Temporal expression of MOF acetyltransferase primes transcription factor networks for erythroid fate
文章信息
今天介紹的文獻于2020年5月20日發(fā)表在Science Advances上夷狰，文章題目是： Temporal expression of MOF acetyltransferase primes transcription factor networks for erythroid fate（MOF乙跣眩基轉移酶的時空表達啟動轉錄因子網(wǎng)絡調控紅系命運）
摘要
造血干細胞（HSCs）的自我更新和分化受轉錄因子和表觀遺傳調節(jié)因子的精細調控彻犁。這里柬赐，作者探索了組蛋白H4賴氨酸16乙酰轉移酶MOF調節(jié)紅細胞生成的機制绰姻。單細胞RNA測序和染色質免疫沉淀測序發(fā)現(xiàn)MOF通過動態(tài)募集染色質來影響紅系發(fā)育軌跡枉侧，其單倍劑量不足會導致短期的HSC細胞群積聚。由MOF狂芋，RUNX1和GFI1B組成的調控網(wǎng)絡對于紅系命運至關重要榨馁。GFI1B充當Mof激活劑，它的表達對于特異性細胞誘導Mof表達是必需和定量的帜矾。Mof耗盡HSCs的可塑性可以通過下游效應Gata1的表達或通過組蛋白去乙跻沓妫基酶抑制劑的重塑乙跣既幔化平衡來挽救。Mof表達的準確時機和劑量可充當前饋轉錄因子網(wǎng)絡的變阻劑珍剑，從而保證沿紅系命運的發(fā)展掸宛。
樣本數(shù)據(jù)
已發(fā)表數(shù)據(jù)：
published transcriptome-wide data（18）
Chromatin accessibility analysis from human hematopoietic cells (ATAC-seq)(27)
bulk (37) and single-cell ATAC-seq (scATAC-seq) of hematopoietic cells (38).
published GFI1B ChIP-seq profiles (40).
此研究產(chǎn)生數(shù)據(jù)：
Mouse strains：Eight- to 12-week-old mice from both sexes were randomly allocated to experimental groups. Ten-week-old male animals were used for ChIP-seq, RNA-seq, and scRNA-seq
Cell culture：HPC7 (murine hematopoietic progenitor cell line CVCL_RB19)， K562 cells (human blood from chronic myelogenous leukemia CVCL_004) and Wehi-3 (Mus musculus monocytic leukemia, CVCL_3622) cells
scRNA-seq experiments on FACS（Fluorescence-activated cell sorting）-sorted progenitor cells
Bulk experiment
ATAC-see (26)
ChIP-seq profiles from primary HSCs (15,000 cells; LSK+CD34?Flt3?) and MEPs (30,000 cells)
數(shù)據(jù)分析
fate-bias probabilities from c-Kit+ cells [data from (12) https://github.com/AllonKleinLab/PBA
RaceID3 （https://github.com/dgrun/RaceID3_StemID2） （25）
FateID （25）
StemID2 （https://github.com/dgrun/RaceID3_StemID2）
TRAP (33)
pseudotime analysis STREAM (39)
Monocle （61）
fate bias （25）
STREAM （39）
分析結果以及實驗驗證
紅系中的非特異性致死化合物
