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胎肝數(shù)據(jù)再利用：鏈接
數(shù)據(jù)獲劝儆睢：E-MTAB-7407
胎兒肝造血作用對造血干細(xì)胞與多能祖細(xì)胞的自我更新和分化有重要影響。作者利用scRNA-seq檢測了約14萬個肝臟細(xì)胞秧耗、7.4萬個皮膚钉迷、卵黃囊和腎臟細(xì)胞绸硕，鑒定出了人類發(fā)育過程中的血液和免疫細(xì)胞的變化過程：他們從HSC/MPPs群中推斷細(xì)胞分化軌跡，評估組織微環(huán)境對血細(xì)胞和免疫細(xì)胞發(fā)育的影響哗戈。作者發(fā)現(xiàn)：胎兒皮膚中存在生理性紅細(xì)胞生成郊艘；卵黃囊中存在肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞唯咬、先天淋巴細(xì)胞前體存在纱注；在妊娠過程中，胎兒肝臟的主要造血成分發(fā)生變化胆胰，不再以紅細(xì)胞為主奈附；同時伴有HSC/MPPs分化潛能的平行變化。
胚胎原始血細(xì)胞和免疫細(xì)胞來源于胚外組織煮剧，在受孕2-3周（PCW）后由卵黃囊產(chǎn)生斥滤；3-4周后主動脈-性腺-中腎小管（AGM）祖細(xì)胞開始產(chǎn)生。卵黃囊和AGM祖細(xì)胞在肝臟等胎兒組織中定植勉盅，肝臟承擔(dān)胎兒主要的造血功能直至孕中期佑颇。胎兒骨髓在11 PCW 左右開始定植，20 PCW 后成為造血主要部位草娜。卵黃囊挑胸、AGM、胎兒肝和骨髓衍生的免疫細(xì)胞宰闰，包括其周圍的非淋巴組織茬贵，其成熟過程均由組織微環(huán)境所決定簿透。
該研究采用scRNA-seq，繪制了7-17 PCW 胎兒肝臟細(xì)胞分子狀態(tài)解藻，并通過實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)錄表型進(jìn)行驗(yàn)證老充。此外，通過比較胎兒肝中的免疫細(xì)胞與卵黃囊中的免疫細(xì)胞以及皮膚和腎臟中的典型NLTs螟左，構(gòu)建了胎兒免疫發(fā)育網(wǎng)絡(luò)啡浊。
胎肝單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組概況
作者制備了7-17 PCW 胚胎和胎肝單細(xì)胞懸液以研究胎肝血液及免疫細(xì)胞的發(fā)育變化。用 FACS 分選 CD45+ 和 CD45? 細(xì)胞胶背，送 10x 和 smart-seq2 單細(xì)胞測序巷嚣。為了綜合評估 NLTs 和卵黃囊中血液及免疫細(xì)胞狀態(tài)，同時分選了胎兒皮膚钳吟、腎臟和卵黃囊細(xì)胞廷粒。
總體來看，肝臟細(xì)胞分選138,575個红且，另有小部分用來做smart-seq2评雌，皮膚細(xì)胞分選54,690個，腎臟細(xì)胞9,643個直焙，卵黃囊細(xì)胞10,071個用于測序景东。
對胎肝單細(xì)胞數(shù)據(jù)，作者采用了Louvain（基于層次聚類的圖聚類）方法對細(xì)胞進(jìn)行聚類奔誓，同時鑒定了相應(yīng)差異基因斤吐。為了盡可能去除批次效應(yīng)同時保留生物學(xué)變化，作者利用Harmony對采自四個階段的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了校正整合：
作者將胎肝細(xì)胞分為27類厨喂，VCAM1+ 成紅細(xì)胞血島中心巨噬細(xì)胞由于與周圍紅細(xì)胞互作而被單獨(dú)歸為一類細(xì)胞和措；所有類型的細(xì)胞在各發(fā)育階段均被發(fā)現(xiàn)，但是各階段數(shù)目不等蜕煌。此外派阱，樣本未檢出中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞斜纪、嗜堿性粒細(xì)胞贫母，這與粒細(xì)胞出現(xiàn)自胎兒骨髓造血時期的現(xiàn)象相吻合；樣本早期以紅系細(xì)胞為主盒刚，晚期則淋巴細(xì)胞與骨髓細(xì)胞增多腺劣。
