哈嘍大家好呀展氓，喵學姐又又又來讀文獻了穆趴，今天給大家講解一篇做的非常全面的腫瘤方向高分生信文章

標題：

Construction and validation of a cuproptosis-related

prognostic model for glioblastoma

期刊：

研究背景

膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma, GBM)：根據(jù)傳統(tǒng)的組織病理學特征，膠質(zhì)瘤可被分為WHOⅠ-Ⅳ型遇汞。GBM屬于膠質(zhì)瘤中WHOⅣ型未妹，其是最具侵襲性的膠質(zhì)瘤。

銅死亡(Cuproptosis)是一種新型的程序性細胞死亡形式空入，其不同于細胞凋亡络它、焦亡和鐵死亡。有研究表明歪赢，在銅凋亡過程中化戳，Cu2+與線粒體呼吸鏈中三羧酸循環(huán)的硫辛酰化組分結(jié)合埋凯，導(dǎo)致硫辛醯懵ィ化蛋白聚集和鐵硫簇蛋白下調(diào)，隨后發(fā)生蛋白毒性應(yīng)激和細胞死亡白对。

此外掠廓，基于cuproptosis的預(yù)后模型已經(jīng)發(fā)表在多種腫瘤中，包括頭頸部鱗狀細胞癌甩恼、三陰性乳腺癌蟀瞧、肺腺癌沉颂、腎透明細胞癌、黑色素瘤悦污、肝細胞癌和低級別膠質(zhì)瘤铸屉，可準確預(yù)測患者預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境以及對化療或免疫治療的反應(yīng)切端。然而抬探，在GBM中尚未報道與銅死亡相關(guān)的預(yù)后模型。

思路亮點

1.該文章對同一數(shù)據(jù)集進行了兩次一致性聚類分析帆赢，一次是根據(jù)銅死亡進行一致性聚類分析小压，另一次是根據(jù)差異基因進行一致性聚類分析。

2.該文章的免疫分析比較全面椰于，包括了免疫細胞浸潤怠益、免疫微環(huán)境、免疫檢查點瘾婿、CSC指數(shù)蜻牢、TMB和藥物敏感性。

研究解讀

Step.0

思路圖

▲圖1：研究設(shè)計的流程圖

Step.1

數(shù)據(jù)收集

作者從TCGA數(shù)據(jù)庫下載TCGA-GBM偏陪，從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE83300和GSE74187數(shù)據(jù)集抢呆。其中GSE8330數(shù)據(jù)集中包括50例GBM患者，GSE74187數(shù)據(jù)集中包括60例GBM患者笛谦。由于樣本量較少抱虐，作者首先對原始文件進行校正和分位數(shù)歸一化，然后通過“Combat”算法消除批處理效應(yīng)后將數(shù)據(jù)集合并饥脑。研究共收集了209例GBM患者恳邀，其中包含了詳細的臨床信息，包括年齡灶轰、性別谣沸、總生存時間乳讥、生存狀態(tài)和IDH1突變狀態(tài)帆喇。

Step.2

銅死亡亞型的鑒定

▲圖2：銅死亡亞型的鑒定以及兩種亞型之間臨床特征和CRGs表達水平的比較。

首先色罚，作者從已發(fā)表的文獻中收集得到了12銅死亡相關(guān)基因(CRG)(圖2A)伴澄。其次赋除，作者根據(jù)5種預(yù)后CRG的表達譜，采用一致性聚類分析對GBM樣本進行分類秉版。圖2B顯示贤重，k=2是最優(yōu)的分類方法茬祷，最終GBM樣本被分為CRGclusterA(樣本數(shù)=119)和CRGclusterB(樣本數(shù)=90)清焕。此外，PCA分析表明兩種亞型銅死亡轉(zhuǎn)錄譜不同，該結(jié)果進一步驗證了聚類的結(jié)果(圖2C)秸妥。然后滚停，作者利用Kaplan-Meier生存分析探索不同銅死亡亞型預(yù)后的情況，結(jié)果表明CRGclusterA中的樣本比CRGclusterB中的樣本具有更長的總生存(Overall survival, OS)(圖2D)粥惧。進一步键畴，作者通過熱圖比較兩種亞型的臨床特征的情況，結(jié)果表明未觀察到年齡和性別的明顯差異(圖2E)突雪。最后起惕，作用通過Pearson系數(shù)檢驗探究不同CRG在不同亞型的表達情況，結(jié)果表明CRGclusterA中的CRGs表達水平高于CRGclusterB(圖2F)咏删。