? 組蛋白乙跽凶荆化是由KATS和組蛋白去乙酰酶（HDACs）控制唧瘾，其中，一個超乙酰狀態(tài)通常會導致染色質解體 (16, 17)迫像。為了調查哪些KATS和HDACs可能被紅系生成過程中觀察到的動態(tài)表達基因調控劈愚，作者分析了已發(fā)表的轉錄組數(shù)據(jù)(18)。大多數(shù)酶（例如Tip60闻妓，Ep300或Sirt1）在整個類紅細胞軌跡中都穩(wěn)定表達菌羽，但作者觀察到Mof表達是動態(tài)的（圖1A）。作者還評估了c-Kit +細胞的紅系由缆，髓系和淋巴的命運偏向概率[數(shù)據(jù)來自 (12)注祖，與Mof表達有關（圖S1，A和B）]均唉。與已知的紅細胞標記（例如Gata1是晨，Kfl1，Gypa舔箭，Hbaa1和Alas2）相似罩缴，表達Mof的細胞與紅系或淋巴細胞相比，沿紅系譜系發(fā)展的傾向更高（圖1B）层扶。
接下來箫章，作者們要確定Mof的喪失是否會影響紅細胞生成。然而構建Mof的基因敲除（KO）小鼠模型具有胚胎致死性（19）镜会，但Mof雜合子（Mof +/-）小鼠是可行的檬寂，并且沒有表現(xiàn)出明顯的表型或壽命改變。雜合動物的造血祖細胞顯示Mof 的mRNA降低60％（圖S1C）戳表，MOF蛋白大量（圖S1D）和H4K16ac水平降低（圖S1E）桶至。作者發(fā)現(xiàn)Mof +/-小鼠顯示出低的RBC和血紅蛋白（HB）以及血細胞比容（HCT）水平（圖1C），所以將它判定為貧血匾旭。為了查明有缺陷血液形成的起源镣屹，作者們對Mof +/-小鼠（圖S2和注釋S1）的骨髓（BM）的細胞庫進行了廣泛表征，并使用條件性Vav1- iCre Mof-KO模型獨立驗證了表型（圖S3季率，A至F和注釋S1）（20）野瘦。Mof +/-動物顯示出紅系祖細胞和MEP的顯著減少（圖S2B），同時髓系祖細胞的數(shù)量增加（圖S2B）。這些小鼠還會積聚具有形態(tài)缺陷的RBCs鞭光，并且網(wǎng)織紅細胞的百分比增加（圖S2吏廉，C至F）。然而惰许，這些變化并沒有伴隨BM總細胞數(shù)和在- c-Kit+細胞的血數(shù)量上表現(xiàn)任何顯著差異席覆。此外，作者也沒有觀察到脾臟質量和/或細胞性的任何重大變化汹买，以及紅系細胞中細胞凋亡頻率或細胞周期異常的差異佩伤。然而，紅系細胞明顯減少晦毙，并且作者檢測到外周嗜中性粒細胞數(shù)量增加（圖S2生巡，G至M）〖剩總體而言孤荣，這些分析表明Mof含量的降低會導致紅系發(fā)育受損，并伴有髓樣傾斜须揣。
MOF存在在兩種不同的染色質修飾復合物中盐股，即非特異性致死（NSL；哺乳動物中為KANSL）復合物和雄性特異性致死（MSL）復合物耻卡。在哺乳動物中的MSL復合物疯汁，MOF參與了發(fā)育基因的精細調調控（21，22）卵酪。但是幌蚊，在MSL3中具有功能喪失突變的人類個體未顯示血細胞缺陷（21）。因此溃卡，作者懷疑MOF作為KANSL復合體的一部分在紅細胞生成過程中發(fā)揮其功能（23）霹肝。作者生成了條件性的Kansl2和Kansl3 KO小鼠在刪除Vav1-iCre基礎上，并表征了它們的血液成分（有關詳細信息塑煎，請參見注釋S1和圖S3，G至O）臭蚁。兩種突變體均顯示出類紅系細胞發(fā)育的缺陷最铁。Vav1- iCre / Kansl2 KO小鼠與Mof +/-小鼠更相似，因為它們也具有正常的壽命垮兑，但在體內（圖S3冷尉，H和I）和體外（圖 S3，J和K））的紅系祖細胞和RBC明顯減少系枪。此外雀哨，亞致死量照射的野生型小鼠接受200 VAV1 -iCre / Kansl2 KO HSCs的過繼轉移（LSK + CD34 -的Flt3 - CD48 + CD150 +）也顯示受損的紅細胞生成（圖S3L）。相反，Vav1- iCre /Kansl3 KO觸發(fā)了更強的表型雾棺，其特征是胚胎致死和胎兒肝臟紅系祖細胞的喪失膊夹，特別是在晚期紅系分化中（圖S3，M至O）捌浩。與Mof相反放刨，Kansl2和Kansl3條件性KOs并未顯示粒細胞增加（圖S3I），這意味著在Mof +/-動物中發(fā)現(xiàn)的髓樣偏見可能源于KANSL獨立功能尸饺。
