1. Western Blot原理Westernblot的原理是蛋白質(zhì)在電力場(chǎng)的作用 下，由大到小的進(jìn)行排列句携，利用電泳進(jìn)行分離和富集。擁有抗原表位的蛋白質(zhì)分子被抗體（一抗）特異性識(shí)別并與之結(jié)合焰宣。在此基礎(chǔ)上榆芦，酶或熒光標(biāo)記的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗，通過與底物反應(yīng)顯色來觀察目的蛋白粥惧。
Westernblot顯色的方法主要有以下幾種：（1）放射自顯影（2）底物化學(xué)發(fā)光ECL（3）底物熒光ECF（4）底物DAB呈色〖耄現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色。大部分Westernblot顯色底物是化學(xué)發(fā)光底物突雪，發(fā)表文章通常也是用底物化學(xué)發(fā)光ECL起惕。
2. 目的蛋白信號(hào)弱或無
在
Westernblot發(fā)光檢測(cè)中常見的問題之一就是目的蛋白信號(hào)弱或無。首先考慮是否轉(zhuǎn)膜不充分/過轉(zhuǎn)咏删，如果是惹想，則要優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件；其次督函，在轉(zhuǎn)膜合適的前提下考慮是否抗體-抗原敏感性過低嘀粱，也可能是底物HRP或底物活性降低激挪，可以通過加大上樣量/提高抗體濃度/使用敏感底物/延長(zhǎng)壓片時(shí)間解決。凝膠太厚草穆，曝光時(shí)間短也會(huì)使蛋白信號(hào)降低灌灾，因此，要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間和膠片的曝光時(shí)間悲柱。
3. 非特異性條帶????? 非特異性條帶與抗體交叉反應(yīng)有關(guān)锋喜。單抗比多抗特異性好，純度高豌鸡，另外適當(dāng)稀釋一抗/二抗?jié)舛群侔悖彩怯斜匾摹Ｈ绻麡颖驹谔幚磉^程中發(fā)生降解涯冠，則樣本處理時(shí)加入蛋白抑制劑在冰上操作炉奴。
4. 顯影后膜上條帶處變?yōu)辄S色或白色可能是HRP過高導(dǎo)致的敏感性或背景太高，應(yīng)降低抗體濃度蛇更。5. 條帶內(nèi)無顯影的白點(diǎn)
一般是與轉(zhuǎn)膜和顯影的操作有關(guān)瞻赶，轉(zhuǎn)膜前盡量將膜平衡，并注意膠和膜之間避免氣泡派任，顯影時(shí)膜與X光片間也應(yīng)避免氣泡砸逊。
6.存在散在小圓斑
?牛奶封閉液中的雜質(zhì)顆粒導(dǎo)致，解決此類問題可提前配置好封閉液于4度保存掌逛，使用時(shí)勿混勻师逸，僅用上層。
7. Western Blot化學(xué)發(fā)光(ECL)淬滅的原因豆混？
Western Blot“淬滅”的原因主要在兩方面：含HRP的抗體和發(fā)光試劑篓像。由于長(zhǎng)期應(yīng)用某種發(fā)光試劑，人們多注意了抗體皿伺，不知道發(fā)光試劑其實(shí)也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成重大影響员辩。對(duì)抗體方面來說，可以采用適當(dāng)降低抗體的濃度鸵鸥，發(fā)光實(shí)驗(yàn)時(shí)快速操作來解決“淬滅”的問題屈暗；對(duì)發(fā)光試劑來說，可以選用發(fā)光穩(wěn)定的發(fā)光試劑來解決“淬滅”的問題脂男。
8. Western Blot背景太高
?????? 背景深是在Western blot發(fā)光檢測(cè)中最常見的問題养叛，造成背景深的原因很多。第一宰翅，封閉的問題弃甥，封閉條件一般為5%牛奶或BAS室溫封閉2-4h，但最好4度過夜汁讼；實(shí)際上牛奶對(duì)于多數(shù)抗體來說效果不錯(cuò)淆攻，但二抗與牛奶可能有交叉反應(yīng)阔墩，因此洗滌很重要。另外BSA蛋白單一瓶珊，可降低因牛奶其他成分引起的背景啸箫。第二，TBST洗脫不徹底也會(huì)導(dǎo)致背景深伞芹，適當(dāng)增加洗脫時(shí)間忘苛、次數(shù)、用量可以減輕背景顏色唱较，有時(shí)候膜沒有完全均勻的浸潤(rùn)也是原因之一扎唾。第三，條帶背景深也與曝光時(shí)間有關(guān)南缓，曝光時(shí)間超過半小時(shí)出現(xiàn)背景是很正常的胸遇，所以可以的話建議曝光1-10min。第四汉形，抗體濃度太高也會(huì)導(dǎo)致背景高纸镊，建議實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行檢測(cè)。
9. Western Blot中Tween-20的作用是什么概疆？應(yīng)該怎么用逗威？
Tween-20是一種非離子型表面活性劑。用途為水包油乳化劑届案、可用作溶劑、擴(kuò)散劑罢艾、穩(wěn)定劑楣颠、潤(rùn)滑劑和抗靜電劑等。氣相色譜固定液(最高使用溫度120℃)分離分析揮發(fā)油咐蚯、脂肪酸酯童漩、醇、酮和鹵化物春锋。
Westernblot的操作流程中大部分都用到TBST洗液矫膨，而且還是封閉，一抗二抗孵育這種比較關(guān)鍵的步驟期奔。通常Tween-20作為一種非離子型表面活性劑侧馅，效果和SDS、BSA作用差不多呐萌。由于膜上結(jié)合的蛋白會(huì)因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒淮婺俪眨虼嗽诜忾]時(shí)可使用Tween20清除去污劑，而且濃度不要超過0.3%（0.05%效果最好）肺孤，如果牛奶封閉效果不好可以提高吐溫濃度罗晕。
在WB洗液里的吐溫是和BSA一樣济欢，對(duì)抗原抗體蛋白提供保護(hù)作用，同時(shí)因?yàn)槭潜砻婊钚詣ㄋ颈P加成親水的環(huán)氧乙烷基團(tuán)后的化合物）小渊，可以減少抗體對(duì)抗原的非特異性作用法褥，用于洗脫未結(jié)合的抗體、減少非特異性結(jié)合酬屉。Tween-20是我們用TBST的時(shí)候Tween-20得用量是0.5ml/L半等，不加SDS。
10. 出現(xiàn)變形條帶
凝膠存在氣泡或是雜質(zhì)梆惯、電流不穩(wěn)定酱鸭、凝膠冷切不均勻。制膠器具和電泳槽保持干凈垛吗，換新的電解液凹髓，保證材料無污染，制膠過程中清除氣泡怯屉。如電泳槽老化建議換新蔚舀。盡量選擇中間孔加入樣品，避免兩端上樣锨络。?
