1. Single-cell and spatial transcriptomics of reovirus T1L-infected neonatal mice hearts
Fig 1A：為了探究reovirus誘導(dǎo)的心肌炎的病理生理過程英融，作者對新生鼠灌胃給了T1L呼腸孤病毒和mock control盏檐。取了感染后d1, d4, d7, d10的小鼠（和四個時間點對應(yīng)的mock，一共是8組）的心臟和回腸組織進行了單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序糯笙。此外為了鑒定組織中reovirus的(非腺苷酸化)轉(zhuǎn)錄本贬丛，還在scRNA-seq library中做了一個病毒片段的hybridization-based enrichment给涕。
Hybridization-based enrichment of viral fragments
這種比對病毒基因組的方法之前在新冠的文獻里見到過單細胞測序揭示COVID-19嚴重性與呼吸道上皮和免疫細胞的相互作用相關(guān)
Fig 1B C：心臟組織單細胞一共得到31684個細胞，分為18個細胞群够庙」вΓ空轉(zhuǎn)得到8243個spatial transcriptomes耘眨。
Fig 1D：回腸組織一共得到7,695單細胞和8,027spots。
Fig 1E：這個圖展示了檢測到病毒基因組的細胞的類型和比例剔难。在回腸中胆屿，檢測到了13,100個病毒轉(zhuǎn)錄本，病毒載量在d1-d4逐漸降低非迹。d1時，病毒感染的細胞主要是腸內(nèi)分泌細胞纯趋，其次是腸細胞和杯狀細胞。d4天時則變成了淋巴管細胞吵冒，提示病毒通過引流淋巴管進入血液循環(huán)纯命，并近一步進入心臟。在心臟中亿汞，在392個細胞中共檢測出了2762個病毒的轉(zhuǎn)錄本。心臟中d4天時開始出現(xiàn)病毒感染的細胞结耀，主要是心內(nèi)膜細胞和內(nèi)皮細胞匙铡。d7時心臟中病毒陽性的細胞比例進一步增加图甜，主要仍然是心內(nèi)膜細胞和內(nèi)皮細胞。病毒轉(zhuǎn)錄本數(shù)目在d10則出現(xiàn)下降鳖眼，和體外病毒滴度測定相一致。在d7時钦讳，中性粒細胞矿瘦，樹突狀細胞和抗原呈遞細胞中也檢測出了病毒，提示這些細胞可能作為病毒的carrier缚去，促進病毒擴散潮秘。
Fig 1F：Cdh5和病毒轉(zhuǎn)錄本M3的共染提示受感染的內(nèi)皮與T細胞和成纖維細胞存在共定位（易结？這不都是病毒陽性的嗎枕荞？T細胞在哪呢搞动？）
2. Endothelial cells are primed with basal interferon response and play an important role in initiating host innate immune response
Fig 2A：為了探究感染后心臟組織中的早期轉(zhuǎn)錄差異，作者對d4心臟和mock心臟做了Differential Gene Expression Analysis (DGEA)鹦肿。得到230個上調(diào)基因(logFC > 1.0, p-value < 0.01;??這個FC卡的這么高矗烛，得到的上調(diào)基因數(shù)箩溃，很少啊)，包括interferon-b pathway, interferon signaling和innate immune responses相關(guān)的基因涣旨。
Fig 2B：為了定量和比較不同細胞類型間的早期感染反應(yīng)嚴重程度虱而，作者使用上面篩選出來的226個上調(diào)基因計算了心臟不同時間點不同細胞的infection response score, IR开泽。結(jié)果顯示內(nèi)皮細胞在各個時間點都有著最高的炎性反應(yīng)評分牡拇，和Mock相比穆律，內(nèi)皮的感染反應(yīng)評分增長也是最高的。
這個結(jié)果提示內(nèi)皮細胞可能是機體抵御病毒感染的重要initiators峦耘。（不是很充分）
Fig 2C：空轉(zhuǎn)的數(shù)據(jù)提示d4 d7心臟的IR評分都出現(xiàn)增加剔蹋，主要出現(xiàn)在myocarditic region。
Fig 2D：由于mock小鼠的內(nèi)皮細胞也有著最高的IR 評分泣崩，作者使用了Tabula Muris scRNA-seq mouse atlas的數(shù)據(jù)來查看這是否是在多種器官中存在的普遍現(xiàn)象。結(jié)果提示在多個器官中內(nèi)皮細胞都具有最高的IR評分洛口。These results indicate that endothelial cells lining the vasculature have a higher basal expression of innate response genes within most tissues, which may prime these cells to respond to viral dissemination within the blood and lymphatics.