基于Mof沿紅系分支的兩個表達峰（圖1A）进统，作者有興趣進一步探討貧血表型是否由HSCs，祖細胞和/或定型細胞中的功能引起浪听。作者首先測試了Mof丟失是否會影響HSC參與紅系譜系的內在能力螟碎。作者們將來自野生型或Mof +/-小鼠的單個HSCs分類到液體培養(yǎng)孔中，其中含有支持髓樣迹栓，紅系和淋巴樣分化掉分、單細胞集落形成單位（sc-CFU）的細胞因子。作者通過熒光激活細胞分選（FACS）檢測了219個單克隆輸出（72個野生型和147個Mof +/-）迈螟，以檢測髓樣（c-Kit ? CD11b +）叉抡，紅系（c-Kit ? Ter119 +）和淋巴樣分化[c-Kit ? IgD + ; B細胞群體，因為這些條件缺乏T細胞引發(fā)所需的細胞間相互作用（24）]答毫。培養(yǎng)10天后褥民，作者沒有觀察到集落強度的差異，因為野生型和Mof +/- HSCs均可產(chǎn)生多能（全部三個種群）洗搂，雙能（兩個種群）和寡聚（僅一個種群）集落消返，每個集落大小和總細胞數(shù)相似（圖1，D和E）耘拇。但是撵颊，作者發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生細胞偏斜，其中Mof +/- HSCs產(chǎn)生明顯更多的髓樣細胞和較少的紅系細胞惫叛，而B細胞數(shù)量保持不變（圖1F）倡勇。為了進一步驗證這些HSCs的增殖和分化能力，作者進行了bulk CFU分析嘉涌，其中將100來自野生型或Mof +/-小鼠的FACS分選的HSCs接種在補充細胞因子/生長因子的甲基纖維素基培養(yǎng)基中,它維持兩種類型的紅系祖細胞[爆發(fā)形成單位紅系（BFU-E）和CFU-E]妻熊，粒細胞和/或巨噬細胞（GM）祖細胞（CFU-GM）以及粒細胞，紅細胞仑最，單核細胞扔役，和巨核細胞集落（CFU-GEMM）。與sc-CFU分析中獲得的結果一致（圖1警医，D和E）亿胸，作者在bulk CFU實驗中觀察到Mof +/- HSCs中BFU-E數(shù)量減少坯钦，CFU-GM數(shù)量增加（圖1G）。
由于雜合動物中Mof的終生耗竭可能會引起繼發(fā)效應或導致第二反應其可能混淆作者分析細胞表面標志物表達變化侈玄，因此作者使用誘導型小鼠模型（Cag-CreERT2 T / + ; Mof fl / fl）驗證結論婉刀，其中僅在培養(yǎng)物中進行4-羥基他莫昔芬（4-OHT）處理后才刪除Mof（稱為Mof -iKO）。在HSCs中誘導通過4-OHT處理Mof KO導致髓樣菌落數(shù)量增加而紅系集落數(shù)量減少（圖1H）拗馒，概括了Mof +/- HSCs中觀察到的表型路星。作者觀察到Mof +/- HSCs在CFU-GEMM中顯示出明顯的減少，而在Mof -iKO小鼠中卻沒有那么明顯诱桂，表明這可能是次要的作用洋丐。接下來，作者從Mof +/-和Mof -iKO HSCs進行了連續(xù)培養(yǎng)CFU分析挥等。該分析表明友绝，盡管Mof +/- HSCs在重培養(yǎng)后仍保持對髓樣命運的偏向，但Mof -iKO HSCs形成的總體菌落明顯少于對照（圖1I）肝劲，這表明Mof KO完全破壞了HSC的自我更新能力迁客。
考慮到Mof +/-小鼠不僅顯示出早期紅系分化的缺陷，而且還顯示出受損的晚期紅系分化的跡象（圖S2辞槐，C至I和注釋S1）掷漱，與晚期相比，作者研究了HSCs中Mof降低的后果榄檬。為此卜范，作者首先對來自野生型和MOF +/-動物中MEPs的進行CFU分析試驗（Lin?cKithighSca-1?CD34?FcγgII/III?），評價在培養(yǎng)中他們的集落形成的能力鹿榜。
來自Mof +/-動物的MEP（分化過程中MOF長期發(fā)生變化）顯示出CFU-E和BFU-E集落（來自Mof +/- MEPs）明顯減少（圖1J）海雪。為了了解Mof缺失在已定型的紅系細胞/巨核細胞祖細胞中的后果，作者們對MEP進行分選舱殿，并在分選后并進行體外4-OHT處理然后分析CFU細胞奥裸。當作者們使用Mof-iKO模型時，獲得了不同的結果沪袭，在該模型中湾宙，已經(jīng)啟動的祖細胞（MEPs）中的Mof既不影響CFU-E也不影響B(tài)FU-E的形成（圖1K）。這些數(shù)據(jù)支持“Mof的功能在紅細胞生成的早期階段和觀察到的終末分化很重要”的想法冈绊。
為了分析體內HSC譜系啟動创倔，作者進行了Mof +/- HSCs的移植。移植后八周焚碌，作者觀察到脾臟大小明顯增加（圖S4A），盡管作者未觀察到細胞死亡的總體差異霸妹，但注意到明顯的粒細胞失衡十电，其特征是淋巴樣數(shù)量減少且髓樣細胞數(shù)量增加（圖S4，B和C）。與野生型受體脾相反鹃骂，Mof +/-受體脾未能恢復其組織結構台盯，其中作者觀察到了毛囊結構缺陷和紅系細胞的總體減少（圖S4D）。此外畏线，根據(jù)其Mof +/-基因型静盅，移植的細胞（CD45.2 +）顯示出H4K16ac水平降低（圖S4E）。Mof +/-受體小鼠表現(xiàn)出脾臟紅系祖細胞的頻率降低寝殴，而循環(huán)成熟RBC顯著降低（圖S4蒿叠，F(xiàn)和G）◎汲＃總的來說市咽，這些數(shù)據(jù)表明脾臟腫塊的增加可能反映了髓樣的擴張。
