摘要
百合以其優(yōu)雅的外觀和迷人的香味成為世界上最重要的經(jīng)濟(jì)花卉(huì)之一街夭，主要由單萜羅勒烯(xī)涂乌、芳樟(zhāng)醇和苯類(lèi)化合物組成。糖是植物的主要產(chǎn)物捎泻，果糖和己糖是植物中大多數(shù)有機(jī)化合物和代謝途徑的底物。在此诡曙，我們從‘西伯利亞’百合花中分離并表征己糖激酶（LoHXK）和果糖激酶（LoFRK）的功能臀叙，這表明它們?cè)诨ㄏ惝a(chǎn)生中的潛在作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明LoHXK和LoFRK在花絲中高表達(dá)价卤。過(guò)表達(dá)和病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）分析表明劝萤，LoHXK和LoFRK通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)揮發(fā)性合成基因（LoTPS1和LoTPS3）的表達(dá)顯著改變了β-羅勒烯和芳樟醇含量的排放。在外源葡萄糖和果糖作用下慎璧，β-羅勒烯和芳樟醇增加床嫌，關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平上調(diào)，β-羅勒烯和芳樟醇的排放遵循晝夜節(jié)律胸私。通過(guò)13C標(biāo)記的葡萄糖和13C標(biāo)記的果糖實(shí)驗(yàn)測(cè)定碳通量表明厌处，羅勒烯和芳樟醇的質(zhì)譜顯著增加，但是岁疼，苯甲酸乙酯的m/z比沒(méi)有變化阔涉。此外，酵母雙雜交(Y2H）和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC）測(cè)定結(jié)果表明LoFRK與LoMYB1和LoMYB2蛋白相互作用捷绒」迮牛總之，這些結(jié)果表明己糖激酶和果糖激酶可能在調(diào)節(jié)‘西伯利亞’百合羅勒烯和芳樟醇的生物合成中發(fā)揮重要作用暖侨。
1. 介紹
花香是開(kāi)花植物的一個(gè)重要特征椭住，在植物生命活動(dòng)中起著許多關(guān)鍵作用，尤其是在吸引傳粉者字逗，抵御病原體和食草動(dòng)物方面京郑。花香是開(kāi)花植物和傳粉者之間重要的交流途徑葫掉，尤其是在長(zhǎng)距離信號(hào)傳遞中傻挂，并且是吸引傳粉者的化學(xué)信號(hào)⊥谙ⅲ花香通過(guò)對(duì)微生物和食草動(dòng)物害蟲(chóng)產(chǎn)生威懾或毒性作用，并最大限度地減少氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激造成的損害兽肤，在植物抵御生物和非生物脅迫方面也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用套腹。花香不僅對(duì)提高觀賞植物的審美價(jià)值很重要资铡，而且對(duì)制藥电禀、食品和化妝品行業(yè)也必不可少。
糖在植物生長(zhǎng)和發(fā)育笤休、開(kāi)花尖飞、頂端優(yōu)勢(shì)以及抵御外部刺激方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樗鼈兪翘脊羌堋B透保護(hù)劑和幾種防御反應(yīng)調(diào)節(jié)途徑中的信號(hào)分子的供體政基，遺傳分析揭示了植物激素信號(hào)與糖之間的相互作用贞铣。果糖激酶(FRK)和己糖激酶(HXK)是唯一的果糖和已發(fā)現(xiàn)的葡萄糖磷酸化酶，參與植物中幾種有機(jī)代謝的途徑沮明。
在植物中辕坝，己糖（葡萄糖和果糖）大量產(chǎn)生，是自然界有機(jī)物的主要來(lái)源荐健。HXK在己糖的磷酸化中起核心作用酱畅。己糖激酶還在通過(guò)信號(hào)傳感和轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)植物糖代謝中發(fā)揮重要作用，這些機(jī)制調(diào)節(jié)響應(yīng)外部刺激的幾個(gè)基因的表達(dá)江场。HXK1蛋白在不同的生理過(guò)程中具有多種功能纺酸，例如花粉萌發(fā)和花藥裂開(kāi)。紅花煙草HXK1和AtHXK1具有雙重功能活性址否，介導(dǎo)糖感應(yīng)和己糖磷酸化餐蔬。