數(shù)據(jù)集可靠性驗(yàn)證
作者篩選了在所有clusters中均差異表達(dá)的48個基因(log(fold change) > 0.5)，隨后用這48個基因通過隨機(jī)森林預(yù)測細(xì)胞states因块，精確率和召回率均值達(dá)到89%橘原。接著作者利用編碼細(xì)胞不同表面蛋白基因?qū)?xì)胞進(jìn)行分離，用smart-seq2 對分離細(xì)胞進(jìn)行了簡單驗(yàn)證；FACS分離的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上與野生型細(xì)胞一致趾断。
接下來作者觀察了紅系細(xì)胞、肥大細(xì)胞芋酌、髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的空間分布增显，肝臟基本結(jié)構(gòu)在8-17 PCW 間逐漸形成；雖然環(huán)繞門靜脈和中央靜脈的肝小葉尚不能被明顯區(qū)分隔嫡，但是總體肝組織呈增加態(tài)勢甸怕；造血島浮現(xiàn)于血竇及周邊肝組織中甘穿，血竇CD68+ 巨噬細(xì)胞被血型糖蛋白A紅系細(xì)胞包裹腮恩；來自B細(xì)胞系的CD1c+樹突細(xì)胞和CD79a+、CD20+細(xì)胞零散分布温兼。從scRNA-seq 表達(dá)譜來看秸滴，這些細(xì)胞總體更接近造血細(xì)胞（21、22募判、23）而與肝細(xì)胞距離較遠(yuǎn)（27）荡含；這可能與體外分離的肝細(xì)胞較為脆弱且高表達(dá)線粒體基因有關(guān)。以上工作皆為驗(yàn)證該數(shù)據(jù)集的準(zhǔn)確性而開展届垫。
胎肝及NLT造血作用分析
隨后作者推斷出了造血發(fā)生軌跡释液。運(yùn)用力導(dǎo)向圖算法，作者鑒定出了以HSC/MPP為中心的三個連接對象：紅系細(xì)胞-巨核細(xì)胞-肥大細(xì)胞装处、B 細(xì)胞/先天淋巴細(xì)胞/T淋巴細(xì)胞误债、髓系細(xì)胞；隨后用PAGA算法佐證了這一結(jié)果妄迁。
基因動態(tài)修飾在紅系細(xì)胞寝蹈、肥大細(xì)胞、巨核細(xì)胞三類細(xì)胞是明顯不同的：紅系細(xì)胞特異TAL1登淘、KLF1箫老，巨核細(xì)胞特異F11R、PBX1和MEIS1黔州，肥大細(xì)胞特異HES1耍鬓。隨后作者使用CellPhoneDB預(yù)測了成紅細(xì)胞和VCAM1+ EI 巨噬細(xì)胞間的互作情況，其中VCAM1流妻、ITGB1界斜、ITGA4、SIGLEC1合冀、ICAM4和SPN顯著互作各薇，而這些基因在造血過程中發(fā)揮重要作用。隨后，作者通過免疫熒光鑒定出了VCAM1存在于EI 巨噬細(xì)胞中峭判，ITGA4存在于早中期紅系細(xì)胞中开缎；此外，通過FACS發(fā)現(xiàn)了VCAM1+ EI 巨噬細(xì)胞與成紅細(xì)胞存在互作林螃，這可能說明VCAM1+ EI 巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜是紅系細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的結(jié)合（見下圖dotplot）奕删。小鼠中也有類似表型。
與造血組織相比疗认，卵黃囊內(nèi)也存在肥大細(xì)胞完残，成紅細(xì)胞開始表達(dá)血紅蛋白基因，且在卵黃囊中横漏，成紅細(xì)胞表達(dá)HBZ和HBE1基因谨设，到了肝臟中則轉(zhuǎn)換為表達(dá)HBA1和HBG2。
巨核細(xì)胞缎浇、紅系細(xì)胞扎拣、肥大細(xì)胞及他們的祖細(xì)胞均在NLTs被檢出，而HSC/MPPs則未被發(fā)現(xiàn)素跺。隨后作者比較了胎肝二蓝、皮膚和腎臟相應(yīng)細(xì)胞類型中的高表達(dá)和差異表達(dá)基因，肥大細(xì)胞指厌、巨核細(xì)胞刊愚、紅系細(xì)胞基因表達(dá)相關(guān)性高，這種結(jié)果可能是NLT中祖細(xì)胞原位分化成熟或是不同階段細(xì)胞在某組織中集結(jié)所致踩验。
