文章標(biāo)題：
文章題目：Differentiation of transplanted haematopoietic stem cells tracked by single-cell transcriptomic analysis
期刊：Nature Cell Biology
發(fā)表時間：2020年5月
DOI: https://doi.org/10.1038/s41556-020-0512-1
摘要
由于技術(shù)上的限制，移植的造血干細胞(HSCs)在預(yù)處理的宿主體內(nèi)后不久的表現(xiàn)還沒有被研究過。在這里希俩，利用單細胞RNA測序胎署，我們首先獲得了28種造血細胞類型的基于轉(zhuǎn)錄組的分類晓锻。然后，我們將它們與功能分析相結(jié)合坑匠，跟蹤受者移植后第一周內(nèi)免疫表型純化的造血干細胞的動態(tài)變化布卡。根據(jù)我們的轉(zhuǎn)錄分類，大多數(shù)骨髓和脾臟中的HSCs成為多能祖細胞雇盖，偶爾也有一些HSCs產(chǎn)生巨核紅細胞或髓系前體細胞忿等。平行的體外和體內(nèi)功能實驗支持了在第一周沒有大量HSC擴增的情況下穩(wěn)健分化的范式。因此崔挖，這項研究揭示了早期在清髓受者中移植 HSC 的動力學(xué)和命運選擇贸街，對造血干細胞和其他干細胞的臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義庵寞。
Main
造血干細胞 (HSC) 能夠產(chǎn)生造血系統(tǒng) ，從而為患有許多破壞性疾病 3 的患者提供再生醫(yī)學(xué)（移植）的寶貴來源薛匪。在臨床實踐中捐川，移植的干細胞通常會遇到患病或受損的受體環(huán)境。盡管存在多種疾病逸尖，但目前針對患者的移植方案涉及在移植前使用化學(xué)治療劑或全身照射進行預(yù)處理古沥。因此，在這些病理受體的早期階段娇跟，與微環(huán)境（利基）的適當(dāng)接觸和移植 HSC 的有序繁殖對于移植的長期植入和最終成功至關(guān)重要岩齿。過去 已經(jīng)廣泛研究了移植 HSC 的歸巢、寄宿苞俘、定位盹沈、生態(tài)位相互作用和增殖。盡管認為大量的 HSC 在長期移植過程中會達到穩(wěn)態(tài)水平吃谣，但移植后 HSC 的行為在很大程度上是未知的乞封。
在小鼠移植模型中，早在 HSC 移植后 7-9 天就首次觀察到血小板生成岗憋。鑒于經(jīng)典的逐步造血級聯(lián)模型肃晚，HSC 必須快速響應(yīng)清髓宿主環(huán)境。與 HSCs 在生命周期中僅在有限時間內(nèi)分裂的穩(wěn)態(tài)條件相反澜驮，HSCs 應(yīng)該在清髓受體中經(jīng)歷劇烈增殖以滿足移植后造血再生的迫切需要陷揪，然后逐步分化為多個譜系 。然而杂穷，該模型的有效性從未得到嚴格或全面的研究悍缠，這主要是由于技術(shù)困難，例如移植后不久可以收集的供體來源細胞數(shù)量非常有限耐量。
單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 技術(shù)的快速發(fā)展提供了一個強大的工具和前所未有的機會來定義細胞分類飞蚓、跟蹤分化并以單細胞分辨率揭示任何給定的可分離異質(zhì)細胞群的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。因此廊蜒，我們使用 scRNA-seq 來全面表征造血系統(tǒng)中的 28 個細胞群趴拧，并應(yīng)用基于轉(zhuǎn)錄組的分類來跟蹤 HSC 移植后的供體來源細胞。
研究背景