接下來抵蚊，作者檢查到Mof +/-受體動物BM 中CD45.2 +細胞嚴重減少（圖S4H）施绎。HSPCs中的進一步聚集顯示常駐HSCs數(shù)量增加，MPPs減少（圖S4贞绳，I和J）谷醉。為了探索HSC的自我更新和分化能力，作者接下來進行了BM二次移植冈闭。Mof + /-第二受體由于嚴重貧血而過早死亡（圖S4俱尼，K和L）。該結果還表明拒秘，在重復性挑戰(zhàn)下Mof +/- HSC可能會損害自我更新号显，如在CFU系列培養(yǎng)實驗中針對Mof -iKO所述（圖1I）。
這些數(shù)據(jù)一起表明躺酒，Mof的一個等位基因的喪失會以細胞內在的方式干擾HSC譜系定型押蚤，而優(yōu)先選擇粒細胞/髓系譜系，而以犧牲紅系譜系為代價羹应。此外揽碘，作者發(fā)現(xiàn)譜系定型后刪除Mof，即在MEP中园匹，不會導致紅系集落形成缺陷雳刺。
Mof +/-動物中由于擾動的紅系程序而導致轉移狀態(tài)祖細胞的積累
為了理解體內受損紅系譜系定型，作者利用FACS從野生型和MOF + / -小鼠的祖細胞分選進行scRNA-SEQ實驗[792 LT-HSC裸违，576 LSKhighCD34 -Flt3 -掖桦，864 LSKhigh， 576 LSK low 供汛，768 cKit high枪汪，48個巨核細胞祖細胞涌穆，24個粒細胞/巨噬細胞祖細胞（pre-GMP），24個粒細胞/巨噬細胞祖細胞（GMP）雀久，48個pre-Meg-E宿稀，48個pre-CFU-E，48個MEP 赖捌，以及24 Pro-E]（圖S5祝沸，A和B，請參見材料和方法）越庇。使用活性染料來確保僅對活細胞進行了分選罩锐。應用了RaceID（25）根據(jù)基因表達生成聚類（圖S5，C和D）悦荒，并使用各種方法（包括已知標記基因的表達和轉錄組熵）驗證聚類圖（圖2唯欣，A至C和圖S5，E和F）搬味。作者觀察到Mof +/-紅系中紅系程序的明顯失調熬芜，例如在MEP（cluster 6） 中的 Gata2椿猎，Hbb-bt志衍，Hba-a1崭倘，Trib2，Aqp1和在紅細胞中的Mpo悦析，Car-1寿桨，Car-2，和Hba-a1（cluster 3）圖2D）强戴。
接下來亭螟，作者使用FateID探索細胞命運如何在Mof +/-細胞中受到干擾以及如何形成命運偏向（圖2E和圖S5，G和H）（25）骑歹。這些分析證實预烙，與表達其他KAT的細胞相比，表達Mof的細胞具有更高的的可能性成為紅系細胞（圖S5G）道媚。接下來扁掸，作者定義了兩個不同的軌跡終點（GMP，cluster 8最域；紅系細胞谴分，cluster 3），并提取了其他祖細胞群中所有細胞或dHSC分化為這兩個終點的概率镀脂。這表明與GMP譜系相比牺蹄，Mof +/-細胞遵循紅系譜系的可能性要低得多（圖2E和圖S5H）。與較低的紅系細胞分化的預測一致薄翅，作者觀察到Mof +/-小鼠的BM中紅系細胞數(shù)量減少（圖2F）钞馁，盡管觀察到這些動物的BM細胞沒有明顯變化（圖S2B）虑省。紅系細胞的減少與細胞凋亡增加或增殖減少無關（圖S5I）。但是僧凰，這與有缺陷的紅系細胞程序一致，因為作者觀察到分選的MEP中Gata1-Pu.1平衡發(fā)生了變化（圖S5J）熟丸，因此驗證了作者的scRNA-seq結果训措。
作者根據(jù)基因型進行t-SNE圖進行聚類，并在dHSCs（cluster 2）和MPPs（cluster 4）中檢測到野生型的細胞多于Mof +/-型細胞光羞，而在其他情況下Mof* +/-細胞多于野生型細胞（cluster 10）（圖2G并注意S2）绩鸣。作者通過FACS證實了這一點，觀察到HSCs升高纱兑，但Mof +/- BM中MPP2（圖S6A）的數(shù)量顯著減少呀闻，而細胞死亡數(shù)沒有改變（HSC到MPP4），活性氧（ROS）的產(chǎn)生（ HSCs）或細胞周期（LSK +）沒有變化（圖S6潜慎，B至D）捡多。考慮到Mof +/- HSCs不易形成紅系細胞集落（圖1铐炫，E和H）垒手，作者懷疑cluster 10 中積累的細胞可能是分化受損的結果。