Fig 2E：隨后作者使用同樣的方法計算了回腸組織的差異基因，使用上調(diào)的基因計算了IR評分第焰。在回腸組織不同細胞的IR評分中买优，腸細胞是最高的，其次是腸內(nèi)分泌細胞杀赢。
Fig 2F：空間組學(xué)的數(shù)據(jù)則提示回腸中最高的IR評分出現(xiàn)在腸粘膜和絨毛。
這種先找整體的高表達基因脂崔，再把高變表達基因當成一個module滤淳，通過計算每個細胞類型的模塊評分來看哪個細胞類型反應(yīng)最大的思路很好啊，比之前讀的單細胞測序揭示心衰患者循環(huán)免疫細胞的廣泛變化里的Fig1 I那樣子先找差異基因然后在不同細胞里面畫基因的韋恩圖感覺更優(yōu)雅一點～
3. Cytotoxic T cells recruited by inflamed endothelial cells induce pyroptosis
Fig 3A B：為了進一步探究心臟內(nèi)皮細胞的異質(zhì)性娇钱，作者對9,786個心臟內(nèi)皮細胞進行了重新聚類，得到四類細胞绊困。
Fig 3C：亞群的差異基因分析提示D7 inflamed EC高表達趨化因子Cxcl9和Cxcl10。這兩個趨化因子在趨化T細胞反應(yīng)中起到重要作用秤朗。跟這個結(jié)果對應(yīng)的煤蹭，7天的t細胞也高表達了Cxcl9和Cxcl10的受體Cxcr3。內(nèi)皮細胞還高表達粘附分子Vcam1和Icam1可能促進免疫細胞的粘附硝皂。此外內(nèi)皮細胞還高表達MHC I類 (H2-D1，H2-K1) 和 MHC II類 (Cd74)分子作谭，提示向T細胞的抗原呈遞增強。
Fig 3D：Cxcl9high內(nèi)皮細胞的通路富集結(jié)果中也包含了白細胞粘連折欠，T細胞活化贝或，IL-8產(chǎn)生，細胞因子反應(yīng)咪奖，TNF活化，IFNG活化等通路（見sup）酱床。這些通路的活化也主要存在于myocarditic region羊赵。
前面的結(jié)果提示內(nèi)皮細胞參與T細胞的活化和招募扇谣，因此作者下一步探究了T細胞的異質(zhì)性。
Fig 3E F：作者對心臟中浸潤的2205個T細胞進行了重新聚類罐寨，得到了4個亞群靡挥。包括一個Tn群，一個Th群和兩個Tc群芹血。
Fig 3G：差異分析結(jié)果提示Tc和Th細胞都高表達Cxcr3，還高表達Ifng, Ccl3, Ccl4, Ccl5, S100A4和S100A6楞慈，提示它們參與中性粒細胞招募和活化。Tc細胞在所有細胞中占比最高囊蓝，還高表達Prf1, Gzma, Gzmb和Gzmk等顆粒酶依賴性胞吐作用相關(guān)的溶菌顆粒饿悬。
Fig 3H：通路富集結(jié)果中包含中性粒活化狡恬，抗原呈遞，NFkB蝎宇，TNF活化等pathway弟劲。
此外姥芥，死亡相關(guān)pathway的下游分子如Pycard, Acer2, Zbp1, Casp1, Casp4和Casp12也在Cxcl9high內(nèi)皮細胞高表達，提示細胞毒性淋巴細胞可能是引起inflamed內(nèi)皮細胞死亡的原因凉唐。內(nèi)皮細胞的通路富集也富集到了死亡相關(guān)的pathway(Supp Fig. 3F)庸追。在前面的結(jié)果中，心臟中T細胞也主要存在于myocarditic regions和border區(qū)淡溯。結(jié)合Fig 3D和H的結(jié)果，在Cxcl9high內(nèi)皮細胞和Tc細胞中富集到的通路都主要存在于myocarditic regions簿训，提示構(gòu)成心臟血管網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)皮細胞在驅(qū)動心臟適應(yīng)性免疫中起到重要作用咱娶。
結(jié)合前面的結(jié)果强品，在reovirus-induced myocarditis中，血管內(nèi)皮細胞受到了病毒的直接攻擊和趨化來的Tc細胞的攻擊择懂。心臟中微血管網(wǎng)絡(luò)的損傷可能進一步引起心臟血供受損喻喳，并且可能是進一步免疫反應(yīng)介導(dǎo)的心肌細胞死亡的原因。
