文獻(xiàn)

2022

Molecular Plant

Genome architecture and tetrasomic inheritance of autotetraploid potato

研究背景

栽培馬鈴薯是一種世界范圍的主糧作物。

同源四倍體栽培馬鈴薯表現(xiàn)出高度雜合的基因組，并且主要是無(wú)性繁殖的，因此育種效率普遍更低拨脉。?

自從單倍體馬鈴薯的第一個(gè)參考基因組(DM1-3516 R44)與2011年發(fā)布撵溃，已經(jīng)陸續(xù)報(bào)道了各種野生和栽培二倍體馬鈴薯的參考基因組圃伶。然而她肯，解決同源四倍體馬鈴薯基因組中的四個(gè)單倍型仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)胆绊。?

同源多倍體基因組從頭組裝的最大障礙是區(qū)分和分離非常相似的單倍型了牛，這些單倍型通常被組裝成高度片段化的序列颜屠。

亮點(diǎn)

作者結(jié)合了HiFi數(shù)據(jù)、HiC數(shù)據(jù)和單倍體參考基因組鹰祸，成功組裝了同源四倍體馬鈴薯四個(gè)單倍型甫窟。

結(jié)論1?同源四倍體單倍型分型的基因組組裝

作者選擇同源四倍體馬鈴薯品種C88進(jìn)行測(cè)序和基因組組裝，C88是一個(gè)高產(chǎn)蛙婴、抗晚疫病的商品馬鈴薯品種粗井。它是以印度馬鈴薯I-1085為母本，以S.tuberosum組的Andigena為父本雜交而成的街图。在20世紀(jì)90年代由國(guó)際馬鈴薯中心和中國(guó)云南師范大學(xué)開發(fā)后浇衬，C88已成為中國(guó)西南地區(qū)的首選品種，并迅速被鄰近省份和其他東南亞國(guó)家采用餐济。

結(jié)論2 C88基因組的初步組裝和分型?

Fig S1

根據(jù)K-mer調(diào)查和流式分析耘擂，估計(jì)C88基因組大小約為3Gb (Fig S1)。

Fig 1a

利用33×的HiFi數(shù)據(jù)絮姆，使用hifiasm軟件進(jìn)行組裝醉冤，得到了3.08Gb的基因組草圖（C88.v0.1, Fig 1a）。接下來(lái)篙悯，我們嘗試在Hi-C數(shù)據(jù)和單倍型參考基因組的幫助下蚁阳，將unitig 分配到不同的單倍型，這種方法已在栽培苜蓿和甘蔗的同源四倍體基因組組裝中成功應(yīng)用鸽照，然而結(jié)果不太理想螺捐。

Fig S2

將HiFi讀數(shù)映射到這些unitigs上，然后在C88.v0.1中鑒定出2.61 Gb的單倍型基因組，其中325.68 Mb的diplotigs (2×)和triplotigs (3×)顯示出顯著的雙倍和三倍體讀數(shù)覆蓋率（Fig S2a）归粉。作者之前開發(fā)了一套流程，可以從二倍體馬鈴薯基因組中鑒定單倍型漏峰。為了使用四倍體遺傳圖譜對(duì)C88進(jìn)行單倍體分型糠悼，作者將1034個(gè)S1子代的重測(cè)序讀數(shù)比對(duì)到C88.v0.1上（Fig S2b），并計(jì)算子代中每個(gè)單倍型的遺傳劑量(0浅乔，1倔喂，2，3靖苇，4)席噩。通過劑量分?jǐn)?shù)的分組，約2.08 Gb的單倍型構(gòu)建了48組贤壁，代表12條染色體的4個(gè)單倍型悼枢。基于劑量分?jǐn)?shù)脾拆，2x馒索，3x區(qū)域被解壓縮為兩個(gè)或三個(gè)相同的拷貝，代表737.09 Mb的單體肽序列名船，并根據(jù)它們與分組單體肽的連鎖關(guān)系被分成48組绰上。