作者對此細胞群感興趣倒信，更廣泛地描述了其特征（圖S6科贬，E至L和注S2）。檢測到典型的dHSC表達模式鳖悠，例如Myc和Tal1網(wǎng)絡的調節(jié)減少榜掌，Erg和Hoxa9網(wǎng)絡激活，以及與各自的分子重疊強相關性[ MoLO基因（11）]和高視黃酸模式乘综。cluster 10還同時顯示了aHSC的特征憎账，例如Meis1，Cdk4瘾带，Cdk6和活躍的Stat1途徑的表達鼠哥。考慮到主動功能和dHSC功能的呈現(xiàn)看政，作者假設Mof+/- HSC代表中間HSC狀態(tài)朴恳。總之允蚣，分析表明于颖，正確執(zhí)行紅系分化程序需要祖細胞中MOF作用。
紅系生成過程中MOF介導的染色質可及性動力學
接下來嚷兔，作者試圖研究MOF調控紅系程序的分子機制森渐。由于MOF會沉積H4K16ac做入，在體外這直接影響染色質可及性（15），因此作者使用可視化的轉座酶可及染色質（ATAC-see）分析研究了沿紅系生成的染色質緊縮同衣。簡而言之竟块，該方法允許通過轉座酶輔助原位成像以單細胞分辨率可視化可及基因組（26）。作者通過FACS和顯微鏡分析了ATAC-see信號（圖3耐齐，A和B）（圖3C和圖浪秘。S7，A和B）埠况∷市總體而言，這些數(shù)據(jù)表明Mof +/-動物在HSCs（LSK + CD34 - CD150 +）辕翰，MPP（LSK + CD34 +）和MEP（Lin - Sca-1 - cKit高CD34 - FcgRII ）中顯示出總染色質可及性的顯著降低夺衍。/ III - ），而不是的GMPs（林-的Sca-1 -的cKit高CD34 - FcgRII / III高）喜命，它支持細胞類型特異性功能沟沙。
作者的ATAC-see數(shù)據(jù)揭示了野生型細胞中沿紅系分化過程的染色質可及性的全局變化。當作者重新分析來自（27）已發(fā)布的人類ATAC-seq數(shù)據(jù)時渊抄，作者也注意到尝胆，HSC和MEP的可及區(qū)域數(shù)量比MPP和紅系細胞（圖3D）高。與此相符护桦，作者在他們的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)HSC含衔，MEP和MPP2中H4K16ac的水平顯著增加（圖3E和 fig. S7C）《郑總的來說贪染，這些數(shù)據(jù)表明H4K16ac和體內整體染色質可及性之間存在直接聯(lián)系。
因此作者詢問Mof本身的表達變化是否反映了染色質可及性的這種動態(tài)模式催享。為此杭隙，作者對HSCs進行了分類，并進行了CFU分析因妙，并在第0天（細胞分選后）痰憎，5天和10天收集了RNA。作者觀察到野生型細胞中Mof RNA的水平遵循與已發(fā)表的和作者自己的體內全基因組數(shù)據(jù)相同的動態(tài)模式（Figs. 3F and and1A and fig. S9A)攀涵。與野生型細胞相比铣耘，源自Mof +/- HSC的集落特征是最初的Mof水平較低，隨后在5天時異常增加Mof RNA以故，然后在基于甲基纖維素的培養(yǎng)基中10天后再次降低（圖3F）蜗细。Mof RNA的這些波動反映體內染色質可及性和H4K16ac的動力學，作者在Mof +/-共同髓樣祖細胞（CMPs）中通過ATAC-see觀察到的染色質可及性峰值和較高的H4K16ac水平(Figs. 3, B and E）。這些數(shù)據(jù)表明炉媒，紅系生成缺陷不僅出現(xiàn)在Mof表達缺失下踪区，還受其表達時間干擾[例e.g., Mof+/? mice]。為了驗證這些變化是由MOF的細胞內在功能引起的吊骤，作者在Mof- iKO HSC中重復進行了ATAC-see[Fig. 3, G and H)]）缎岗，該結果概括了Mof +/-小鼠中的早期結論。一起表明沿紅系生成的全面染色質可及性動力學是由MOF介導的H4K16ac沉積決定的白粉。
HSCs和MEPs中不同的MOF全基因組結合譜
為了評估MOF如何指導造血譜系承諾密强，作者接下來從野生型和Mof +/-動物型分離了原代HSCs（15,000個細胞; LSK + CD34 ? Flt3 ?）和MEP（30,000個細胞）產(chǎn)生ChIP-seq譜（圖 S8A）。經(jīng)過質量控制評估（FastQC）之后蜗元，作者找出了peaks并在HSCs中確定了20,096個MOF結合區(qū)域（請參見補充數(shù)據(jù)）和在MEPs中確定了25,521個MOF結合區(qū)域（請參見補充數(shù)據(jù)），其中分別有16,924和6817結合在轉錄起始位點（TSS）附近[圖4A和圖系冗。S8奕扣，B和C；也參見（29掌敬，30）]惯豆。