作為研究歷史最長山叮、臨床應(yīng)用最為廣泛著榴、治療效果最為確切的成體干細胞之一，造血干細胞（HSC）依靠其“SMART”特性（S: Self renewal, M: Multi-lineage differentiation, A: Apoptosis, R: Rest/quiescence, T: Trafficking）維持整個造血系統(tǒng)的動態(tài)平衡屁倔。HSC移植也因此廣泛應(yīng)用于多種血液系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病以及多種遺傳性疾病的治療脑又。在臨床實踐中，通常在移植后不同時間點采集受者的外周血或者骨髓來評估移植物的植入效率及造血恢復(fù)情況。但對于HSC在骨髓歸巢后如何增殖问麸、分化并重建整個造血的動態(tài)過程卻知之甚少往衷。這方面研究對解決目前臨床HSC移植植入不良十分重要。
研究思路
數(shù)據(jù)
可能由于本研究開始較早严卖，單細胞測序水平還不夠高席舍，本文淡化了單細胞測序的細胞數(shù)量等信息。
造血系統(tǒng)的28個免疫表型的相應(yīng)的測序數(shù)據(jù)
結(jié)果解讀
1哮笆、小鼠造血細胞單細胞轉(zhuǎn)錄組測序
作者首先將28個免疫表型定義的造血細胞群體（immunophenotype-based haematopoietic cell populations）根據(jù)轉(zhuǎn)錄組特征定義為21個轉(zhuǎn)錄組細胞群(transcriptome-based haematopoietic cell populations)来颤，并將測序結(jié)果與已發(fā)表的造血細胞測序數(shù)據(jù)進行了比較，結(jié)果顯示相同細胞類型的測序數(shù)據(jù)結(jié)果高度吻合疟呐，證明了測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性脚曾。
作者將高度異質(zhì)性的5個免疫表型定義的HSC群體和9個免疫表型定義的MPP群體根據(jù)轉(zhuǎn)錄組特征重新定義為3個tHSC亞群（tHSC1、tHSC2和tHSC3）和5個tMPP亞群（tMPP1启具、tMPP2本讥、tMPP3、tMPP4和tMPP5）鲁冯，并對這些重新定義的HSC以及MPP在自我更新拷沸、增殖潛能以及分化傾向方面的差異進行了比較，發(fā)現(xiàn)tHSC1和tHSC2為處于造血級聯(lián)最頂端的自我更新潛能最強的HSC薯演， tHSC3主要為淋系偏向的HSC撞芍。
tMPP1為最靠近HSC的多能祖細胞亞群，而tMPP2和tMPP3主要向巨核紅系以及髓系分化跨扮，tMPP4細胞周期不活躍且分化潛能不顯著序无，而tMPP5則主要向淋系分化。這是目前成體小鼠各類造血細胞較為精細的單細胞轉(zhuǎn)錄組定義和最全面的分類體系衡创。
圖1a應(yīng)該是放錯了圖片
相同策略帝嗡，9種免疫表型多能性祖細胞(iMPPs)被分為5個不同轉(zhuǎn)錄特征群：tMPP1、tMPP2璃氢、tMPP3哟玷、tMPP4和tMPP5(圖2a)。iMPPs和tMPPs的轉(zhuǎn)錄組成均表現(xiàn)出較大轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(圖2b,c)一也。
軌跡分析巢寡，tHSC3在軌跡圖上與tHSC1和tHSC2明顯不同(圖2d)，之前研究和我們的數(shù)據(jù)分析顯示椰苟，tHSC3具有長期的淋巴細胞偏倚重建潛能抑月。因此，tHSC3可能在功能上更多地與短期HSC或MPPs相關(guān)舆蝴。tMPP1細胞在細胞周期中比tHSCs更活躍爪幻，分化軌跡分析表明菱皆，它們的分化潛能接近(圖2d)“じ澹總的來說，該軌跡圖在上半部分與造血干細胞到MPPs的連續(xù)過程一致京痢，在下半部分有明確的髓系和淋巴系分支奶甘。
因此，這21個轉(zhuǎn)錄組定義的細胞簇是評估應(yīng)激條件下細胞特性的有力參考工具祭椰，特別是當(dāng)細胞表面標(biāo)記不穩(wěn)定或細胞產(chǎn)量低導(dǎo)致移植后不久無法對移植的造血干細胞進行詳細表型分析時臭家。
基因表達譜將祖細胞,紅細胞,巨核細胞,粒細胞,單核-巨噬細胞和淋巴細胞聚為一類,稱為tCP1-3(祖細胞),tME1-3 (巨核細胞-紅系細胞)，tGM1-3 (粒細胞-單核細胞-巨噬細胞)和tLym1-4 (淋巴細胞-淋巴細胞)方淤。然后根據(jù)免疫表型細胞計算這些群體的組成钉赁。轉(zhuǎn)錄組分析將28個造血群體分為21個群，每個簇都特異性表達與功能相關(guān)特征的獨特生物學(xué)過程富集的基因携茂。