Step.3

不同銅死亡亞型中腫瘤微環(huán)境的特征

▲圖3：腫瘤微環(huán)境與兩種銅死亡亞型的相關(guān)性惹想。

為了進一步探索了不同銅死亡亞型中免疫微環(huán)境的不同，作者首先基于ssGSEA算法獲得了每個GBM樣本中23種免疫細胞的相對含量督函。并通過Pearson系數(shù)檢驗驗證不同銅死亡亞型與23種免疫細胞的關(guān)系嘀粱，其結(jié)果表明不同銅死亡亞組的MDSCs，CD56 natural killer cells辰狡，macrophages锋叨，eosinophils，type 2 T helper cells宛篇，mast cells, monocytes娃磺，and CD56 natural killer cells的免疫細胞含量存在差異(圖3A)。其次叫倍，不同銅死亡亞組與免疫檢查點Pearson系數(shù)檢驗的結(jié)果表明豌鸡，PD-L1在CRGclusterB中的表達低于CRGclusterA，而大多數(shù)CRGs在CRGclusterA中的表達水平高于CRGclusterB(圖3B)段标。此外涯冠，使用ESTIMATE算法，作者獲得了每個GBM樣本的TME分數(shù)逼庞，包括ImmuneScore蛇更、StromalScore和ESTIMATEScore。ImmuneScore表示免疫成分的含量赛糟，StromalScore表示矩陣成分的含量派任，ESTIMATEScore是兩者的總和。差異分析結(jié)果顯示璧南，CRGclusterB TME評分略高掌逛，但差異無統(tǒng)計學意義(圖3C)。

Step.4

預(yù)后差異基因的鑒定和基于亞型的分類

作者通過R語言limma包對不同銅死亡亞型進行了差異分析司倚，共獲得360個與銅死亡亞型相關(guān)的差異表達基因豆混。其次篓像，通過單因素COX回歸分析對360個差異基因進行篩選，最終獲得了與GBM患者預(yù)后相關(guān)的79個差異基因皿伺。然后员辩，利用79個差異基因表達譜采用一致性聚類分析對GBM樣本進行分類。GBM樣本被分為geneClusterA和geneClusterB兩個亞型(圖4A)鸵鸥。Kaplan-Meier曲線顯示geneClusterB中的GBM樣本比geneClusterA中具有更長的OS(圖4B)奠滑。通過比較兩種亞型的臨床特征，未觀察到年齡和性別的明顯差異妒穴。雖然大多數(shù)預(yù)后DEGs在geneCluster A中的表達水平高于geneCluster B(圖4C)宋税。geneCluster A 和 geneCluster B 之間 12 個 CRG 的差異表達分析顯示在圖5D。

Step.5

建立并驗證風險評分模型

▲圖5：在訓練集中構(gòu)建風險評分模型

根據(jù)銅死亡亞型相關(guān)DEGs讼油，建立預(yù)后風險評分模型弃甥。圖5A顯示不同分類方法的GBM樣本分布。首先汁讼，作者將209例GBM樣本分為訓練集和測試集淆攻，其數(shù)量分別為105例和104例。其次嘿架，對79個差異基因進行LASSOS回歸分析瓶珊，獲得7個風險模型候選基因(圖5B-C)。此外耸彪，對7個風險模型候選基因進行多因素COX分析伞芹，最終獲得5個靶基因，并構(gòu)建風險評分模型(Risk=0.2988*PDIA+0.1705*PILRB+0.2448*DUSP6+0.3055*PTPRN-0.2095*CBLN1)蝉娜。差異分析的結(jié)果顯示geneCluster A和CRGcluster A的風險評分分別高于geneCluster B和CRGcluster B（圖 5D-E)唱较。在訓練集中，作者進一步根據(jù)中位數(shù)將GBM 樣本分為低風險集群 (n = 53) 和高風險集群 (n = 52)召川。隨著風險評分的增加南缓，GBM患者的OS逐漸降低，死亡人數(shù)穩(wěn)步增加(圖5F)荧呐。圖5G表明PCA 分析可以清楚地區(qū)分了兩個風險集群汉形。生存曲線顯示，低風險組GBM樣本的OS比高風險組長(圖5H)倍阐。此外概疆，ROC曲線表明風險評分模型的預(yù)測效能良好，該模型的 0.5峰搪、1.0 和 1.5 年的 AUC 值分別為 0.643岔冀、0.709 和 0.751(圖5I)。