紅系細(xì)胞在腎臟中未被檢出鸥诽，這表明在某些特定部位MEMps（三類細(xì)胞祖細(xì)胞）的分化是嚴(yán)格受限的；在CD34+血管內(nèi)外均發(fā)現(xiàn)有GYPA+有核細(xì)胞存在晰甚，這表明MEMPs是原位成熟分化的衙传，激光層照熒光結(jié)果支持了這一結(jié)論。MKI67和細(xì)胞周期基因的表達(dá)表征了MEMP在NLT中的增殖能力較弱厕九；而皮膚MEMPs表達(dá)了包括MYL4在內(nèi)的一些早期成紅細(xì)胞基因蓖捶，表明MEMPs可能在皮膚中起著紅系祖細(xì)胞的作用。這表示在早期發(fā)育過程中扁远，正常皮膚可以促進(jìn)紅細(xì)胞生成俊鱼，作為胎肝紅系細(xì)胞的補(bǔ)充。
胎肝及NLT中的淋巴細(xì)胞系分析
此前有相關(guān)報道畅买，人胎肝中存在T細(xì)胞并闲、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和先天淋巴細(xì)胞谷羞。本研究發(fā)現(xiàn)胎肝淋巴細(xì)胞存在兩個分支：一組為NK–T–ILC系帝火，一組為B細(xì)胞系溜徙。早期淋巴樣及T淋巴細(xì)胞群因妊娠期而異，在胸腺T細(xì)胞成熟之前犀填，該群細(xì)胞表達(dá)GATA3蠢壹、KLRB1、CD3D九巡、CD7和JCHAIN图贸，具體見下圖：
在妊娠早期，該群（早期淋巴樣及T淋巴細(xì)胞群）可能含有早期胸腺祖細(xì)胞（ETPs）冕广，當(dāng)與胸腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)時疏日，該群可生成αβ?T細(xì)胞。在12-14 PCW階段撒汉，細(xì)胞表達(dá)TRDC和TRAC沟优，但不表達(dá)GZMB或PRF1，而后者是成熟CD8 + T細(xì)胞的胞質(zhì)顆粒marker神凑；而在15-17 PCW期未見TRDC表達(dá)净神。該發(fā)現(xiàn)與γδ-T細(xì)胞和αβ-T細(xì)胞在12 PCW后從胸腺中遷出而依次植入胎兒肝臟的情況相一致何吝，且與之前研究T細(xì)胞鑒定僅可在18 PCW后進(jìn)行的結(jié)果相一致溉委。
根據(jù)PAGA和擴(kuò)散映射降維結(jié)果，NK細(xì)胞（marker：NCAM1爱榕，CD7瓣喊，IL2RB、CD3E）和ILC前體細(xì)胞（marker：KIT黔酥，KLRB1藻三，IL7R和RORC）在淋巴分支中具有共同的起源。
B細(xì)胞譜系內(nèi)包含了連續(xù)分化的細(xì)胞：從表達(dá)CD34, SPINK2 和 IGLL1的原始‘pre pro-B’細(xì)胞到MS4A1, CD79B, DNTT,HLA-DRA等基因表達(dá)量升高及JCHAIN 跪者、LTB表達(dá)量下降的趨近B細(xì)胞特性的祖B細(xì)胞（Pro-B）和前B細(xì)胞（Pre-B）棵帽。祖B細(xì)胞（Pro-B）和前B細(xì)胞（Pre-B）核質(zhì)比較高，且有未成熟的染色質(zhì)和核仁包含其中（下圖）渣玲。在HSC/MPP向B細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中逗概，差異調(diào)控基因包括SPIB、SP100和CTSS忘衍。前B細(xì)胞可在7-8 PCW間檢測到而成熟B細(xì)胞僅可在9 PCW后檢測到逾苫。
此外，作者分析在妊娠期Kupffer細(xì)胞中HSC/MPP中NFKBIA（一種NF-κB的抑制劑）的表達(dá)下降枚钓，而TNFSF13B（BAFF）的表達(dá)增加铅搓，NF-κB和BAFF是已知的B細(xì)胞存活與分化因子。具體關(guān)于控制胎兒肝臟中B細(xì)胞分化的細(xì)胞內(nèi)因素與組織微環(huán)境因素則尚不明確搀捷。