作者不僅觀察到動態(tài)結合（cluster 1，HSC> MEP奔害；cluster 2楷兽，HSC <MEP），而且觀察到細胞類型不變的峰（cluster 3华临；圖4B）芯杀。驗證作者找出peak的特異性，MOF ChIP-seq信號在Mof +/- HSC中整體降低雅潭，但是這種效應在細胞類型特cluster 1中最為明顯（圖S8揭厚，D和E）。作為補充數(shù)據(jù)集扶供，作者在造血前體細胞7（HPC7）中生成了MOF和H4K16ac ChIP-seq圖譜筛圆。這些數(shù)據(jù)與HSC數(shù)據(jù)高度吻合，并進一步證實了MOF和H4K16ac在特定于細胞類型的靶位點上的特定重疊椿浓，而其他KATs [e.g., p300 data from (31)]不存在（圖4C）太援。
為了驗證MOF結合區(qū)域是否受到影響，作者評估了它們在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的表達扳碍。與MOF介導的組蛋白乙跆岵恚化的激活作用一致，作者觀察到的MOF-結合基因的RNA水平左腔，但不是隨機對照基因唧垦，整體上在MOF+/-造血干細胞（scRNA-SEQ，cluster 2和5）和MEPs（scRNA-seq液样，cluster 6）顯著降低振亮，但沒有在MPPs降低（scRNA-seq巧还，cluster 4）（圖4D）。此外坊秸，HSC特異性MOF靶標（cluster 1）（例如Runx1和Fos）示例顯示麸祷，在分選的Mof +/- HSC（LSK + CD34 - Flt3 - CD48 - CD150 +）中RNA含量降低了（圖4E和圖S8F），而在Mof +/-細胞（例如Cdk8）的仍結合區(qū)域中未觀察到RNA水平變化（圖4E）褒搔。
接下來阶牍，作者有興趣了解差異ChIP clusters中哪些生物學過程與MOF結合的基因相關聯(lián)，然后進行了基因本體（GO）術語分析星瘾。在HSC中特異富集但不在MEP中富集的靶標（cluster 1 ）似乎富集了與HSC分化相關的術語（圖S8G）走孽，例如，細胞骨架變化和TF結合（32）琳状。因此磕瓷，cluster 1 TF 靶基因，諸如細胞命運承諾和細胞分化等生物過程有關被富集（圖S8G）念逞。另一方面困食，cluster 2 MOF peaks（MEPs> HSCs；圖S8H）在“核心啟動子序列特異性DNA結合”等術語上得到了特異富集翎承。這反映在各自的TF靶標富集中硕盹，揭示了“紅細胞分化”和“ RUNX1調節(jié)基因”。MOF與HSC中的Runx1啟動子結合后叨咖，進一步加強了MOF與Runx1之間的聯(lián)系（圖4E）瘩例。總之芒澜，這些分析表明仰剿，細胞類型特異性MOF靶標的大部分是HSC和MEP中的TF基因。
為了進一步描述與MOF合作的TF網(wǎng)絡痴晦，作者執(zhí)行了TF親和力預測[TRAP; (33]分析MOF峰（圖4F）南吮。除了在兩個集群中富含AT的基序，所述細胞類型特異性cluster 1的peaks顯著富集到Elf5和Runx1的基序誊酌，其作為TFs參與HSC分化（TFS 13部凑，34）。在Cluster 2中碧浊，作者發(fā)現(xiàn)富集motifs為已知的紅系調節(jié)子GATA1和ARID3A（35涂邀，36）。
接下來箱锐，作者著手驗證MOF結合與ATAC-see所觀察到的染色質可及性變化之間的聯(lián)系比勉，請參閱（圖3，A到D）。為此浩聋，作者分析了造血細胞的bulk （37）和單細胞ATAC-seq（scATAC-seq）（38）观蜗。在兩個數(shù)據(jù)集中的開放區(qū)域內都發(fā)現(xiàn)了MOF peak的大量富集。在顯示平均相似表達水平的基因對照組中未觀察到這一點衣洁，這表明可及性并非簡單地由基因活性本身驅動墓捻，而是與MOF存在相關（圖4，G和H）坊夫。這表明受MOF綁定區(qū)域占了HSCs和MEPs中大多數(shù)可訪問區(qū)域砖第。