Step.6

在測試集檢驗風險評分模型

▲圖6：分別在測試集概耻、GSE83300和GSE74187數(shù)據(jù)集中的驗證風險評分

作者利用中位數(shù)風險評分將測試集使套、GSE83300和GSE74187進行分類罐呼。排名點圖的結(jié)果顯示，隨著風險評分的增加童漩，GBM患者的OS逐漸降低，死亡人數(shù)穩(wěn)步增加(圖6A春锋、E矫膨、I)。PCA可以清楚地將兩個風險集群分開(圖6B期奔、F侧馅、J)。在測試集中呐萌，Kaplan-Meier曲線顯示馁痴，低風險組的GBM比高風險組具有更長的OS(圖6C)。在GSE83300數(shù)據(jù)集中肺孤，雖然生存分析結(jié)果未達到統(tǒng)計學意義罗晕，但低風險集群中的GBM樣本傾向于延長OS(圖6G)。在GSE74187數(shù)據(jù)集中赠堵，Kaplan-Meier曲線顯示小渊，低危組GBM的OS比高危組長(圖6G)。在測試集中茫叭，該模型的 0.5酬屉、1.0 和 1.5 年生存率的 AUC 值分別為 0.610、0.671 和 0.708（圖6D)揍愁。在GSE83300數(shù)據(jù)集中呐萨，該模型的 0.5、1.0 和 1.5 年生存率的 AUC 值分別為 0.676莽囤、0.731 和 0.718（圖6H)谬擦。在GSE74187數(shù)據(jù)集中，該模型的 0.5朽缎、1.0 和 1.5 年生存率的 AUC 值分別為 0.619怯屉、0.731 和 0.741（圖6l)。綜合來看饵沧，該模型的預(yù)測患者預(yù)后穩(wěn)定且效果良好锨络。

Step.7

用實驗驗證模型中基因在GBM組織和正常組織的表達情況

▲圖7：通過RT-qPCR和WB驗證5個模型相關(guān)基因在GBM組織和相應(yīng)的正常組織中的表達水平。

Step.8

風險評分模型的臨床相關(guān)性分析和分層分析

▲圖8：風險評分模型的臨床相關(guān)性分析和分層分析

IDH1突變株簇的風險評分低于IDH1野生型簇(圖8A)狼牺。單因素和多因素COX顯示羡儿，風險評分模型和IDH1突變狀態(tài)均可獨立的預(yù)后因素(圖8B-C)。作者利用分層分析是钥，以評估該模型是否具有廣泛的適用性掠归。Kaplan-Meier曲線顯示缅叠，低危組GBM的OS總是比高危組長，年齡小于60歲亞簇p<001虏冻，年齡大于60歲的亞簇p=0.005肤粱，男性亞簇p<0.001，女性亞簇p=0.015厨相，IDH0突變亞簇p<0.001领曼，IDH0 野生型亞簇p=0.003(圖8D-I)。

Step.9

兩個風險評分組之間的TME和檢查點評估

▲圖9：評估TME和兩個風險評分組之間的檢查點

為了探究風險評分與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性蛮穿，作者通過相關(guān)性分析研究風險評分與免疫細胞含量的關(guān)系庶骄，其結(jié)果表明風險評分與調(diào)節(jié)性T細胞、濾泡輔助性T細胞践磅、中性粒細胞单刁、靜息NK細胞和M0巨噬細胞中呈正相關(guān)，與嗜酸性粒細胞府适、M2巨噬細胞羔飞、單核細胞和活化的NK細胞中呈負相關(guān)(圖9A)。此外檐春，免疫細胞含量與5個模型相關(guān)基因表達水平的相關(guān)性分析顯示褥傍，部分免疫細胞與特定基因存在明顯相關(guān)性(圖9B)。此外喇聊，低風險集群中GBM樣本的StromalScore和ESTIMATEScore顯著低于高風險組（圖9C)恍风。最后，對高危集群和低風險集群之間的免疫檢查點進行差異表達分析誓篱。結(jié)果顯示朋贬，15個免疫檢查點在低風險簇中的表達水平低于高危簇，例如PD-1和PD-L1(圖9D)窜骄。

