常用的細胞毒性測定方法的基礎(chǔ)是測量受損細胞釋放的胞漿酶的活性朗和。乳酸脫氫酶( LDH ) 是一種所有細胞中均存在的穩(wěn)定的胞漿酶篮迎。在不同類型的組織中存在5 種不同的乳酸脫氫酶異構(gòu)體疯搅，它們在數(shù)量蔫耽、特異性和酶作用動力學(xué)方面存在差異解幼。但所有不同的酶異構(gòu)體均催化相同的丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化放仗，伴隨著NADH 氧化為NAD+的反應(yīng)（圖1) 润绎。當(dāng)質(zhì)膜受損時， LDH 被迅速釋放進入細胞培養(yǎng)上清中诞挨， 這是細胞發(fā)生凋亡莉撇、壞死和其他形式損傷的一個重要特征。利用乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸過程中產(chǎn)生的NADH , 使一個偶聯(lián)反應(yīng)中的另一種化合物還原為易于定量的產(chǎn)物惶傻，由此可簡單地定量LDH 活性棍郎。本方案通過測量492nm 的吸光度來反映黃色四唑鹽INT 被NADH 還原為紅色水溶性的甲臜類( formazan-class) 染料的情況。甲臜的數(shù)量與培養(yǎng)體系中LDH 的數(shù)量成正比银室，相應(yīng)地涂佃， LDH的數(shù)量與死細胞或受損細胞的數(shù)目成正比。
試劑
已轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞
本方法必須做三個重復(fù)蜈敢。對于LDH 法辜荠，需要留出一組不經(jīng)毒性試劑處理的細胞孔以用于估計LDH 的總量。
LDH 檢測底物溶液
LDH 標(biāo)準(zhǔn)（可選抓狭；見步驟8)
裂解液[9% (V/V) Triton X-100 伯病，用于測量細胞總LDH]
終止液［含50％ 二甲基甲酰胺( DMF ) 和2 0% SDS , pH 4.7]
可用lmol/L 鹽酸來終止反應(yīng)，但當(dāng)用于含酚紅的培養(yǎng)基時DMF/SDS 溶液效果更好否过，因其能夠中和背景吸附午笛。
設(shè)備
微量滴定板分光光度計
96 孔板惭蟋，標(biāo)準(zhǔn)平底
96 孔板， V 形底或圓底
組織培養(yǎng)皿(90mm )
方法
靶細胞數(shù)目的優(yōu)化（總LDH 釋放測定）
1.不同類型的靶細胞（YAC-1 药磺、K562 告组、Daudi等）含有LDH 的量不同，因此与涡，需要采用實驗所需類型的細胞進行預(yù)實驗惹谐，以測定確保足夠信噪比所需的最適靶細胞數(shù)目。
2.制備靶細胞的稀釋液（0細胞／ 100μL 驼卖、5000 細胞／100μL 氨肌、10000 細胞／ 100μL 和20000 細胞／ 100μL), 向V 形底或圓底96 板的每個孔加入100μL 。做三個重復(fù)酌畜。
3.向每孔加入15μL 裂解液怎囚，將培養(yǎng)板250g 離心4min 。
4.轉(zhuǎn)移50μL 上清至96 孔平底酶聯(lián)板桥胞。向培養(yǎng)基中加入50μL LDH 檢測底物恳守。將板子用錫箔覆蓋或裝入不透明小盒以避光， 37°C 孵育15 ~ 30min 贩虾。
5.加入100μL 終止液催烘。
6.確保孔中無氣泡缎罢。在加入終止液lh 之內(nèi)測量490nm 處的吸光度伊群。于690nm 處測定背景吸光度，從主波長測量值( 490nm ) 中減去該值策精。
7.對于吸光度值至少是培養(yǎng)基對照的背景吸光度兩倍的細胞舰始，測定其細胞密度。
8.（可選）向50μL 不同的LDH 標(biāo)準(zhǔn)中加入50μL 檢測底物咽袜。孵育15min, 然后同上測量吸光度丸卷。用得到的值制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于比較待測樣品的酶活性询刹。
細胞毒性檢測
9.轉(zhuǎn)移50μL 細胞培養(yǎng)上清至96 孔板中谜嫉。如果是懸浮培養(yǎng)的細胞，則先將細胞250g離心4min, 然后移取50μL 上清凹联。
10 . 向培養(yǎng)基中加入50 μL LDH 檢測底物骄恶。將板子用錫箔覆蓋或裝入不透明小盒以避光， 37°C 孵育15 ~ 30min 匕垫。
11.加入l00μL 終止液。
12 . 確迸吧耄孔中無氣泡象泵。在加入終止液lh 之內(nèi)測量490nm 的吸光度寞秃。于690nm 測定背景吸光度，從主波長測量值( 490nm ) 中減去該值偶惠。
?13 . 用下列等式計算測定細胞死亡百分比（細胞毒性百分比）：
細胞毒性（％） ＝實驗組LDH釋放量( OD490)/最大LDH釋放量（OD490)
14.（ 可選）向50μL 不同的LDH 標(biāo)準(zhǔn)中加入50 μL 檢測底物春寿。孵育15min , 然后同上測量吸光度。用得到的值制備標(biāo)準(zhǔn)曲線忽孽，用于比較待測樣品的酶活性绑改。