上面的結果促使作者研究MOF在HSCs和MEPs中可及區(qū)域是否特別富集到紅系軌跡（圖S8I，另請參見材料和方法）环凿。為此梧兼，作者使用了基于DNA motif的方法，從對已發(fā)布的scATAC-seq數(shù)據(jù)進行偽時間分析開始智听。作者沿紅系軌跡從每個細胞中可及的位點提取了k- mer信息[flanking 7 bp of scATAC-seq peak袱院，如STREAM（39）中所述]。圖4I）瞭稼。接下來，作者從HSCs和MEPs中的每個MOF ChIP-seq TSS峰中提取了 k-mer信息腻惠。然后环肘，作者 詢問兩組（HSCs或MEPs）中獲得的MOF-peak k-mers 是否在給定群軌跡的可訪問位置和/或特征處顯著富集。HSC-MOF k-mers被特異富集在HSC-MPP軌跡的可及基序（圖4J）集灌。MEP-MOF k-mers悔雹，相反，更致力于MPP-MEP細胞軌跡（增加圖4K）欣喧。作者的分析表明腌零，細胞類型特異性MOF k- mers在HSC-MPP和MPP-MEP擬軌跡中大量富集（圖4，J到L）唆阿。
總之益涧，作者分析表明，HSC和MEP中的MOF結合位點與這些階段的開放染色質區(qū)域相關驯鳖。這種由MOF介導的染色質可及性決定了紅系細胞的命運闲询。
GFI1B對Mof表達的細胞特異性調控
考慮到MOF沿紅系軌跡的動態(tài)表達和全基因組范圍的占用，作者預測Mof基因本身受譜系特異性TFs動態(tài)控制浅辙。因此扭弧，作者接下來將注意力集中在Mof啟動子的調控上。作者在小鼠和人類Mof啟動子中進行了單個基序占用預測记舆，并確定了TF GFI1B的兩個連續(xù)基序的保守富集（圖5A）鸽捻。在已發(fā)布的GFI1B ChIP-seq資料中，GFI1B似乎富含在HPC7細胞的Mof啟動子區(qū)域（圖5B）（40）。由于Gfi1b是RUNX1的直接下游靶（41）御蒲，它本身就是一個MOF目標衣赶，作者推測轉錄因子Runx1的和Gfi1b參加與循環(huán)監(jiān)管MOF是逐步觸發(fā)紅系命運承諾。為了驗證針對這些因素的靶向性删咱，作者在HPC7細胞中進行了ChIP定量聚合酶鏈反應（qPCR）實驗屑埋，該實驗可再現(xiàn)證實RUNX1與Gfi1b啟動子結合和GFI1B與Mof啟動子的結合（圖5C）。
Mof mRNA水平在紅細胞生成過程中顯示兩個峰值（圖3F）痰滋。scRNA-SEQ數(shù)據(jù)集揭露了在體內第一個表達峰值MOF與Runx1的表達重合摘能，第二個具有增加Gfi1b水平（圖S9A）。此外敲街，Mof +/-動物還顯示Runx1和Gfi1b的調控異常（Figs. 4E and and5D5D and fig. S9A）团搞。調查MOF表達是否需要Gfi1b，作者在HPC7細胞中進行小干擾RNA（siRNA）掉低（KD的）Gfi1b多艇，其通過免疫熒光顯示其有著顯著降低的MOF水平（圖5E）逻恐。為了進一步剖析這一機制，作者接下來進行了熒光素酶報告基因檢測峻黍，以比較野生型Mof啟動子和突變的Mof啟動子复隆，其中39bp GFI1B結合區(qū)被改寫（圖5F）。該測定法在HPC7細胞（較幼稚的狀態(tài)）和K562細胞（較紅系定型的細胞）中進行姆涩。作者觀察到HPC7和K562細胞中明顯的Mof啟動子活性挽拂，該活性在GFI1B結合位點突變或Gfi1b KD完全消失。當在K562細胞中異位表達Gfi1b時骨饿，該報告基因構建物的活性得以增強亏栈，而在HPC7細胞中，這種作用相當微妙宏赘。此外绒北，GFI1B對Mof啟動子的這種調節(jié)似乎具有高度的細胞類型特異性，因為作者到外周血單核細胞（Wehi3）或人胚胎腎（HEK）293T（非造血起源）中啟動子突變后沒有觀察熒光素酶活性的降低察署。
為了探索Runx1和Gfi1b對紅細胞生成的功能相關性闷游，作者將細胞分選為Runx1 KD或Gfi1b KD HSCs（LSK + CD34 - Flt3 - CD48 - CD150 +）單細胞放入基于甲基纖維素的預涂孔中（圖5G）。培養(yǎng)10天后贴汪，作者觀察到Gfi1b KD HSCs集落形成明顯減少储藐。HSCs中的Runx1 KD導致BFU-E能力受損，但能夠維持CFU-GM的形成（圖5嘶是，H和I）钙勃。與作者先前的觀察結果一致，Gfi1b KD導致Mof表達降低聂喇。反過來辖源，Runx1 KD導致Mof和Gfi1b水平降低（圖5J）蔚携。總體而言克饶，這些數(shù)據(jù)強烈支持“通過與Mof其啟動子的直接結合酝蜒，GFI1B調節(jié)Mof發(fā)揮積極作用”。因此矾湃，Gfi1b和Runx1共同參與一個調節(jié)網(wǎng)絡亡脑，控制著對紅細胞生成至關重要的染色質可及性調節(jié)劑（MOF）的表達⊙荆總的來說霉咨，作者發(fā)現(xiàn)譜系特異性TF和MOF介導的組蛋白乙酰化的順序作用有助于紅系的命運拍屑。
通過乙跬窘洌化再平衡和強制紅系命運挽救異常的紅系軌跡