此外，它們還在程序化細(xì)胞死亡在张、萌發(fā)用含、氣孔關(guān)閉和對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)。在葡萄中帮匾，HXK在蔗糖合酶（SuSy）和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（CWINV）的調(diào)節(jié)中起重要作用啄骇。外源性葡萄糖(Glc)應(yīng)用通過(guò)增加擬南芥信號(hào)傳導(dǎo)和ABA合成基因的表達(dá)，使其內(nèi)源性ABA水平升高瘟斜。HXK亞細(xì)胞定位結(jié)果表明缸夹，它們分布在線粒體、細(xì)胞質(zhì)螺句、質(zhì)體基質(zhì)和葉綠體中虽惭。HXK基因已在各種植物中得到鑒定，但HXK在‘西伯利亞’百合中的作用仍有待闡明蛇尚。
果糖激酶（FRK）是植物中主要的果糖磷酸化酶芽唇。在植物和細(xì)菌中，F(xiàn)RKs將果糖（Fru）磷酸化為6-磷酸果糖（F6P）取劫，而哺乳動(dòng)物FRKs將果糖磷酸化為1-磷酸果糖（F1P）匆笤。FRK已從許多其他植物物種中分離和表征，包括番茄谱邪、擬南芥炮捧、馬鈴薯、水稻惦银、甜菜咆课、豌豆末誓、大麥、玉米书蚪、菠菜喇澡、和鱷梨。其中善炫，來(lái)自番茄的FRKs在功能和生化方面得到了很好的表征撩幽。在番茄中，SlFRK1和SlFRK2促進(jìn)開(kāi)花并在根和莖生長(zhǎng)以及種子發(fā)育中發(fā)揮重要作用箩艺。在擬南芥的根和地上部窜醉，已經(jīng)鑒定出兩種FRK基因的豐富表達(dá)，但是編碼這些活動(dòng)的基因功能尚不清楚艺谆。在雜交白楊（Populus tremula x tremuloides）中榨惰，F(xiàn)RK2在形成木質(zhì)纖維素的碳通量中起著至關(guān)重要的作用。上述數(shù)據(jù)表明静汤，果糖激酶在植物生命活動(dòng)中起著重要作用琅催，并且可以作為果糖受體來(lái)調(diào)節(jié)植物的開(kāi)花和結(jié)果。
‘西伯利亞’百合（東方雜種）是百合科多年生草本植物虫给，由于其大而雪白藤抡、芳香的花組織在全球花卉市場(chǎng)上占有突出地位，是研究花香的極好資源抹估。萼(è)片和花瓣是花香散發(fā)的關(guān)鍵來(lái)源缠黍，其發(fā)生在與傳粉者活動(dòng)一致的晝夜節(jié)律中。萜類(lèi)化合物和苯類(lèi)化合物药蜻，如羅勒烯瓷式、芳樟醇、月桂烯语泽、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯在花香中含量豐富贸典，但是，目前還沒(méi)有關(guān)于植物揮發(fā)物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的信息踱卵。在百合轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出15個(gè)LoFRK和6個(gè)LoHXK基因廊驼。在此處，我們揭示了果糖激酶和己糖激酶在‘西伯利亞’百合花香味產(chǎn)生中的催化和調(diào)節(jié)作用惋砂。
2. 材料與方法
2.1?植物材料和生長(zhǎng)條件
‘西伯利亞’百合和擬南芥在以下條件下妒挎，在生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)：26±2℃，65–80%相對(duì)濕度和12/12小時(shí)光/暗循環(huán)班利。為了分析組織特異性表達(dá)模式，將花發(fā)育過(guò)程（芽期到衰老）分為五個(gè)階段榨呆，如圖3c所示（D1：芽；D2：部分開(kāi)放暖夭；D3：半開(kāi)花软瞎；D4：盛開(kāi)；D5：衰老）彻消。
2.2?外源性葡萄糖和果糖處理
對(duì)于葡萄糖和果糖的處理，在芽期選擇花（圖3）并在上述條件下放置在培養(yǎng)箱中宙拉。葡萄糖和果糖溶液（6%）用無(wú)菌水制備宾尚，將花蕾期的花放入盛有葡萄糖和果糖溶液的燒杯中，在盛開(kāi)階段通過(guò)GC-MS進(jìn)行花卉揮發(fā)性分析谢澈。13C標(biāo)記的果糖煌贴、葡萄糖和其他化學(xué)品購(gòu)自Sigma-Aldrich(MO,美國(guó)）。13C標(biāo)記的果糖和葡萄糖的處也采用了類(lèi)似的方法锥忿。為了評(píng)估花揮發(fā)物的晝夜節(jié)律模式牛郑，在上述溫度條件下，將花保持在完全黑暗的環(huán)境中敬鬓。