2你踩、移植后的HSC向多潛能祖細胞分化
基于上述轉(zhuǎn)錄組所有造血細胞類型的特征，研究者試圖追蹤受輻射個體移植后HSC的性質(zhì)讳苦。
從綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠(B6-Ly5.2, GFP+)中純化的HSC (CD201+150+48?45+Sca-1+c-Kit+(ESLAMSK))共1000-4000個带膜，與3×105個競爭細胞(B6-Ly5.2, GFP-)一起移植到受輻射個體(B6-Ly5.2)中。
在移植后第1鸳谜、3膝藕、5和7天收集供者GFP+細胞(57個移植受者的1031個細胞)，開展scRNA-seq(圖3a)咐扭。
供體GFP+細胞采集率極低(第1芭挽、3、5和7天分別為0.005±0.007%蝗肪、0.006±0.004%袜爪、0.012±0.009%和0.22±0.292%)；具有代表性的流式細胞圖見圖3b穗慕。與移植后ESLAMSK細胞相比饿敲，供體細胞整體基因表達早在移植后第1天就發(fā)生顯著變化。
通過對轉(zhuǎn)錄因子(TF)調(diào)控因子的分析逛绵，進一步闡明轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)轉(zhuǎn)錄活性怀各。編碼自我更新相關(guān)TFs基因（如Egr1、Egr3术浪、Gata2和Hmga2）逐漸下調(diào)瓢对。髓系細胞(Cebpa、Cebpab胰苏、Cebpad和Cebpae)和紅細胞－巨核細胞(Irf2)相關(guān)的TFs基因在移植后第1天表達上調(diào)并共表達硕蛹。
這些結(jié)果表明，移植的造血干細胞和/或其后代表現(xiàn)出弱自我更新特征，并在移植后的非常早期階段采用一種轉(zhuǎn)錄程序?qū)⑵湎拗圃谝粋€或多個譜系法焰。
根據(jù)穩(wěn)態(tài)下細胞類型特異性的特征基因?qū)⒁浦布毎譃?1個細胞簇,這些細胞身份相關(guān)基因在移植后的單個細胞中持續(xù)表達秧荆。動態(tài)平衡狀態(tài)下所有造血細胞的t分布隨機鄰域嵌入圖(圖3c)顯示，移植后1周內(nèi)tHSCs埃仪、tMPPs乙濒、tMEs和tGMs再生，而tCPs和tLyms很少(圖3d)卵蛉。與注射tHSCs相比颁股，移植后每天的細胞組成清楚表明移植的HSCs定向成為tMPPs，甚至在第1天產(chǎn)生少量tMEs和tGMs(圖3e,f)傻丝。從移植后1周內(nèi)的細胞動力學(xué)來看甘有，tHSCs(主要是tHSC1和tHSC2)的比例逐漸下降，而tMPPs是主要的人群葡缰，甚至在第1天和第7天出現(xiàn)一些tMEs和tGMs(圖3f,g)亏掀。每個代表性受體的細胞重組表明，tMPPs在移植后不久即成為主要的細胞類型运准。第1天和第7天出現(xiàn)部分譜系性細胞幌氮，特別是tMEs(17個受者中有6個)和tGMs(8個受者中有2個)(圖3h)。為排除第1天采集的細胞存在取樣偏倚可能性胁澳，另收集137個供體骨髓和脾臟細胞该互，轉(zhuǎn)錄組的細胞分類結(jié)果與圖2g所示一致，符合移植的造血干細胞在1周內(nèi)立即分化為祖細胞和譜系細胞(tMEs和tGMs)的模型韭畸。
移植后HSC第1天的轉(zhuǎn)錄組快速變化促使研究者思考轉(zhuǎn)錄組改變是否依賴于細胞分裂宇智。為此，將CellTrace Violet染色的供體HSC移植到受體小鼠體內(nèi)胰丁，移植后收集發(fā)現(xiàn)随橘，大多數(shù)供體細胞在第1天保持不分裂，但從第3天到第7天逐漸分裂(圖4a-c)锦庸，表明造血干細胞MPP轉(zhuǎn)錄組譜不依賴于細胞分裂机蔗。
3、移植HSC及其衍生的MPP動態(tài)變化
進一步分析移植后tHSC1和tHSC2的轉(zhuǎn)錄組變化(簡稱TxtHSC1/2)甘萧。移植前相比萝嘁， tHSC1和tHSC2表現(xiàn)出造血干細胞信號的下調(diào)(圖5a)。tHSC1的增殖特征減弱扬卷，而tHSC2的增殖特征增強(圖5a,b)牙言。