鑒于這些復雜且準確定時的事件，作者想進一步了解Mof如何調節(jié)紅細胞生成過程中的表達動態(tài)僵驰。因此喷斋，作者對scRNA-seq數(shù)據(jù)進行了偽時間分析。發(fā)現(xiàn)了紅系命運最高概率cluster 3（紅細胞）群（圖6A蒜茴， 圖S9B星爪，以及材料和方法）。使用該簇作為終點粉私，作者計算了命運偏倚移必，并從主分化曲線中提取了屬于紅系軌跡的細胞[參見（25）]≌奔總共分選了264個野生型細胞和215個Mof +/-細胞，并分析了沿紅系軌跡的14,279個基因的表達秒赤。具有相似表達模式的基因被聚集到同個節(jié)點中（Pearson相關系數(shù)猪瞬，> 0.85；基因/節(jié)點列表在補充數(shù)據(jù)中提供）入篮。這項分析使作者能夠確定沿軌跡的基因表達活動的時間陈瘦。總體而言潮售，作者發(fā)現(xiàn)Mof +/-動物與野生型的基因表達模式相比存在顯著差異（圖6B）痊项。例如，正常情況下酥诽，節(jié)點1至16中共有3449個基因在早期階段表達鞍泉，但在Mof +/-動物中，它們在偽時間晚得多（圖6肮帐，B和C）咖驮。通常在Mof單倍不足的分化后期边器， Zfpm1等在譜系定型的階段（節(jié)點45至49，2966個基因）中正常表達的基因未顯示出統(tǒng)一的表達模式托修。Mof本身出現(xiàn)在節(jié)點42中忘巧，該節(jié)點在Mof +/-細胞中譜系確定的階段顯示出單個明顯的峰。節(jié)點42也含有紅細胞生成的主調節(jié)劑睦刃，如Klf1砚嘴，GATA1，Gfi1b和EPOR涩拙，與MOF相似际长，MOF* +/-小鼠晚期相對于野生型，顯示顯著異常上調吃环。此外也颤，通過GO分析（圖S9C，請參閱補充數(shù)據(jù)）郁轻，該cluster顯示出對已知紅系TF的富集翅娶。在Mof +/-軌跡中發(fā)現(xiàn)的這些顯著差異也通過Monocle在基于軌跡的差異基因表達分析中得到了評分，相比野生型Mof +/-細胞好唯，明顯下調的基因有1063個（P <0.05竭沫；請參閱補充數(shù)據(jù)）。些分析表明骑篙，在Mof +/-小鼠中少數(shù)HSCs紅系命運的確完全發(fā)生了異常蜕提。
這些發(fā)現(xiàn)促使作者測試是否可以通過恢復H4K16ac沉積來拯救紅系譜系規(guī)范。為此靶端，作者使用了Mof -iKO HSC谎势，將其轉染了編碼野生型Mof（Mof）或催化失活突變體（Mof E350Q）的表達載體（圖6D）。通過異位表達Mof杨名，作者不僅恢復了Runx1和Gfi1b的水平脏榆，而且還恢復了紅系集落的形成。相比之下，Mof催化突變體無法挽救這些特征（圖6，E和F和圖贴硫。S9D）。接下來坞生，作者想知道是否可以通過表達主要的類紅細胞TF或提高乙酰化水平來改善這些促紅細胞生成的干擾掷伙。為此是己，作者用Gata1的表達載體轉染了Mof -iKO HSPC，并通過FACS對HSC進行了分類（圖S9E）任柜。平行地赃泡，用組蛋白脫乙酰酶抑制劑例-527處理MOF -iKO或MOF +/-造血干細胞（處理過的42寒波，43），以提高總體H4K16ac水平升熊。集落形成試驗表明俄烁，在兩種情況下，紅系軌跡均被完全拯救（圖6级野，G到M和圖S9页屠，從F到H）。值得注意的是蓖柔，異位表達的Mof在野生型細胞中也顯示出擾動的集落形成辰企，認為Mof劑量在HSC分化過程中起著至關重要的作用】雒總之牢贸，作者的結果表明，Mof的適當劑量和定時表達可調節(jié)TF相互調節(jié)的網(wǎng)絡镐捧，如Runx1潜索，Gfi1b和Gata1，它們的表達受MOF介導的組蛋白乙醵矗化作用調節(jié)（圖S9I）竹习。這些結果確立了譜系特異性H4K16ac驅動的染色質可及性在體內紅系命運中的關鍵作用。
總結
看我的樣本數(shù)據(jù)介紹列牺，就知道作者分析的數(shù)據(jù)很多了吧≌埃現(xiàn)在的難點：就是多組學整合分析，作者在多組學數(shù)據(jù)整合分析中各組學分析相互驗證瞎领，并且有很多實驗驗證泌辫，是一篇工作滿滿的文獻，剛入門真正理解還是挺難的九默，和大家一起學習震放，至于詳細的實驗方法和附加圖材料，感興趣的讀者看原文哈荤西！https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R25 關于此文獻對我目前工作所提供的靈感就不和大家分享了，有問題的留言哈伍俘！ 頭腦風暴：想想閱讀此文獻你得到了什么好點子邪锌？