2.3?LoHXK和LoFRK的生物信息學(xué)分析和克隆
從‘西伯利亞’百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表）中淹朋，基于基因本體（GO）術(shù)語(yǔ)分析確定了LoXHK和LoFRK。LoXHK和LoFRK的直系同源物是通過(guò)NCBI中的BLAST程序以默認(rèn)參數(shù)識(shí)別的钉答。LoXHK和LoFRK與從不同物種鑒定的其他HXK和FRK的多序列比對(duì)(MSA)使用CLUSTALX進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是使用MEGA7中的比對(duì)序列通過(guò)具有1000次引導(dǎo)復(fù)制的鄰居連接(NJ)方法構(gòu)建的础芍。LoHXK和LoFRK的開(kāi)放閱讀框按照制造商的說(shuō)明克隆到載體pMD19-T（TaKaRa）中，然后通過(guò)測(cè)序確認(rèn)数尿，正向和反向引物列在補(bǔ)充表1中仑性。
2.4?RNA分離、cDNA轉(zhuǎn)化和qRT-PCR分析
從不同器官中分離總RNA以評(píng)估LoHXK和LoFR的組織特異性表達(dá)模式分析（圖3a和b）砌创。為了評(píng)估晝夜節(jié)律虏缸，在開(kāi)花后以8小時(shí)的間隔收集樣品。第一個(gè)樣本是在早上(8:00)和下午(16:00)和深夜(24:00)分別采集的嫩实。使用HiPure植物RNA迷你試劑盒(Magen)按照制造商的指南提取不同組織的總RNA刽辙。根據(jù)制造商的指南，使用PrimeScript? RT 試劑盒(TaKaRa)獲得cDNA甲献。參考基因的克隆如前所述（Abbas等宰缤，2020a）。按照制造商的說(shuō)明晃洒，在ABI 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）中使用iTaqTM Universal SYBR? Green Supermix 以20 μL的總體積進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR慨灭。PCR條件遵循先前描述的條件。驗(yàn)證引物的特異性通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線球及⊙踔瑁基因的相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)2-ΔΔCt方法，使用GAPDH作為參考基因吃引。實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析筹陵。引物列于補(bǔ)充表1中刽锤。
2.5?亞細(xì)胞定位分析
LoHXK和LoFRK的N端序列（1 bp到120 bp）使用不同的預(yù)測(cè)服務(wù)器進(jìn)行分析，例如Predotar (http://urgi.versailles.inra.fr/predotar),WoLF PSORT (http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/) 和TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ ）朦佩。使用Spe I和Sac I作為限制性位點(diǎn)并思，將兩個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)克隆到載體p35S-GFP中，然后進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)正確插入到載體中语稠。擬南芥原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化如前所述（Yoo等宋彼，2007）。融合構(gòu)建體CaMv35S-NLS-mCherry（具有核定位信號(hào)）和CaMv35S-COX11-mCherry分別用作核和線粒體中的定位標(biāo)記仙畦。這兩個(gè)載體（Addgene質(zhì)粒#108881）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供输涕。之后，轉(zhuǎn)化體原生質(zhì)體在黑暗中孵育14-16小時(shí)议泵，然后使用如前所述的共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行可視化占贫，列出了引物在補(bǔ)充表1中。