4. Spatially restricted gene expression in myocarditic tissue
心肌炎中心臟炎癥反應(yīng)的局灶性使得作者想要進一步去探究reovirus感染心臟的空間基因表達異質(zhì)性表伦。
Fig 4A：額 這個就是Fig 1C的那個圖摳出來的吧
Supp Fig. 4A：作者計算了myocarditic regions的上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)很多免疫細胞的marker(T細胞的makrer Cd8a和Gzma慷丽，NK細胞的Nkg7，中性粒細胞的S100a8)要糊，inflammation的marker (Cd52和Lyc62)纲熏，趨化因子和細胞因子(Ccl5, Ccl2, Cxcl9和Cxcl10)的高表達。對應(yīng)的單細胞數(shù)據(jù)提示Ccl5主要是DC細胞表達局劲，Ccl2主要是成纖維細胞表達勺拣，Cxcl9,10主要是內(nèi)皮細胞表達鱼填。
Supp Fig. 4B：Ccl2的受體Ccr2主要在巨噬細胞表達，和既往報導(dǎo)相一致苹丸，提示巨噬細胞主要由成纖維細胞趨化而來愤惰。
Supp Fig. 4C：border zones的上調(diào)基因。
Fig 4B：對myocarditic regions和border zones的空間差異基因中還存在其他有意思的基因宦言，包括Timp1, AW112010, Clu, Ankrd1, Gm4841和Ctss。
Supp Fig. 4D：單細胞數(shù)據(jù)提示Timp1主要在inflamed fibroblasts中表達商模。Timp1是MMP(參與細胞外基質(zhì)的降解)的天然抑制劑蜡励。后面幾個基因也是挨個解釋了一下意義以及跟心肌炎的聯(lián)系
Supp Fig. 4E：border zones上調(diào)基因的富集結(jié)果阻桅，富集到TNF, IL-1, NFkB等信號通路。
Fig 4C, Supp Fig. 1F：為了進一步理解免疫細胞浸潤對myocarditic regions周圍細胞類型組成的影響嫂沉，作者定量了不同細胞在myocarditic region, border區(qū)和其它心室組織中的比例變化稽寒，發(fā)現(xiàn)Cxcl9high內(nèi)皮細胞，Ccl2+成纖維細胞杏糙，T細胞，DC和NK細胞在myocarditic regions增加蚓土，相應(yīng)的，心肌細胞比例下降蜀漆。
Supp. Fig. 4G-4H：為了進一步理解Ccl2+成纖維細胞谅河，作者對成纖維細胞進行了進一步的聚類分群。得到了4個群绷耍。
Supp. Fig. 4I：Ccl2+成纖維細胞表達高水平的MHC I類分子(H2-D1 and H2-K1)，粘附分子Vcam1和Icam1鲜侥，和其它基因比如Serpina3g, C3和Ms4a4d褂始。此外這些成纖維細胞也高表達Casp1和Casp4描函，提示存在in response to cytotoxic T cells的焦亡反應(yīng)狐粱。
Fig. 4D-E：為了探究心臟炎癥浸潤對心肌細胞的影響，作者把心肌細胞也單獨提出來做了分群胆数。得到了4個群肌蜻。從右面的圖可以看到幅慌，d7 infected的心肌具有比較特殊的轉(zhuǎn)錄特征宋欺，d4 d10infected的心肌則和mock聚在一起胰伍。
Fig. 4F：為了探究border區(qū)心肌的轉(zhuǎn)錄特征，作者把心肌細胞marker和border區(qū)marker取了個交集酸休，得到31個基因。
Supp Fig. 4F：31個基因中包括Gm4841, Gm12185, Mt1, Mt2, Ankrd1和Nppb斑司。Gm4841和Gm12185是干擾素誘導(dǎo)基因渗饮，Mt1和Mt2在缺血性心肌病小鼠中可以調(diào)節(jié)炎癥，參與心肌重塑互站。Ankrd1是一個心肌存活因子，在晚期自發(fā)肥心的病人心臟中上調(diào)僵缺。