結(jié)論3 C88基因組的遺傳相位輔助多倍體圖譜分組

Fig 1b

根據(jù)分組的unitigs, 89.7％的不連續(xù)HiFi reads（未被其他更長(zhǎng)reads覆蓋的reads）被分配到48個(gè)單倍體（Fig 1b），并且相位信息輸入到hifiasm的多倍體圖譜分組中渠驼。

在之前的hifiasm圖譜分組中蜈块，使用三倍體信息來(lái)改善二倍體基因組中的雜合區(qū)域組裝。在本研究中迷扇，作者首次將此應(yīng)用擴(kuò)展到自四倍體基因組百揭，通過將經(jīng)過預(yù)分相的HiFi reads輸入到hifiasm中。在此次hifiasm運(yùn)行后蜓席，獲得了四組contigs信峻，分別為總大小為954.57 Mb、918.61 Mb瓮床、900.16 Mb和894.06 Mb的contigs（以下簡(jiǎn)稱為H1盹舞、H2、H3和H4）隘庄。對(duì)于每組踢步，使用Hi-C數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類和排序，生成了12條染色體丑掺。

在去除質(zhì)粒和冗余序列后获印，獲得了單倍型分型的C88參考記憶怒斬（C88.v1），總大小為3.15 Gb街州，contig N50長(zhǎng)度為18.78 Mb兼丰，其中有3.03 Gb的序列錨定在48條染色體上玻孟，共檢測(cè)到44個(gè)端粒（Fig 1b）。

結(jié)論4 單倍型分型基因組的評(píng)估

Fig S7

Fig S8

C88.v1的單倍型完整性和準(zhǔn)確性通過六個(gè)獨(dú)立分析進(jìn)行評(píng)估：

（1）k-mer分布表明在C88.v1中解決了那些未成功組裝的的序列鳍征，單倍型解析的特性也得到了HiFi reads均勻分布的映射覆蓋的支持（Fig S7）黍翎。

（2）為了評(píng)估相位準(zhǔn)確性，我們使用ONT UL reads基于Whatshap polyphase構(gòu)建了分型區(qū)塊艳丛。在66,370個(gè)分型區(qū)塊中匣掸，包含3,400,173個(gè)SNPs,分型區(qū)塊與四個(gè)組裝的單倍型之間的一致性分別為97.86%（H1），98.58%（H2）氮双，97.96%（H3）和98.58%（H4）碰酝，表明我們的相位化組裝與從UL reads生成的本地相位具有較高的一致性。

（3）為了驗(yàn)證結(jié)構(gòu)的正確性戴差，我們檢測(cè)了C88.v1與單倍體馬鈴薯參考基因組DMv6.1之間長(zhǎng)度從50 kb到200 kb的結(jié)構(gòu)變異送爸，并手動(dòng)檢查了SV區(qū)域的UL reads映射。僅使用映射長(zhǎng)度>100 kb的UL reads進(jìn)行分析暖释。在179個(gè)具有超過三個(gè)UL reads覆蓋的SV中碱璃，97.7%的SV由UL reads跨越斷點(diǎn)。

（4）使用Illumina數(shù)據(jù)饭入，我們確定最終組裝具有非常高的堿基準(zhǔn)確性（質(zhì)量值QV 46.6）和完整性（99.05%）嵌器。

（5）基于BUSCO對(duì)組裝進(jìn)行的分析確定每個(gè)單倍型中超過97%的完整基因，并且重復(fù)基因的比例小于3%谐丢，表明單倍型的完整性爽航。

（6）scaffolds的遺傳連鎖強(qiáng)度和Hi-C矩陣也支持分型組裝的質(zhì)量（Fig S8）。

總體而言乾忱，C88的單倍型組裝相對(duì)完整讥珍，包含同型純合區(qū)域，其中包括四套單倍體基因組基因窄瘟，并且在SNP相位和大規(guī)模結(jié)構(gòu)上顯示出較高的準(zhǔn)確性衷佃。