2.6?酵母雙雜交試驗(yàn)(Y2H)
LoFRK或LoHXK的ORF被克隆到載體pGADT7 (AD)中先口，而LoMYB1型奥、LoMYB2和LoMYB3序列被連接到載體pGBKT7 (BD)中，然后將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化為酵母菌株Y2H Gold碉京，遵循制造商的協(xié)議作為之前解釋過(guò)（Abbas等厢汹，2021）⌒持妫空的AD用作對(duì)照烫葬，通過(guò)酵母細(xì)胞在SD平板(SD/-Leu-Trp-His-Ade)上的生長(zhǎng)證實(shí)了轉(zhuǎn)化體的活性，引物列在補(bǔ)充表1中凡蜻。
2.7?雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)測(cè)定
LoFRK搭综、LoMYB1和LoMYB2的全長(zhǎng)序列被獨(dú)立克隆到載體pUC-SPYNE和pUC-SPYCE中以生成LoFRK-YFPN、LoMYB1-YFPC和LoMYB2-YFPC結(jié)構(gòu)划栓。以空載體作為對(duì)照兑巾，然后將重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到EHA105細(xì)胞中，離心后收集農(nóng)桿菌溶液忠荞，懸浮在含有0.1 M 2-(4-嗎啉)蒋歌、乙磺酸和0.1 M乙酰丁香酮的0.1 MMgCl2中，并以1:1的比例混合1.5小時(shí)委煤。洋蔥表皮浸泡在農(nóng)桿菌液中25分鐘堂油。吸干液體表面后，轉(zhuǎn)移至1/2 MS固體培養(yǎng)基中在25℃下放置孵育3天碧绞。在Leica DM RXA2下觀察細(xì)胞如前所述（Ke等人府框，2019年）。
2.8?病毒誘導(dǎo)的基因沉默
使用大麥條紋花葉病毒(BSMV)系統(tǒng)進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因沉默讥邻。LoFRK的810 bp至999 bp片段和LoHXK序列的1312 bp至1503 bp片段使用Apa I酶作為限制位點(diǎn)將序列插入pCaBS-γ載體以生成pCaBSγ:LoFRK和pCaBSγ:LoHXK構(gòu)建體迫靖，用于抑制LoFRK和LoHXK癣诱。接下來(lái)，構(gòu)造被轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105袜香，隨后如先前解釋的那樣共滲入‘西伯利亞’百合花中。如前所述鲫惶，使用GC-MS系統(tǒng)在盛花期進(jìn)行完整的花揮發(fā)性分析蜈首，并且該實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。
2.9?LoFRK和LoHXK在‘西伯利亞’百合花中的過(guò)表達(dá)
含有卡那霉素和25 μg/mL利福平的新鮮液體培養(yǎng)基在28℃下振蕩過(guò)夜欠母。收集細(xì)菌并以0.6的OD600重懸在含有100 μM AS 的MS液體培養(yǎng)基中欢策。過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建與農(nóng)桿菌如上所述進(jìn)行根癌土壤桿菌浸潤(rùn)過(guò)程。
2.10?花卉揮發(fā)物的頂空分析
花揮發(fā)物分析是將一朵花放入以癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)的2 L玻璃瓶中赏淌，并用鋁片覆蓋30min踩寇，然后將聚二甲基硅氧烷(PDMS)纖維注入玻璃瓶中以進(jìn)行花香揮發(fā)分析。陷害揮發(fā)物30分鐘六水，此后俺孙，將PDMS注入GC-MS系統(tǒng)（安捷倫），如前所述（Abbas等人掷贾，2019）睛榄，并且樣品立即在液氮中冷凍并儲(chǔ)存在-80℃。揮發(fā)性化合物通過(guò)與質(zhì)譜想帅、保留時(shí)間和可靠標(biāo)準(zhǔn)的比較來(lái)鑒定為之前提到過(guò)（Abbas等场靴，2019）。
2.11?可溶性糖的提取