這些結(jié)果提示組織損傷主要存在于myocarditic regions胡桃，而border區(qū)則存在活躍的重塑磕潮，也提示著使用空間組學(xué)研究病毒性心肌炎的重要性。
5. Reduced adaptive immune cell infiltration associated with reovirus K287T mutant
最近報道了一種reovirus的變異株T1L S4-K287T (K287T)1自脯，這個變異株在編碼外衣殼蛋白sigma-3的S4基因上有一個點突變之景，這個蛋白是一個雙鏈RNA結(jié)合多功能蛋白膏潮，可以促進病毒蛋白的合成锻狗，幫助病毒進入細胞和組裝焕参。K287T可以感染心臟但是和WT相比它產(chǎn)生的病毒滴度很低，并不引起心肌炎龟糕。
Fig. 5A, Supp Fig. 4J：為了驗證前面的發(fā)現(xiàn)桐磁，作者額外對K287T細胞感染后d4, d7和d10的心臟進行了單細胞測序。得到16771個細胞讲岁，隨后作者把這部分數(shù)據(jù)和前面的數(shù)據(jù)做了整合衬以。絕大多數(shù)K287T感染的細胞類型都可以和前面WT病毒感染的細胞類型聚在一起。
Supp Fig. 4K L：病毒轉(zhuǎn)錄本定量的結(jié)果提示校摩，這種變異株病毒在d4的時候在心臟中的病毒載量和T1L差不多，但d7,d10時就顯著減少衙吩。
Fig. 5B：隨后作者比較了K287T和WT病毒感染后心肌細胞類型的早期宿主反應(yīng)互妓。（跟Fig2一樣計算的d4的infection response score）結(jié)果提示不管是WT還是K287T病毒，內(nèi)皮細胞的感染反應(yīng)評分都是最高的冯勉。
Fig. 5C：作者比較了K287T和WT病毒感染后心臟中的細胞比例，結(jié)果提示K287T感染后d7的心臟中Cxcl9high內(nèi)皮細胞和各種免疫細胞都出現(xiàn)下降摹芙。
這些結(jié)果提示盡管感染的是K287T病毒灼狰，心臟內(nèi)皮細胞仍然存在明顯的固有免疫活化浮禾，但是病毒復(fù)制在大多數(shù)細胞中都下降。d7之后盈电，隨著病毒逐漸在細胞中被清除和較弱的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的活化蝴簇，K287T感染的心臟出現(xiàn)了非心肌炎表型。
整體上得到的病理生理機制是：
呼腸孤病毒在進入腸道1d之后熬词，感染腸道上皮的內(nèi)分泌細胞和腸細胞，這些細胞出現(xiàn)了明顯的固有免疫反應(yīng)以抑制病毒復(fù)制卷扮。病毒隨后感染腸道淋巴管細胞(d4)，并通過腸道引流淋巴管進入血液晤锹，隨后定植在心臟摩幔。心臟內(nèi)皮細胞是最早對病毒起反應(yīng)的細胞(d4)，出現(xiàn)了明顯的固有免疫反應(yīng)的活化鞭铆。inflamed EC釋放趨化因子Cxcl9和Cxcl10，趨化Tc細胞车遂，并通過上調(diào)MHC I類和II類分析增強向T細胞的抗原呈遞封断。趨化而來的Tc細胞可以誘導(dǎo)心肌組織焦亡舶担。
分析主要是用Scanpy做的坡疼，整合單細胞和空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)用的scvi-tools包的Stereoscope反卷積算法衣陶。做通路富集用的是gseapy柄瑰，python版的gsea。
這篇文章教沾，測了這么多數(shù)據(jù)蒲跨，這么分析感覺有點浪費授翻。但是不管分析的怎么樣或悲，單細胞+空間轉(zhuǎn)錄組的優(yōu)勢還是非常明顯的堪唐。
參考文獻：
1: The multi-functional reovirus 3 protein is a virulence factor that suppresses stress granule formation and is associated with myocardial injury. PLOS Pathog. 17, e1009494 (2021).