基于239,331個(gè)PacBio全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本和來(lái)自20個(gè)組織的162 Gb Illumina RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，在C88基因組中預(yù)測(cè)到150,853個(gè)蛋白編碼基因和217,651個(gè)可變剪接蹄葱。

對(duì)基因注釋的BUSCO評(píng)估顯示每個(gè)單倍型中93.8%至95.3%的基因是完整的氏义，而在合并集中為99.2%。

結(jié)論5?五馬鈴薯同源四倍體基因組的單倍型間多樣性

結(jié)論5.1 序列差異：SNP图云、InDels和SV

Fig 2

為了對(duì)C88基因組內(nèi)部基因組多樣性進(jìn)行全基因組評(píng)估惯悠，我們選擇每個(gè)染色體上最長(zhǎng)的單倍型來(lái)構(gòu)建C88的偽單倍體基因組。

根據(jù)分型的的HiFi reads比對(duì)竣况，總共檢測(cè)到11,964,627個(gè)SNPs和1,056,892個(gè)InDels克婶，分布在四個(gè)單倍型的12條染色體上，大約占偽單倍體基因組的1.86%（Fig 2a）。主成分分析表明情萤，在2鸭蛙、4、9和11號(hào)染色體的單倍型之間存在相對(duì)均勻的距離筋岛，而1娶视、3、5泉蝌、6歇万、7揩晴、8勋陪、10和12號(hào)染色體的單倍型則聚集成兩個(gè)或三個(gè)群組。單倍型之間的局部差異水平也有所變化硫兰，在某些區(qū)域中具有顯著減少的變異诅愚。

以11號(hào)染色體為例，盡管根據(jù)主成分分析四個(gè)單倍型分散在不同位置劫映，但chr11_1與chr11_4在17-38 Mb的區(qū)域非常相似违孝，而chr11_2和chr11_3在19-33 Mb的區(qū)域顯示高度序列相似性。此外泳赋，chr10_2雌桑、chr10_3和chr10_4共享37.2 Mb的單倍型序列，在組裝過程中形成了三倍體的折疊區(qū)域祖今，但它們?cè)谌旧w10的兩個(gè)近端端粒區(qū)域具有7.58個(gè)SNP/kb的多樣性水平校坑。

作者還檢測(cè)到11,097個(gè)具有存在/缺失變異（PAV）的基因和50,360個(gè)單倍型之間的結(jié)構(gòu)變異，包括431個(gè)大型SVs（>100 kb）千诬，影響了902.76 Mb的序列耍目。在7號(hào)染色體的一個(gè)900 kb的同源區(qū)域上獲得了放大視圖，以展示四個(gè)單倍型之間的廣泛差異（Fig 2b）徐绑。

結(jié)論5.2 近著絲粒區(qū)域和著絲粒區(qū)域的可變重復(fù)序列

將HiFi reads映射到偽單倍體基因組并在四個(gè)單倍型之間進(jìn)行整合性分析時(shí)邪驮，一些區(qū)域幾乎沒有被同源單倍型覆蓋。這些區(qū)域的長(zhǎng)度范圍從0.8 Mb到37.1 Mb不等傲茄。根據(jù)它們?cè)谌旧w上的位置毅访，推斷它們可能是著絲粒，并將從單倍體馬鈴薯基因組中鑒定出的六個(gè)著絲粒重復(fù)序列（St18盘榨、St24俺抽、St49、St57较曼、St3-58和St3-238）與這些區(qū)域進(jìn)行了比對(duì)磷斧。

在24個(gè)目標(biāo)單倍型中，有14個(gè)單倍型上觀察到了長(zhǎng)度可變的重復(fù)序列富集，長(zhǎng)度范圍從19 kb到4.5 Mb不等這提示了著絲粒的位置弛饭。在染色體1上冕末，St24在chr1_2、chr1_3和chr1_4上分別形成了99 kb侣颂、4.6 kb和4.5 Mb的重復(fù)序列富集區(qū)档桃，而chr1_1上沒有觀察到重復(fù)序列富集。在染色體5和6上憔晒，重復(fù)序列富集只在四個(gè)單倍型中的一個(gè)單倍型上檢測(cè)到藻肄。