對于假定的分化潛能，tHSC1在巨核細胞系怪得、紅系和髓系分化上富集降低咱枉。相反卑硫，tHSC2被誘導(dǎo)向紅系和髓系分化(圖5c)。與穩(wěn)態(tài)下的同類相比蚕断，TxtHSC1/2在淋巴欢伏、凋亡或自噬信號富集方面沒有差異(圖5c，附圖8f)亿乳⊙瞻茫基于此作者認為tHSC2是處于活化狀態(tài)的HSCs滿足分化功能；tHSC1處于靜息狀態(tài)风皿，維持干細胞池。這一模式與之前功能性研究一致匠璧，表明功能性HSC的兩種不同細胞狀態(tài)桐款。
接下來研究tMPPs，它是移植后HSCs快速分化而來的主要成分夷恍。tMPP1-5不同亞群的變化過程(圖5d)魔眨。tMPP2和tMPP3的頻率增加伴隨著S/G2/M細胞周期信號的百分比升高。
tMPP1在第3天占供體細胞的30%以上酿雪，在第7天持續(xù)下降至5%以下遏暴。tMPP2在第5天占40%以上，在第7天下降到20%指黎。tMPP3的頻率最初小于5%朋凉，在第7天急劇上升到30%。tMPP4維持在低頻率醋安，而tMPP5在移植后第5天逐漸升高到20%(圖5d)杂彭。tMPP2和tMPP3的頻率增加伴隨著S/G2/M細胞周期信號的百分比升高。
GSEA利用特定基因進一步研究tMPPs的分化譜吓揪，并與相應(yīng)的對照在穩(wěn)態(tài)條件下進行比較(圖5e)亲怠。tMPP1表現(xiàn)出更高的增殖特征，有利于向紅系和髓系分化柠辞，并抑制巨核細胞团秽。tMPP2對髓系基因呈正富集，對巨核基因呈負富集叭首。tMPP3和tMPP4分別表現(xiàn)為紅系和巨核基因富集习勤。與巨核細胞、紅系細胞和髓系細胞相關(guān)的基因集在tMPP5中富集放棒，而淋巴潛能被抑制姻报。
具體來說，紅細胞(Phb2和Nfia)间螟、巨核細胞(Pf4和Vwf)吴旋、髓系細胞(Spi1和Cebpd)和淋巴細胞(Flt3和Satb1)的代表性TF或標(biāo)記基因在不同的tMPPs上表達可能觸發(fā)移植后譜系分化损肛。
與穩(wěn)態(tài)下相比，移植后tMPPs(簡稱TxtMPPs)表現(xiàn)出應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因Ifitm3荣瑟、S100a6和Serpina3g的上調(diào)治拿，B細胞分化基因Ramp1、Cd52和Pnp的下調(diào)(圖5f,g)笆焰。氧化磷酸化劫谅、剪接體和RNA轉(zhuǎn)運途徑與1周內(nèi)tMPPs的動態(tài)變化有關(guān)。表面蛋白CD201嚷掠、CD150和CD48的表達變化支持移植后1周內(nèi)的細胞類型轉(zhuǎn)變(圖5h)捏检〖槔總的來說迎变，這些結(jié)果表明，Tx tMPPs中髓系和紅系分化穩(wěn)定鸭叙，而淋巴細胞分化受到抑制霹娄。
4能犯、對tHSC 豐度逐漸降低的功能驗證
使用單細胞集落形成試驗和二次移植來檢測供體細胞移植后的植入和分化潛能。與新鮮HSC相比犬耻，供體細胞的集落形成率降低(第1踩晶、3、5和7天枕磁，供體細胞的集落形成率分別為12.93±5.85%渡蜻、23.95±6.66%、10.05±3.95%和21.2±4%透典，而新鮮HSC的集落形成率為62.34±8.34%)(圖6a)晴楔。細胞從第1天和第3天生成50-80%非常小(直徑<0.3毫米)和小(直徑在0.3-1毫米)克隆,而細胞從第5天和第7天生成50-60%中型(直徑1-2毫米)和大型(>2毫米直徑)克隆(圖6b)。此外峭咒，第1天和第3天供體細胞的多譜系菌落(中性粒細胞税弃、巨噬細胞、紅細胞和巨核細胞)與新鮮HSC相當(dāng)凑队，而第5天和第7天供體細胞的多譜系潛能略有下降(圖6c)则果。重要的是，第1天從受體骨髓和脾臟中回收的GFP+細胞在二次移植中表現(xiàn)出持續(xù)的多譜系植活度漩氨。同時西壮，在第3、5叫惊、7天恢復(fù)的細胞中款青，即使收集到更多的細胞，重構(gòu)效率和植入水平也逐漸下降(圖6d)霍狰。這些數(shù)據(jù)表明抡草，移植后HSC匹配的概率立即下降饰及，與scRNA-seq分析的結(jié)果一致。盡管大多數(shù)注射的造血干細胞在其轉(zhuǎn)錄組譜基礎(chǔ)上類似MPPs康震，第1天(未分裂)收集的細胞仍然具有HSC的長期移植能力燎含。
