。對(duì)于鐵死亡調(diào)節(jié)基因碰煌，DNA甲基化特征與HSPB1、HSPA5绅作、DPP4芦圾、TFRC、SAT1俄认、SLC1A5个少、FANCD2、ATP5MC3眯杏、SLC7A11夜焦、NFE2L2顯著正相關(guān)，而與ACSL4岂贩、CISD1茫经、RPL8、FDFT1萎津、NCOA4顯著負(fù)相關(guān)（圖4C）卸伞。這些結(jié)果意味著2-CpG位點(diǎn)DNA甲基化特征可能在衡量ICB免疫療法的反應(yīng)性和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起作用。
05姜性、 GO和KEGG分析2-CpG位點(diǎn)DNA甲基化特征中與兩個(gè)基因相關(guān)的基因
????????相關(guān)性分析顯示瞪慧，2736個(gè)基因與GALNT9和TMTC4顯著相關(guān)，其中688個(gè)基因與這兩個(gè)基因顯著正相關(guān)部念。GO富集分析顯示弃酌，這些被篩選的基因主要富集于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物過(guò)程調(diào)控和對(duì)刺激的反應(yīng)儡炼。KEGG通路的富集分析表明妓湘，這些被篩選的基因主要集中在代謝通路、吞噬體乌询、MAPK信號(hào)通路榜贴、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路上（圖S9A）妹田。Reactome通路分析顯示唬党，參與免疫系統(tǒng)、中性粒細(xì)胞脫顆粒鬼佣、Rho GTPases或白細(xì)胞介素的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期的基因占優(yōu)勢(shì)（圖S9B）驶拱。對(duì)高危組和低危組中明顯差異表達(dá)的基因集富集分析顯示，幾個(gè)與癌癥相關(guān)的途徑晶衷，包括ECM受體相互作用蓝纲、細(xì)胞粘附分子CAMs和細(xì)胞因子細(xì)胞受體相互作用阴孟，在高危組中富集，意味著該特征可能參與了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的途徑（圖5）税迷。
四永丝、結(jié)論
? ? ? ? 本研究通過(guò)分析TCGA和GEO的DNA甲基化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了一個(gè)雙CpG位點(diǎn)DNA甲基化特征箭养。該特征與LGG患者的OS有明顯關(guān)系慕嚷，并能根據(jù)生存風(fēng)險(xiǎn)區(qū)分患者的預(yù)后。該特征將有助于改善風(fēng)險(xiǎn)分層毕泌，為臨床個(gè)體化提供更準(zhǔn)確的評(píng)估闯冷。除了作為生物標(biāo)志物外，這些DNA甲基化位點(diǎn)還需要進(jìn)一步詳細(xì)研究懈词，以確定其機(jī)制并闡明它們?nèi)绾斡绊懟颊叩慕Y(jié)果蛇耀。
