作者术陶，追風(fēng)少年i

周五了，一周的收官之戰(zhàn)煤痕，馬上國(guó)慶了梧宫，希望大家有個(gè)好的假期，一切都會(huì)好起來(lái)摆碉，周星馳有一句臺(tái)詞塘匣，雖然我們都是路人甲乙丙丁，但是一樣是有生命巷帝，有靈魂的忌卤。

書接上文，空間多組學(xué)分析破譯膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的雙向腫瘤-宿主相互依賴性（空間微環(huán)境）楞泼，我們來(lái)進(jìn)行方法拾遺并復(fù)現(xiàn)驰徊。

這里我們主要關(guān)注空間轉(zhuǎn)錄組的分析，關(guān)于空間代謝和空間蛋白堕阔，仍然需要不斷的學(xué)習(xí)棍厂。

第一點(diǎn)，空間CNV分析超陆。

• CNA estimation
  
  圖片.png

通過(guò)將基因與其染色體位置對(duì)齊并對(duì)相對(duì)表達(dá)值應(yīng)用移動(dòng)平均值來(lái)估計(jì)拷貝數(shù)變異 (CNV)牺弹，每個(gè)染色體內(nèi)有 100 個(gè)基因的滑動(dòng)窗口（跟inferCNV的原理一致），首先时呀，使用 InferCNV 包根據(jù)它們各自的基因組定位排列基因张漂。 作為非惡性細(xì)胞的參考集，使用了來(lái)自非惡性皮層樣本的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集（注意這里ref的選擇）谨娜。 為了提高速度和計(jì)算能力航攒，subsample是可選的。 為了避免任何特定基因?qū)σ苿?dòng)平均線的相當(dāng)大的影響趴梢，將相對(duì)表達(dá)值限制在 [-2.6,2.6] 的范圍內(nèi)漠畜，將所有高于/低于 exp(i) = |2.6| 的值替換為 exp(i) = |2.6|币他。然后重新導(dǎo)入導(dǎo)出的 .RDS 輸出文件，并按估計(jì)的 CNA 的染色體平均值進(jìn)行分組盆驹，并使用 SPATA 對(duì)象的 fdata slot與它們的空間位置對(duì)齊圆丹。使用 SPATA::joinWithFeatures() 函數(shù)滩愁，然后提取了集群比較躯喇。空間數(shù)據(jù)的 CNA 分析是通過(guò) SPATA2::runCnvAnalysis() 命令在 SPATA2 中實(shí)現(xiàn)的硝枉。在下一步中廉丽，估計(jì)的 CNA 值重新排列到定義的染色體bin中。這些 bin 由 SPATAwrappers 函數(shù) Create.ref.bins() 創(chuàng)建妻味，使用 SPATA 對(duì)象和給定 bin 的大小作為輸入正压。在本研究中，使用了 1Mbp 的 bin 大小责球，產(chǎn)生 3847 個(gè)染色體 bin焦履，每個(gè) bin 平均覆蓋 5.5 個(gè)基因。使用 10kbp 滑動(dòng)窗口進(jìn)行重新縮放和插值雏逾。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化嘉裤，使用了一個(gè) loess 回歸模型，用于確定來(lái)自 InferCNV 輸出的拷貝數(shù)值栖博。使用 SPATAwrappers::run-CNV.Normalization() 函數(shù)進(jìn)行Interpolation和歸一化屑宠。

SPATA分析CNV的代碼如下

library(SPATA2)
spata_obj <- loadSpataObject("data/spata-obj-gbm275.RDS")###加載infercnv分析得到的rds

spata_obj <-
  runCnvAnalysis(
    object = spata_obj
    directory_cnv_folder = "data-gmb275/cnv-results" # example directory
    cnv_prefix = "Chr"
    )

# change input
spata_obj <- 
  runCnvAnalysis(
    object = spata_obj
    directory_cnv_folder = "data-gmb275/cnv-results" # example directory to 
    clear_noise_via_ref_mean_sd = list(sd_amplifier = 2)

# example on how to use the functions arguments if you want to specify the reference (ref_*)
runCnvAnalysis(
  object = spata_obj,
  directory_cnv_folder = "data-gmb275/cnv-results", # example directory to 
  ref_annotation = cnv_ref$annotation, 
  ref_mtr = cnv_ref$mtr, 
  ref_regions = cnv_ref$regions
)

##CNV-Results
cnv_results <- getCnvResults(spata_obj)

names(cnv_results)
##Visualization
plotCnvResults(object = spata_obj)

圖片.png

plotSurface(object = spata_obj, color_by = "seurat_clusters")

plotCnvResults(object = spata_obj, across = "seurat_clusters")

圖片.png

圖片.png

###CNV-Heatmap
getCnvFeatureNames(object = spata_obj)