與肝臟及卵黃囊相比星掰，NLTs中存在祖B細(xì)胞、前B細(xì)胞與成熟B細(xì)胞，但不存在HSC/MPPs和前祖B細(xì)胞（pre pro-B）氢烘。NLTs中的早期淋巴/T淋巴細(xì)胞便斥、NK細(xì)胞和先天免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征與肝臟中同等細(xì)胞相同，而趨化因子與毒性顆粒的基因組織特異表達(dá)表明NK細(xì)胞的成熟與組織適應(yīng)發(fā)生于腎臟與皮膚中威始。NLTs中的ILC前體缺乏其成熟產(chǎn)物：ILC1枢纠，ILC2和ILC3的全套Markers，但是卵黃囊中也存在NK細(xì)胞和ILC前體黎棠。這表明NLTs是由胎肝和卵黃囊的NK細(xì)胞和ILC前體細(xì)胞產(chǎn)生的晋渺，它們原位分化，表現(xiàn)出組織特異性脓斩。
髓樣細(xì)胞的組織特征
小鼠發(fā)育軌跡分析已經(jīng)證實(shí)木西，組織內(nèi)巨噬細(xì)胞是由卵黃囊和胎肝祖細(xì)胞產(chǎn)生的，而DC細(xì)胞則來自骨髓衍生的HSC/MPPs随静，其獨(dú)立于單核細(xì)胞譜系八千。相較于人，早在7 PCW時燎猛，已可以觀察到胎兒肝臟和NLT中的髓樣祖細(xì)胞恋捆，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞以及DC1和DC2細(xì)胞簇重绷。
發(fā)源自HSC/MPP的髓系細(xì)胞藉由三個中間體產(chǎn)生：表達(dá)CD34沸停，SPINK2，AZU1昭卓，PRTN3愤钾，ELANE，MPO和LYZ的嗜中性粒細(xì)胞祖細(xì)胞候醒；單核細(xì)胞前體能颁；DC細(xì)胞前體。
其中倒淫，DC1不同于嗜中性粒細(xì)胞祖細(xì)胞和與DC2密切相關(guān)的DC前體伙菊，DC分化涉及CLEC11A，BATF3和ID2的動態(tài)調(diào)節(jié)昌简，而單核細(xì)胞分化涉及S100A8 / A9占业，F(xiàn)CGR1A / 2A和S100A12的動態(tài)調(diào)節(jié)。漿細(xì)胞樣DC（pDC）前體從早期前髓樣細(xì)胞和前祖B細(xì)胞中分離出來纯赎，與小鼠中淋巴樣和髓樣來源混合的報道一致谦疾。作者比較了胎盤、卵黃囊和胎肝中的單核細(xì)胞犬金、巨噬細(xì)胞及推定的對應(yīng)前體細(xì)胞發(fā)現(xiàn)念恍，巨噬細(xì)胞表達(dá)譜具有高度組織特異性六剥，且與同組織內(nèi)其他巨噬細(xì)胞的亞型有一定關(guān)聯(lián)性，難以進(jìn)行細(xì)胞溯源峰伙。
皮膚和腎臟中均存在單核細(xì)胞疗疟、巨噬細(xì)胞、pDC瞳氓、DC1和DC2細(xì)胞策彤；其中NLT單核細(xì)胞和DC細(xì)胞與胎肝中的單核細(xì)胞和DC細(xì)胞高度相關(guān)，而巨噬細(xì)胞更具組織特異性：對成人巨噬細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)匣摘，肝巨噬細(xì)胞表達(dá) VCAM1 而皮膚巨噬細(xì)胞表達(dá) F13A1店诗。對于DC細(xì)胞而言，其組織特異性表達(dá)模式與其在不同組織中行使不同功能相對應(yīng)音榜，即在不同組織中發(fā)揮不同功能的DC細(xì)胞庞瘸，具有組織特異性。如S100A4（T細(xì)胞活化因子）在皮膚DC1細(xì)胞中特異表達(dá)赠叼，而AOAH（編碼參與調(diào)節(jié)脂多糖反應(yīng)的酶）在肝臟DC2細(xì)胞中特異表達(dá)擦囊。這表明胎兒DC細(xì)胞在介導(dǎo)耐受性方面發(fā)揮積極作用。
HSC/MPP分化潛能
通過FDG可視化分析發(fā)現(xiàn)嘴办，該細(xì)胞群以表達(dá)CLEC9A瞬场、HLA-DRA和最高水平的“ primitive”基因（包括MLLT3）為基礎(chǔ)，該特征與可長期傳代的專能干細(xì)胞（LT）-HSC細(xì)胞群一致户辞。通過差異基因分析和監(jiān)督聚類發(fā)現(xiàn)泌类，HSC / MPP細(xì)胞簇的基因表達(dá)介于LT-HSC和早期祖細(xì)胞之間癞谒，類似于激發(fā)態(tài)HSC底燎。