樣品用液氮研磨成粉末港准，使用75%預(yù)冷甲醇提取0.1 g樣品三次旨剥，添加核糖醇作為內(nèi)標(biāo)。以2000 g離心10分鐘后浅缸，將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL 圓形小心去除底部離心管中的雜質(zhì)轨帜，然后加入氯仿和無(wú)菌水，2200×g離心15分鐘疗杉。接下來(lái)阵谚，將溶液通過(guò)0.2 μM的水-可濕性聚四氟乙烯(WWPTFE)膜并濃縮。接下來(lái)烟具，可溶性糖類(lèi)依次用甲氧基胺鹽酸鹽和N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA)進(jìn)行提取和衍生化梢什。最后，如前所述朝聋，使用GC-MS系統(tǒng)（安捷倫）評(píng)估代謝物嗡午。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1?LoHXK和LoFRK的克隆和表征
己糖激酶和果糖激酶基因是使用先前描述的百合轉(zhuǎn)錄組unigenes鑒定的（Abbas等，2019, 2021）冀痕。根據(jù)花中的最高表達(dá)荔睹，選擇LoFRK和LoHXK進(jìn)行進(jìn)一步分析狸演。LoFRK和LoHXK的序列使用‘西伯利亞’百合的cDNA通過(guò)PCR分析和擴(kuò)增如前所述（Abbas等，2019）僻他。LoHXK和LoFRK的編碼序列包括一個(gè)1503和999 b 的開(kāi)放閱讀框(ORF)宵距，編碼500和336個(gè)氨基酸殘基，分子量分別為54和35.7 kDa吨拗，等電點(diǎn)(pI)分別為4.99和5.02满哪。為了分析LoHXK和LoFRK與其他各種植物FRK和HXK蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用臨近法（NJ）建立一個(gè)無(wú)根樹(shù)劝篷。所有HXK蛋白分為3個(gè)不同的組哨鸭，稱(chēng)為G I-GIII（圖1a）。類(lèi)似地娇妓，F(xiàn)RK蛋白分為4個(gè)不同的進(jìn)化枝像鸡，稱(chēng)為G I-G IV（圖1b）。LoHXK與AtHXK1 (66.73%)和AtHXK2 (66.2%) 顯示出高氨基酸序列相似性哈恰，LoFRK與BvFRK (55%) 一樣高度相似只估。
此外，多序列比對(duì)分析表明着绷，這兩個(gè)氨基酸序列均由HXK和FRK蛋白的高度保守特征基序界定仅乓，LoHXK包括高度保守的四環(huán)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這對(duì)于己糖激酶作為糖感應(yīng)蛋白參與植物的各種調(diào)節(jié)途徑是必不可少的（圖1c）蓬戚。同樣夸楣，LoFRK在序列的N和C端以及ATP和糖結(jié)合域的N和C端保持保守的GG和GACD基序，這是pfkB碳水化合物激酶家族的特征（圖1d）子漩，表明FRK基因隨著進(jìn)化是高度保守的豫喧。
3.2?LoHXK和LoFRK的表達(dá)分析
為了研究LoHXK和LoFRK在‘西伯利亞’百合不同組織和花發(fā)育階段的表達(dá)模式，進(jìn)行了定量RT-PCR分析幢泼。結(jié)果表明LoHXK在花藥中的表達(dá)最高紧显，其次是花瓣、根和莖組織缕棵。同樣孵班，LoFRK的mRNA在花藥中表達(dá)最高，其次是根招驴、莖篙程、雌蕊、葉和花瓣組織（圖2a）别厘。此外虱饿，在萼片中幾乎檢測(cè)不到這兩種基因的mRNA（圖3）。對(duì)于花發(fā)育階段，LoHXK的表達(dá)水平在芽期（D1）最低氮发，達(dá)到峰值在開(kāi)花階段（D2-D4）渴肉，然后在衰老中下降階段(D5)（圖2和3）。相比之下爽冕，LoFRK的表達(dá)水平在‘西伯利亞’百合花的衰老階段最高仇祭，在芽和開(kāi)花階段相對(duì)較低（圖2b）。
3.3 外源性葡萄糖和果糖應(yīng)用