為了全面了解48個(gè)單倍型上的周著絲粒和著絲粒區(qū)域，作者使用StainedGlass對(duì)缺乏整合性的區(qū)域進(jìn)行了重新比對(duì)拒担，使用1 kb的窗口嘹屯，并鑒定了單倍型特異性的、兆堿基大小的重復(fù)序列富集區(qū)从撼。根據(jù)高度重復(fù)重復(fù)序列的富集情況州弟，可以將48個(gè)單倍型分為三類，即與同源單倍型共享重復(fù)序列的單倍型低零、攜帶獨(dú)特重復(fù)序列的單倍型以及沒有明顯重復(fù)序列的單倍型婆翔。chr1_1具有兩個(gè)獨(dú)特的重復(fù)序列富集區(qū)，占據(jù)了3.69 Mb的區(qū)域掏婶，而chr1_4啃奴、chr1_2和chr1_3共享兩個(gè)重復(fù)序列富集區(qū)，長(zhǎng)度分別為1.43 Mb雄妥、1.61 Mb和1.28 Mb（Fig 2c）最蕾。

除了Chr3外，所有染色體上都檢測(cè)到了單倍型特異性的重復(fù)序列富集區(qū)茎芭。與擬南芥和水稻等基因組中高度相似的著絲粒衛(wèi)星重復(fù)序列不同揖膜，同源四倍體馬鈴薯基因組在同源單倍型上展示出明顯不同的周著絲粒和著絲粒特征，表明著絲粒序列的快速進(jìn)化梅桩。

結(jié)論5.3 野生馬鈴薯在C88基因組的漸滲

野生物種的引入被認(rèn)為增加了栽培作物的雜合性壹粟。

通過將20份野生二倍體馬鈴薯的HiFi數(shù)據(jù)比對(duì)到C88基因組，發(fā)現(xiàn)C88單倍型與這些野生基因組之間存在不同程度的相似性宿百。野生馬鈴薯的reads覆蓋了C88基因組的25.52%趁仙，覆蓋深度超過20×，表明可能存在大量的野生品種引入垦页。在單倍型chr1_1雀费、chr2_1、chr4_1痊焊、chr4_3盏袄、chr4_4忿峻、chr5_2、chr7_2和chr9_3上辕羽，可能的引入?yún)^(qū)域占據(jù)了超過50%的單倍型逛尚。在35個(gè)檢測(cè)到的類似著絲粒重復(fù)序列區(qū)域中，有30個(gè)區(qū)域與可能的引入?yún)^(qū)域重疊刁愿，這表明野生馬鈴薯序列可能對(duì)C88單倍型的獨(dú)特著絲粒起到了貢獻(xiàn)作用绰寞。

結(jié)論5.4 等位基因的差異表達(dá)

Fig S12

為了揭示四個(gè)單倍型上同源基因的表達(dá)模式，作者在單倍型間的同源區(qū)塊中鑒定了23,086個(gè)四等位基因位點(diǎn)铣口，即每個(gè)單倍型擁有一個(gè)等位基因滤钱，并在20個(gè)組織中分析了它們的表達(dá)情況。

對(duì)于每個(gè)組織，根據(jù)四個(gè)等位基因的相對(duì)表達(dá)水平，我們將等位基因的表達(dá)分類為平衡表達(dá)、顯性表達(dá)和抑制表達(dá)（Fig S12a）。平均而言避诽，在一個(gè)組織中，49.1%的四等位基因位點(diǎn)顯示出四個(gè)等位基因之間的差異表達(dá)白热，其中3.4%的位點(diǎn)擁有單個(gè)顯性表達(dá)的等位基因（Fig S12B）搀崭。在特定單倍型上并沒有明顯的偏好表達(dá)。

在C88基因組中秒梅，我們觀察到一個(gè)位點(diǎn)上的等位基因在這20個(gè)組織中呈現(xiàn)出變化的表達(dá)模式旗芬。在23,086個(gè)位點(diǎn)上的92,344個(gè)等位基因中，61.7%（56,942個(gè)）在這20個(gè)組織中至少表現(xiàn)出兩種表達(dá)類型捆蜀，顯示了自花四倍體馬鈴薯基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)性質(zhì)疮丛。