5、HSC移植后產(chǎn)生髓樣前體和紅系細胞前體細胞
令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是移植后造血干細胞tMEs和tGMs的早期分化(圖3g,h)腿短。在供體總細胞中屏箍，tMEs和tGMs的頻率在第1天達到約10%，然后在第3天和第5天急劇下降到0%橘忱，但在第7天再次上升到10%(圖7a)赴魁。
流式細胞術(shù)分析顯示，第1天和第7天的Ter119+和Mac-1+Gr-1+細胞分別占20%和10%(圖7b)钝诚。這些數(shù)據(jù)表明尚粘，移植后HSC可能最早在第1天通過“旁路”途徑直接程序化進入紅系和髓系，這與最近的一項研究一致敲长，即HSC分化可以發(fā)生在第一次細胞分裂之前。
單細胞反轉(zhuǎn)錄定量PCR (qRT-PCR)顯示秉继，供體Ter119+細胞在第1天表現(xiàn)出更高的干細胞相關(guān)基因(Kit祈噪、Slamf1、Fgd5和Gata2)尚辑、巨核細胞(Pf4和Selp)和紅系基因(Lmo2和Tal1)的表達辑鲤。供體Mac-1+Gr-1+細胞表現(xiàn)出類似髓系基因表達(Csf1r、Csf2rb和Csf3r)(圖7c)杠茬。此外月褥，免疫應(yīng)答相關(guān)基因第1天在tMEs中高表達，第7天靶向膜蛋白相關(guān)基因的表達水平升高(圖7d)瓢喉。這些數(shù)據(jù)表明宁赤，tMEs第1天的不成熟狀態(tài)可能是由微環(huán)境中應(yīng)激反應(yīng)觸發(fā)。與外周血(PB)血清中穩(wěn)態(tài)對照相比栓票，紅細胞生成素(EPO)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)這兩種主要的生長因子分別參與紅細胞分化和髓系分化决左，在移植后紅細胞生成素(EPO)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的蛋白水平顯著升高(圖7e,f)。升高的細胞因子水平可促進有限的譜系分化走贪。因此佛猛，移植后tMPP2、tMPP3坠狡、tCP1继找、tME1和tGM1中Ifitm1的表達顯著增加，表明紅系和髓系分化程序激活逃沿∮ざ桑總的來說幻锁，這些數(shù)據(jù)證實移植后造血干細胞和/或骨髓基質(zhì)細胞存在早期的紅細胞和骨髓細胞偏倚分化，但這些“分化”細胞仍然保持某些未成熟的特征缩搅，它們的生理作用和意義越败，尤其是在壓力或損傷條件下，值得進一步研究硼瓣。
討論
- 本研究中得到的scRNA測序的數(shù)據(jù)為造血系統(tǒng)不同分化階段和譜系的細胞分類提供了參考究飞。該分類，顯示成年骨髓中造血譜系分化早在tHSC和tMPP階段就已開始發(fā)生堂鲤。大多數(shù)移植的造血干細胞均偏向于tMPP亿傅，并傾向于分化為類紅系-巨核細胞和髓系。
- 本文著重研究那些能夠存活并成功歸巢的移植細胞的特征和功能瘟栖。關(guān)于供體來源的造血干細胞的行為葵擎，盡管轉(zhuǎn)錄分析和功能評估均表明，移植細胞的增殖伴隨造血干細胞豐度逐漸降低半哟。但其增殖酬滤，分化和干性維持存在平衡。
- 移植后的貢獻可能來自于第1天和第3天保留的造血干細胞寓涨，但不能排除某些分化的細胞可能在移植后較晚時間點（第一周之后）恢復(fù)到造血干細胞狀態(tài)的可能性盯串，這當(dāng)然值得進一步研究。
綜上戒良，本研究基于免疫表型体捏、轉(zhuǎn)錄組特征和功能三個方面更加全面地定義了造血系統(tǒng)21個細胞群體，建立了穩(wěn)態(tài)下造血細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜糯崎，首次揭示了HSC移植后早期動態(tài)變化過程几缭。