我們之前的研究表明颈畸，‘西伯利亞’百合花揮發(fā)物的排放以晝夜模式發(fā)生（Abbas等前塔，2019）。在這里承冰，我們以相同的時(shí)間間隔測(cè)量了‘西伯利亞’百合花中Glc、Fru和蔗糖(Suc)的內(nèi)源含量食零。數(shù)據(jù)顯示Fru含量最高困乒，其次是Glc和Suc（圖4a）。有趣的是贰谣，綜上所述娜搂，內(nèi)源性含量與我們之前研究報(bào)道的花香散發(fā)的晝夜模式一致，即本研究中Glc吱抚、Fru和Suc的內(nèi)源性含量也在下午（16:00）達(dá)到峰值百宇，其次是上午（8:00）和深夜（24:00），表明與花香散發(fā)模式有關(guān)秘豹。為了驗(yàn)證這種聯(lián)系携御，我們將Glc和Fru處理應(yīng)用于花朵和評(píng)估了主要花卉揮發(fā)物的同時(shí)排放水平。在Glc和Fru處理下既绕，羅勒烯的排放水平相對(duì)于對(duì)照花顯著增加啄刹，并遵循上述相同的晝夜節(jié)律模式。Glc處理的花中羅勒烯的排放水平高于Fru處理的花（圖 4b）凄贩。同樣誓军，在Glc和Fru處理下，芳樟醇的排放水平高于對(duì)照疲扎，并遵循上述晝夜節(jié)律模式昵时。此外，Glc處理的花中芳樟醇的濃度高于Fru處理的花（圖4c）椒丧。有趣的是壹甥，相對(duì)于對(duì)照，苯甲酸乙酯的釋放不遵循晝夜節(jié)律模式并且在Glc和Fru處理的花中減少（圖 4d）壶熏。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述數(shù)據(jù)盹廷，從用Glc和Fru處理的‘西伯利亞’百合花中獲得總RNA，并進(jìn)行定量RT-PCR。Glc處理的花中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)揮發(fā)性合成基因(LoTPS1/3)和LoHXK的轉(zhuǎn)錄水平升高俄占，而揮發(fā)性合成基因也隨晝夜節(jié)律表達(dá)模式（圖4e）管怠。類(lèi)似地，與對(duì)照相比缸榄，經(jīng)Fru處理的花中LoTPS1/3和LoRFK的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高度升高渤弛，并遵循上述晝夜節(jié)律表達(dá)模式（圖4f）。值得注意的是甚带，LoTPS1的轉(zhuǎn)錄水平在Glc處理的花中最高她肯，而LoTPS3的表達(dá)水平在Fru處理的花中最高。這些結(jié)果表明Glc和Fru在花揮發(fā)物的釋放通過(guò)調(diào)節(jié)揮發(fā)性結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用鹰贵。
3.4?葡萄糖和果糖的同位素標(biāo)記
穩(wěn)定同位素標(biāo)記是一種有價(jià)值的工具晴氨，已被廣泛用于代謝物的鑒定和定量。驗(yàn)證Glc和Fru的參與作為百合花香味產(chǎn)生的底物碉输，用無(wú)菌水（對(duì)照）籽前、13C-標(biāo)記的Glc和13C-標(biāo)記的Fru處理花朵，然后使用之前描述的GC-MS進(jìn)行分析（Abbas等敷钾，2019枝哄，2020a）。結(jié)果表明阻荒，花香成分（整體香味混合物中每種揮發(fā)物的特性和散發(fā)率）保持不變?nèi)欢幼叮怄満螅_勒烯和芳樟醇的質(zhì)譜在13C標(biāo)記的Glc和13C標(biāo)記的Fru處理后發(fā)生了顯著變化（圖5侨赡；補(bǔ)充圖1）蓖租。這些發(fā)現(xiàn)表明Glc和Fru在作為底物的羅勒烯和芳樟醇的合成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。有趣的是羊壹，苯甲酸乙酯的m/z比沒(méi)有變化菜秦，間接表明Glc和Fru僅進(jìn)入MVA和MEP途徑。
3.5?抑制LoHXK和LoFRK的表達(dá)
為了更好地了解LoHXK和LoFRK在花香生物合成途徑中的潛在作用舶掖，病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)在LoHXK和LoFRK沉默的花球昨，關(guān)鍵結(jié)構(gòu)揮發(fā)性生物合成基因的mRNA水平被下調(diào)。在LoHXK沉默的花中眨攘，LoTPS1主慰、LoTPS3、LoMYB1和LoMYB3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于對(duì)照分別下調(diào)了79.7%鲫售、86.7%共螺、75%和44%（圖6c）。類(lèi)似地情竹，與對(duì)照相比藐不，LoFRK的沉默使LoTPS1、LoTPS3、LoMYB1和LoMYB3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)高達(dá)70%雏蛮、79%涎嚼、39%和78%（圖6c）。
