測序技術是基因組學的核心技術模软，上期的推送【LAI：基因組組裝質量評估新標準】簡單介紹了測序技術的發(fā)展進程伟骨。其實，測序技術的發(fā)展主要基于兩個非常具有里程碑意義的理念：“生命是序列的”和“生命是數據的”燃异。序列是基因組學最基本最重要的數據携狭，也是生命科學領域大數據時代的核心組成部分。簡單來說回俐，測序技術就是將DNA/RNA分子中堿基ATGC的排列順序顯示出來逛腿。
1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結構仅颇。
DNA雙螺旋模型以及“生命是序列的”觀點的發(fā)表单默，直接推動了測序技術的發(fā)展，因為解讀生命遺傳信息的前提就是得到它的載體——序列忘瓦。
從20世紀70年代到現在有很多測序技術和平臺的產生搁廓，其中包括SBC法、454耕皮、Ion Torrent境蜕、SBL法、Sanger法凌停、Illumina粱年、Pacbio、Nanopore等罚拟。今天主要跟大家分享后四種常用的測序技術台诗。
第一代測序技術
Sanger法是基于DNA合成反應的測序技術完箩，又稱為SBS法、末端終止法拉庶。1975年由Sanger提出嗜憔，并于1977發(fā)表第一個完整的生物體基因組序列。
核心原理：由于雙脫氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脫氧氏仗，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵吉捶，因此可以用來中斷DNA合成反應，在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP）皆尔，通過凝膠電泳和放射自顯影呐舔，根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。
在每個反應體系中慷蠕，ddNTP相對于dNTP是很少的珊拼，所以只有部分新鏈在不同的位置特異性終止，最終就會得到一系列長度不一的序列流炕。
第二代測序技術
以Illumina平臺為代表的第二代測序技術實現了高通量測序澎现，有了革命性進展，使得大規(guī)模并行測序成為現實每辟，極大推動了生命科學領域基因組學的發(fā)展剑辫。Illumina循環(huán)SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆終止)的核心技術是DNA合成的可逆性末端循環(huán)，即3'-OH可逆性的修飾和去修飾渠欺。
基本原理：將dNTP的3'-OH以疊氮集團RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基團)進行修飾妹蔽；將4種堿基分別與不同的熒光分子連接；DNA合成時挠将，RTG能起到類似于ddNTP的作用終止反應胳岂；每次合成反應終止并讀取信號之后，洗脫RTG和熒光分子舔稀，進行下一輪循環(huán)乳丰。
主要過程：
a, DNA待測文庫構建
利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭内贮，構建出單鏈DNA文庫成艘。這些文庫中的DNA在通過flowcell(吸附流動DNA片段的槽道)時會隨機附著在flowcell表面的channel上。每個Flowcell有8個channel贺归，每個channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對断箫，并能支持DNA在其表面進行橋式PCR的擴增拂酣。
b,c 橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增仲义。經過不斷的擴增和變性循環(huán)婶熬，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束剑勾，每一個束都含有單個DNA模板的很多份拷貝，進行這一過程的目的在于實現將堿基信號強度放大赵颅，以達到測序所需的信號要求虽另。
測序方法采用邊合成邊測序的方法：
1. dNTP模型
2. dNTP加上可終止反應的基團RTG和熒光信號
3.?反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4種dNTP
4. 脫掉-OH和二磷酸饺谬，進行合成
5. 反應因RTG終止捂刺，激發(fā)熒光進行信號采集。
6. 洗脫RTG和熒光分子募寨，進行下一輪循環(huán)
第三代測序技術
以Pacbio平臺為代表的SMRT(Single-Molecule Real Time Sequencing,單分子實時測序)測序技術具有高通量族展、長讀長的特點。
基本原理：Pacbio仍然采用邊合成邊測序的原理拔鹰，但實現了兩個重要的技術突破仪缸。一個是將熒光分子標記在磷酸上，這樣在反應停止且捕獲熒光信號以后列肢，可直接隨磷酸基團脫落恰画，解決了因噪音污染導致的讀長很短的問題；二是由于不需要PCR擴增瓷马，信號的有效提取成為了關鍵拴还。通過引入零模波導孔（ZMW）技術解決這一問題。在納米室底部有一個孔徑70nm的小孔决采，由于遠遠小于激光的波長自沧，所以激光從底部照射時，只會照亮一個小的區(qū)域树瞭，提高了信噪比拇厢。
主要過程：如下圖所示，類似于Illumina部分展示的模式圖晒喷，也是邊合成邊測序孝偎。
第四代測序技術
納米孔測序技術是單分子實時測序的新一代技術，主要是通過ssDNA或RNA模板分子通過納米孔而帶來的“電信號”變化推測堿基組成進行實時測序凉敲。
基本原理：當納米孔充滿導電液時衣盾，兩端加上一定電壓，分子模板通過納米孔生成可測量電流爷抓。納米孔的直徑只能容納一個核苷酸势决，單鏈模板就會在電場作用下依次通過納米孔而引起電流強度變化，通過檢測相應的電流峰判斷堿基蓝撇，實現實時測序果复。
四大測序技術的優(yōu)缺點：
Sanger法測序讀長長、準確度高渤昌，但是通量不高虽抄；
Illumina測序讀長短走搁、通量高、準確度高迈窟，在進行基因組組裝或者結構變異分析的時候沒有優(yōu)勢私植，可用作三四代測序read的糾錯；
Pacbio測序讀長長车酣、通量高曲稼、準確度不高，但可通過測序深度彌補骇径，GC偏差低躯肌，可進行甲基化的直接測序。
Nanopore測序讀長長破衔、通量高清女、準確度低，不可通過測序深度彌補晰筛，但可通過Illumina read 糾錯嫡丙。
第一、二读第、三代測序技術都是基于邊合成邊測序的原理曙博，因此Nanopore技術被一些人（包括我）稱為第四代測序技術；
隨著測序技術的發(fā)展和成熟怜瞒，逐漸形成基因測序產業(yè)鏈
本期對于測序技術的介紹到此為止父泳，主要是同大家交流學習，歡迎指出不足之處吴汪。另外推薦一本2016年出版的楊煥明院士的《基因組學》惠窄，非常好的一本書。