結(jié)論6 同源四倍體馬鈴薯基因組中的四倍體遺傳

Fig 3

在同源四倍體的減數(shù)分裂中，存在許多與二倍體和異源多倍體不同的特征辆它，比如多價(jià)染色體的配對(duì)和偏好配對(duì)誊薄，以及雙減數(shù)分裂（DR）。這些特征長(zhǎng)期以來(lái)一直是四倍體馬鈴薯和其他多倍體作物的研究重點(diǎn)锰茉。在本研究中呢蔫，我們?cè)贑88的自交群體中觀察到了這些有價(jià)值的事件。

在對(duì)1034個(gè)S1個(gè)體中的9834個(gè)基因型化的SNP進(jìn)行分析飒筑，檢測(cè)到四倍體馬鈴薯群體中二價(jià)配對(duì)和多價(jià)配對(duì)的頻率片吊。在二價(jià)配對(duì)中未觀察到與隨機(jī)配對(duì)有偏差，而在四價(jià)配對(duì)中协屡，在C88自交群體中顯示出50%到70%的頻率俏脊，顯著高于外交馬鈴薯群體中所報(bào)道的平均19%。這種差異可能是由于親本品系的基因組成分的變異肤晓。

根據(jù)多價(jià)配置爷贫，DR的發(fā)生取決于減數(shù)分裂I期同源染色體的DNA交換认然，而攜帶相同單倍型的姐妹染色單體在減數(shù)分裂II期被拉向同一極。根據(jù)DR在端粒和著絲粒之間的染色體位置漫萄，其理論頻率計(jì)算為0至1/6季眷。

為了研究同源四倍體馬鈴薯中DR的分布情況，我們使用低覆蓋度測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)C88的自交群體進(jìn)行了基因分型卷胯。盡管在自交群體中檢測(cè)DR存在局限性子刮，但我們?nèi)匀辉谏婕?034個(gè)測(cè)序子代中的1021個(gè)的12條染色體上觀察到1%至4%的DR頻率（Fig 3）。DR的分布在同源單倍型上有所變異窑睁。對(duì)于48個(gè)單倍型中的32個(gè)挺峡，DR頻率向染色體的兩個(gè)端粒遞增，并且在近著絲粒區(qū)域檢測(cè)到降低的DR頻率担钮，這與基于SNP遺傳圖譜的先前研究一致橱赠。然而，在其余的16個(gè)單倍型中箫津，只有一個(gè)或沒有DR頻率峰值在端粒區(qū)域狭姨。以Chr7為例，chr7_1苏遥、chr7_3和chr7_4在近端端粒區(qū)域顯示出DR頻率峰值饼拍，最高頻率分別為2%、1%和1%田炭，而chr7_2在另一個(gè)近端端粒區(qū)域顯示出2.5%的頻率峰值师抄。

結(jié)論7 栽培四倍體植物雜種優(yōu)勢(shì)起源

Fig 4a-b

多倍體被認(rèn)為與馴化有著密切的關(guān)聯(lián)，并通過提供更有利的基因和遺傳多樣性來(lái)促進(jìn)作物的早期馴化教硫，這有利于增強(qiáng)適應(yīng)性叨吮。四倍體馬鈴薯源自于地方品系的二倍體間的雜交。為了研究多倍體對(duì)現(xiàn)代馬鈴薯品種發(fā)展的影響瞬矩，我們使用C88基因組中父母單倍型的組合模擬了兩個(gè)二倍體配子的雜交茶鉴。我們對(duì)C88的母本I-1085進(jìn)行了基因組測(cè)序，并使用母本特異的純合SNP將C88基因組的48條染色體分為兩組父母單倍型景用。