Step.10

評估風險評分與CSC指數(shù)锦募、TMB和藥物敏感性的相關(guān)性

▲圖10：評估風險評分與CSC指數(shù)、TMB和藥物敏感性的相關(guān)性

為了探究風險評分與免疫治療相關(guān)指標的關(guān)系邻遏，作者通過相關(guān)性分析探究風險評分模型與CSC指數(shù)糠亩、TMB和藥物敏感性的相關(guān)性。CSC指數(shù)與風險評分的相關(guān)性分析結(jié)果顯示准验，二者呈負相關(guān)(R = -0.35赎线，P = 6.5e-06)；即低風險評分的GBM患者的干細胞特征更顯著(圖10A)糊饱。一般認為垂寥，TMB高的腫瘤對免疫治療反應(yīng)較好，預(yù)后較好≈拖睿基于TCGA GBM隊列的突變數(shù)據(jù)狭归，鑒別分析表明，高危人群的TMB低于低風險人群(圖10B)文判。其次过椎，TMB與風險評分的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩者呈負相關(guān)(R = -0.048戏仓，p = 0.049疚宇；圖10C).有趣的是，低風險組沒有顯著相關(guān)性(R = 0.044柜去，p = 0.12灰嫉；圖10D)和高危組呈負相關(guān)(R = -0.012拆宛，p = 0.04嗓奢；圖10E)。為了確定體細胞突變的具體分布浑厚，我們構(gòu)建了兩個風險評分組的瀑布圖股耽，高危簇中53個最常突變的基因分別是PTEN、EGFR钳幅、TP1物蝙、TTN、NF16敢艰、MUC3诬乞、PIK2CA、LRP2钠导、RYR1和SPTA(圖10F)震嫉，而低危簇中為TP53、PTEN牡属、TTN票堵、EGFR、MUC16逮栅、ATRX悴势、SPTA1、FLG措伐、IDH1和RYR2(圖10G).低危簇中PTEN特纤、EGFR和NF1的突變頻率低于高危簇，而ATRX侥加、IDH1叫潦、TP53、MUC16和PIK3R1的突變頻率高于高危簇(圖10F、G).此外矗蕊，選擇常用藥物或化合物來檢測藥物敏感性與風險評分之間的關(guān)聯(lián)短蜕。兩個危險簇間IC50值的差異分析結(jié)果顯示，苔蘚抑素傻咖、米多司他林朋魔、米達美替尼、普納替尼和替匹法尼在高危簇中的IC50值低于低危簇卿操。相比之下警检，阿法替尼和依來洛莫在高危集群中的IC50值高于低風險集群。結(jié)果提示藥物敏感性與風險評分(圖10H–N)害淤。

Step.11

構(gòu)建列線圖以預(yù)測生存期

▲圖11：在訓練集中構(gòu)建列線圖

為了探究風險評分模型對預(yù)后的價值扇雕，作者綜合風險評分模型及臨床參數(shù)構(gòu)建了列線圖。其結(jié)果表明窥摄，風險評分模型在GBM患者的預(yù)后中價值顯著(圖11A)镶奉。圖11B-C表明訓練集和測試集ROC曲線都表明風險評分模型對GBM患者預(yù)后預(yù)測性能良好。圖11D-E校準曲線表明崭放，兩組的預(yù)測結(jié)果非常接近理想結(jié)果哨苛。最后，作者還探究了IDH1突變狀態(tài)對GBM患者預(yù)后的預(yù)測效能(圖11F-G)币砂。

結(jié)論

作者通過分析從數(shù)據(jù)庫下載的GBM表達譜和臨床數(shù)據(jù)建峭，構(gòu)建并驗證了基于CRGs的風險評分模型。進一步開發(fā)了列線圖以提高適用性决摧。作者還研究了分類與TME的關(guān)系及其在免疫治療或化療中的指導(dǎo)意義亿蒸。該論文為GBM的預(yù)后預(yù)測和精準治療指導(dǎo)提供了新的思路。