LoHXK和LoFRK沉默對(duì)花揮發(fā)物含量的影響表明挑秉，與對(duì)照相比法梯，LoHXK沉默的花中羅勒烯和芳樟醇的濃度分別降低了26%和37.4%，而LoFRK沉默的花中的羅勒烯和芳樟醇濃度分別下降了67.5%和75.5%（圖6d）犀概。相反立哑，乙基苯的揮發(fā)物含量沒(méi)有觀察到顯著變化。因此姻灶，結(jié)果表明LoHXK和LoFRK在‘西伯利亞’百合的萜類(lèi)香氣生物合成中起關(guān)鍵作用铛绰。
3.6?LoHXK和LoFRK的過(guò)表達(dá)
為了確定LoHXK和LoFRK在調(diào)節(jié)萜類(lèi)生物合成中的功能，這兩個(gè)基因在百合中過(guò)表達(dá)LoFRK過(guò)表達(dá)的花中产喉，與對(duì)照相比捂掰，LoHXK和LoFRK的活性分別增加了67.1%和47.2%，而且镊叁，與對(duì)照相比，LoFRK過(guò)量表達(dá)的花中的奧辛烯和芳樟醇的釋放量分別增加了72.6% 和84%（圖7d）走触。類(lèi)似地晦譬，相對(duì)于對(duì)照，在LoHXK過(guò)表達(dá)的花中互广，羅勒烯和芳樟醇的排放水平分別顯著增加了17%和13.3%（圖7d）敛腌。正如預(yù)期的那樣，苯甲酸乙酯的含量沒(méi)有顯著變化惫皱。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)像樊，從LoHXK和LoFRK過(guò)度表達(dá)的‘西伯利亞’百合花中提取總RNA，并進(jìn)行qRT-PCR以檢查相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平旅敷。與上述發(fā)現(xiàn)一致生棍，在LoFRK和LoHXK過(guò)表達(dá)中觀察到LoTPS1/3和MYB1/2轉(zhuǎn)錄本顯著增加，表明LoFRK和LoHXK正調(diào)節(jié)‘西伯利亞’百合萜烯合酶基因（LoTPS1和LoTPS3）的表達(dá)媳谁。LoTPS1/3和LoMYB1/2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別增加了99.4%涂滴、85.8%、103%和14.3%晴音。LoFRK過(guò)表達(dá)的花柔纵，相對(duì)于對(duì)照（圖7c）。在LoHXK過(guò)表達(dá)的花中锤躁，LoTPS1/3和LoMYB1/2的表達(dá)水平分別上調(diào)至56.3%搁料、66%、35.6%和83.2%（圖7c）。這些數(shù)據(jù)表明己糖激酶和果糖激酶通過(guò)“西伯利亞”百合正調(diào)節(jié)萜類(lèi)濃度關(guān)鍵結(jié)構(gòu)易失性基因表達(dá)的調(diào)控郭计。
3.7?LoFRK與LoMYB1和LoMYB2相互作用
果糖激酶與其他蛋白質(zhì)相互作用以調(diào)節(jié)植物的多種功能霸琴。MYB蛋白在次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用。為了研究LoFRK的潛在目標(biāo)拣宏，進(jìn)行了Y2H測(cè)定沈贝。數(shù)據(jù)顯示LoFRK與R2R3-MYB蛋白（LoMYB1和LoMYB2）相互作用（圖8a），表明LoFRK可能與酵母細(xì)胞中的這些蛋白相互作用勋乾。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)宋下，進(jìn)行了BiFC檢測(cè)。這構(gòu)建體通過(guò)農(nóng)桿菌用LoFRK-YFPN/LoMYB1-YFPC辑莫、LoFRK-YFPN/LoMYB2-YFPC轉(zhuǎn)移到洋蔥表皮中学歧，和YFPC-LoFRK-YFPN。用農(nóng)桿菌感染洋蔥表皮后檢測(cè)到綠色熒光各吨。DAPI染色后枝笨，在細(xì)胞核中觀察到藍(lán)色熒光，證實(shí)LoFRK與細(xì)胞核中的LoMYB1和LoMYB2轉(zhuǎn)錄因子相互作用（圖8b）揭蜒。這些發(fā)現(xiàn)表明果糖激酶可能與LoMYB1和LoMYB2蛋白相互作用以調(diào)節(jié)花香的產(chǎn)生過(guò)程横浑。
3.8?亞細(xì)胞定位分析