# are part of all feature names
getFeatureNames(object = spata_obj)
##            numeric            integer            numeric            numeric 
##   "nCount_Spatial" "nFeature_Spatial"       "percent.mt"       "percent.RB" 
##             factor          character             factor             factor 
##  "seurat_clusters"     "segmentation"      "Leiden_UMAP"          "cluster" 
##            logical            numeric            numeric            numeric 
##             "keep"             "Chr0"             "Chr1"            "Chr10" 
##            numeric            numeric            numeric            numeric 
##            "Chr11"            "Chr12"            "Chr13"            "Chr14" 
##            numeric            numeric            numeric            numeric 
##            "Chr15"            "Chr16"            "Chr17"            "Chr18" 
##            numeric            numeric            numeric            numeric 
##            "Chr19"             "Chr2"            "Chr20"            "Chr21" 
##            numeric            numeric            numeric            numeric 
##            "Chr22"            "Chr23"             "Chr3"             "Chr4" 
##            numeric            numeric            numeric            numeric 
##             "Chr5"             "Chr6"             "Chr7"             "Chr8" 
##            numeric 
##             "Chr9"
plotSurface(object = spata_obj, color_by = "Chr7", pt_clrsp = "Reds 3", c1 = 1)

plotSurface(object = spata_obj, color_by = "Chr10", pt_clrsp = "Blues 3", rev = FALSE, c1 = 1)

圖片.png

CNA subclone analysis
為了根據(jù) CNA 數(shù)據(jù)確定亞克隆，進(jìn)行了 PCA 分析仇让，然后對(duì)前 30 個(gè)組分進(jìn)行 KMeans 聚類（CNV得到的矩陣進(jìn)行分析）典奉。為了確定最優(yōu)的tree cut，我們估計(jì)了 Calinski-Harabasz 指數(shù)并使用了 k~CH 指數(shù)曲線的第一個(gè)峰值（CH 指數(shù) vs Number of clusters）丧叽。 下一個(gè)目標(biāo)是量化空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序與亞克隆結(jié)構(gòu)的空間相關(guān)性和重疊卫玖。 首先，我們通過(guò)擬合值 (f(c_k)) 估計(jì)給定 CNA 亞克隆的每個(gè)點(diǎn) (S1, S2;.; Sk) 到 KMeans 質(zhì)心 (c) 的距離 (Sdist)踊淳，如下所示：

圖片.png

第二部分

• Prediction of tumor cell content
  為單細(xì)胞測(cè)序研究建立的分析和算法不一定適用于空間分辨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析。 這主要是由于每個(gè)點(diǎn)內(nèi)的細(xì)胞組成不明確雹舀，分析這些數(shù)據(jù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是近似每個(gè)點(diǎn)的真實(shí)組成芦劣。單細(xì)胞數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的整合已經(jīng)可以預(yù)測(cè)某些細(xì)胞類型的空間豐度，但在腫瘤中说榆，由于樣本內(nèi)部和樣本之間存在巨大的異質(zhì)性虚吟，這種預(yù)測(cè)很困難寸认。 與高度可變的基因表達(dá)相比，染色體改變是評(píng)估每個(gè)點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞含量的相當(dāng)穩(wěn)健和合適的參數(shù)串慰。 為了訓(xùn)練和驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型偏塞，對(duì)同一供體進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序和相應(yīng)的空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)。

推斷了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集的拷貝數(shù)變化邦鲫，并提取了腫瘤和非惡性細(xì)胞的特征灸叼，這些特征顯示出很大的相似性。

Validation of CNA Analysis

接下來(lái)庆捺，驗(yàn)證了從 RNA-seq 數(shù)據(jù)調(diào)用的推斷 CNA 反映 DNA 測(cè)序中檢測(cè)到的 CNA 的程度古今。 因此，使用了最近發(fā)表的 slide-RNA-seq 和 slide-DNA-seq 數(shù)據(jù)集滔以，并比較了兩種空間測(cè)序方法檢測(cè)到的 CNA捉腥。 兩種驗(yàn)證方法都表明，從空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中獲得的推斷 CNA 反映了使用 10X Visium 平臺(tái)獲得的空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的實(shí)際染色體增益和損失你画。

第三點(diǎn)抵碟，Spatial autocorrelation Moran’s I，關(guān)于這個(gè)內(nèi)容坏匪，用過(guò)monocle3的童鞋應(yīng)該很熟悉拟逮。

空間自相關(guān)使用 Moran 的 I 統(tǒng)計(jì)值根據(jù)特征位置和屬性值確定點(diǎn)與其鄰居的空間依賴性。 這允許評(píng)估定義的基因表達(dá)或特征是分組的剥槐、分布的還是隨機(jī)的唱歧。 如果 Z 值或 p 值表示統(tǒng)計(jì)顯著性，則 Moran's I 指數(shù)值為正表示有聚集趨勢(shì)粒竖，而 Moran's I 指數(shù)值為負(fù)表示有分散趨勢(shì)颅崩。 自相關(guān)定義為：

圖片.png

最后來(lái)一張空間軌跡

空間軌跡

生活很好，有你更好蕊苗，主要還是針對(duì)CNV的分析為主