作者此處假設(shè)胎肝細(xì)胞的組份是由在HSC / MPP 基礎(chǔ)上，對其多能性進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)而產(chǎn)生的弹砚。為了證明這一猜想双仍，作者分離了CD34+ CD38+、CD34+ CD38- CD45RA- 桌吃、CD34+ CD38? CD45RA+ 三類細(xì)胞朱沃，分別進(jìn)行smart-seq2 測序和單克隆培養(yǎng)。通過胎肝數(shù)據(jù)集訓(xùn)練的支持向量機(jī)算法確定了CD34+CD38- 細(xì)胞主要為HSC / MPP（約85％）茅诱；CD34+ CD38- CD45RA+ 的大多數(shù)細(xì)胞也被分類至HSC / MPP群中逗物。這與已報道的HSC / MPP和MLP之間的轉(zhuǎn)錄相似性以及作者鑒定出HSC / MPP區(qū)室中的淋巴結(jié)果吻合。
CD34+ CD38- CD45RA- 的HSC / MPPs單細(xì)胞培養(yǎng)能長出單能細(xì)胞和專能細(xì)胞克隆瑟俭。隨著胎齡增加翎卓，細(xì)胞所能產(chǎn)生的三類克隆（紅系細(xì)胞摆寄、NK細(xì)胞失暴、髓樣細(xì)胞或巨噬細(xì)胞）數(shù)越來越少（說明干性下降）坯门。隨著胎齡的增加，紅系細(xì)胞克隆越來越少逗扒，而含有NK細(xì)胞和B細(xì)胞的克隆則隨之增加古戴。
、
胎肝中不到9 PCW的HSC / MPP幾乎不產(chǎn)生B細(xì)胞矩肩，與這一階段B細(xì)胞少的情況相吻合现恼。這些發(fā)現(xiàn)表明不同妊娠階段的HSC / MPP確實(shí)存在多能性差異，佐證了妊娠早期紅系細(xì)胞占優(yōu)和而晚期淋巴細(xì)胞增多的現(xiàn)象黍檩。
綜合比較發(fā)育過程中多種造血組織的HSC / MPPs和早期祖細(xì)胞發(fā)現(xiàn)述暂，卵黃囊和胎兒肝祖細(xì)胞和HSC / MPPs的 MKI67 表達(dá)更高，增殖潛力更強(qiáng)建炫。細(xì)胞周期染色亦證實(shí)了這一結(jié)果畦韭。此外，胎肝HSC / MPPs的比例隨胎齡增加而增大肛跌，表明胎兒的生命正逐漸消逝艺配。胎肝HSC / MPPs中熱休克蛋白的基因（HSPA1A）表達(dá)較高，這可能是為了維持基因組和蛋白質(zhì)組的完整性衍慎；而MHC-1（HLA-B）的含量較低转唉，這說明，與臍帶血及成人骨髓中的HSC / MPPs相比稳捆，胎肝的抗原遞呈能力較低赠法。
以上結(jié)果表明，HSC / MPP數(shù)量乔夯、增殖和分化潛能的內(nèi)在變化發(fā)生在妊娠前倆階段砖织。這些變化可能對胎肝造血功能適應(yīng)發(fā)育中胎兒的需求非常重要。
總結(jié)
提出了關(guān)于血液末荐、胎肝侧纯、卵黃囊，皮膚和腎臟免疫發(fā)生發(fā)展的動態(tài)圖譜甲脏。發(fā)現(xiàn)：胎兒皮膚中有生理性紅細(xì)胞生成搀玖；早在7 PCW時已建立DC細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)异逐；pDC可能有髓樣和淋巴樣細(xì)胞起源；卵黃囊可產(chǎn)生肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞顽聂、ILCs硫戈；且NK 細(xì)胞倍谜、ILCs瓢省、 DCs和巨噬細(xì)胞在發(fā)育過程中產(chǎn)生了對應(yīng)的組織特異性；揭示了在妊娠期間抖棘，HSC / MPP存在分化潛能調(diào)節(jié)茂腥，這可能是妊娠早期調(diào)節(jié)胎兒肝臟造血輸出的附屬機(jī)制狸涌。
細(xì)胞全家福