和其他許多無(wú)性繁殖作物一樣涵叮，馬鈴薯攜帶著嚴(yán)重的突變負(fù)擔(dān)。在C88基因組中丛肢，預(yù)測(cè)到四個(gè)單倍型上有57,641個(gè)功能性有害突變围肥，影響了15,942個(gè)已注釋的基因，將其稱為預(yù)測(cè)的有害等位基因（PDAs）蜂怎。在總共的23,086個(gè)四等位基因座中穆刻，33.05%的基因座攜帶了一個(gè)至三個(gè)PDAs，保持了PDAs在雜合狀態(tài)下（Fig 4a）杠步。

與二倍體馬鈴薯單倍型相比氢伟，在那里23.0%的二等位基因座攜帶雜合PDAs榜轿，四倍體馬鈴薯單倍型通過提供更多的基因副本作為有缺陷等位基因的備份，顯示出更高水平的功能互補(bǔ)朵锣。就父母單倍型而言谬盐，在744個(gè)四等位基因座中，兩個(gè)母本等位基因都是PDAs诚些，而父本單倍型提供了未受影響的等位基因（Fig 4B）飞傀。相反情況是，在2366個(gè)四等位基因座中诬烹，有兩個(gè)父本PDAs和至少一個(gè)未受影響的母本等位基因砸烦。因此，在雜交中绞吁，配子中的兩個(gè)無(wú)功能等位基因會(huì)在四倍體合子中以雜合狀態(tài)被另一個(gè)親本屏蔽幢痘。在自發(fā)多倍化中，2N配子上的純合有害突變會(huì)以這種方式被掩蓋家破，從而減少有害突變的積累帶來(lái)的危害作用颜说。這可能是存在有利的四倍體栽培品種的基礎(chǔ)。

Fig S16

在C88基因組中汰聋，檢測(cè)到了1079個(gè)父本特有基因和1253個(gè)母本特有基因门粪。父母間的雜交賦予四倍體更豐富的遺傳多樣性，為育種中篩選積累的優(yōu)良性狀提供了可能性马僻。

晚疫病是由普通馬鈴薯疫霉引起的最嚴(yán)重的病害庄拇，已經(jīng)影響馬鈴薯產(chǎn)量超過兩個(gè)世紀(jì)注服。C88對(duì)普通馬鈴薯疫霉在葉片和塊莖上具有高度持久的抗性韭邓。使用avr蛋白進(jìn)行浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)表明，Avr1和Avr2在C88馬鈴薯葉片上引發(fā)了顯著的超敏反應(yīng)（HR）表型（Fig S16）溶弟。

Fig 4c

通過對(duì)Solanum demissum的人工合成染色體（BAC）克隆PGEC472P22女淑，作者將R1基因定位到chr5_3上，該克隆攜帶了R1基因（Fig 4c）辜御，并使用具有HR表型的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本將R2基因定位到chr4_3上鸭你。R1和R2都來(lái)自父本單倍型，表明C88品種的持久抗性主要?dú)w因于其父本的背景擒权。

C88主要作為夏季作物在云南省種植袱巨，該地區(qū)位于北緯20°至30°之間，在夏季有更長(zhǎng)的日照時(shí)間碳抄。在這種條件下愉老，C88的母本提供了更好的本地適應(yīng)性，而父本的適應(yīng)性較差剖效。C88在夏季成熟期很晚嫉入，生長(zhǎng)期為120-150天焰盗。對(duì)晚熟馬鈴薯基因StCDF1.1的篩選顯示，其中三個(gè)等位基因是相同的咒林，而一個(gè)等位基因在編碼序列中攜帶了一個(gè)3個(gè)堿基的缺失熬拒，導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的缺失，位于三個(gè)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域之外垫竞，似乎不太可能影響基因功能（Fig 4c）澎粟。因此，來(lái)自兩個(gè)父本的StCDF1.1的四個(gè)等位基因很可能賦予了C88的晚熟表型欢瞪，在較長(zhǎng)的日照條件下確保其適應(yīng)亞熱帶地區(qū)捌议。父本單倍型的功能基因的積累使C88成為一個(gè)具有良好適應(yīng)。