亞細(xì)胞定位分析顯示LoHXK:GFP在線粒體中表達(dá)，而LoFRK:GFP與擬南芥原生質(zhì)體中的核定位信號(hào)(NLS)標(biāo)記的共轉(zhuǎn)化顯示細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的綠色熒光（圖9）屉更。這些數(shù)據(jù)表明LoHXK位于線粒體中徙融，而LoFRK位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。
4.?討論
在大多數(shù)植物中瑰谜，葉片通過(guò)光合作用產(chǎn)生多種形式的碳水化合物欺冀，主要是蔗糖和葡萄糖，它們作為各種代謝途徑的碳和能量來(lái)源萨脑∫可溶性糖，如Suc渤早、Glc和Fru职车，也可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)參與發(fā)育、防御和代謝的眾多基因的表達(dá)鹊杖。在植物中提鸟，F(xiàn)RK和HXK是多種代謝途徑的看門(mén)人，因?yàn)樗鼈兇呋豢赡娣磻?yīng)并在植物糖代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用仅淑。盡管HXK和FRK基因已在‘西伯利百合仍然知之甚少称勋。
在當(dāng)前的研究中，我們從‘西伯利百合花中分離出LoFRK和LoHXK蛋白并對(duì)其進(jìn)行了功能表征涯竟。系統(tǒng)發(fā)育和序列比較分析揭示了保守的糖結(jié)合（6-磷酸葡萄糖）和ATP結(jié)構(gòu)域存在于LoHXK的推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列中赡鲜，與AtHXK1和AtHXK2顯示出高度相似性（圖1）空厌。亞細(xì)胞定位分析表明，與AtHXK1類(lèi)似银酬，LoHXK蛋白定位于線粒體中（圖9）嘲更。類(lèi)似地，推斷出的LoFRK氨基酸序列具有特征性FRK基因的保守基序和結(jié)構(gòu)域揩瞪，并且定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核赋朦。先前的研究還表明，在質(zhì)膜李破、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中檢測(cè)到了幾種FRK蛋白宠哄。此外，LoFRK和LoHXK的轉(zhuǎn)錄水平在花的花藥中比在根嗤攻、莖和葉中更豐富（圖2a毛嫉，3）。在擬南芥和水稻HXKs中觀察到類(lèi)似的模式妇菱，其中基因在花中表達(dá)最高承粤，在葉和莖中較低。在番茄中闯团，FRK4的mRNA水平僅在花中表達(dá)辛臊，尤其是在雄蕊中。關(guān)于花發(fā)育房交，LoHXK的mRNA水平在開(kāi)花階段彻舰，而LoFRK在衰老階段最高，在早期階段相對(duì)較低（圖2b）涌萤。果糖激酶和己糖激酶的表達(dá)模式因植物而異淹遵。
有趣的是口猜，在葡萄糖和果糖處理下负溪，羅勒烯和芳樟醇的排放水平增加并遵循晝夜節(jié)律。此外济炎，關(guān)鍵結(jié)構(gòu)合成基因的mRNA水平顯著上調(diào)并遵循相同的晝夜節(jié)律模式（圖4）川抡。同樣，在番茄中须尚，FRK1和FRK2的mRNA豐度隨著外源性Glc崖堤、Fru或Suc應(yīng)用而增加，盡管在沒(méi)有糖處理的情況下無(wú)法檢測(cè)到FRK1轉(zhuǎn)錄物耐床。在玉米中也觀察到了類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)密幔，其中糖水平調(diào)節(jié)蔗糖合酶基因的表達(dá)。此外撩轰，使用13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)確定碳通量表明糖類(lèi)被納入萜類(lèi)化合物（圖5）胯甩。類(lèi)似的方法在之前的幾次測(cè)定中進(jìn)行了測(cè)定昧廷，以確定碳通量的結(jié)合。我們的結(jié)果表明外源性Glc而非Fru增加了羅勒烯和芳樟醇的釋放偎箫，外源性Glc增加了LoTPS1的mRNA豐度木柬，而Fru處理增加了LoTPS3的表達(dá)水平。此外淹办，LoFRK和LoHXK的抑制表明眉枕，花揮發(fā)物的排放，尤其是羅勒烯和芳樟醇怜森，顯著下降速挑，這與關(guān)鍵結(jié)構(gòu)揮發(fā)性合成基因的表達(dá)水平下調(diào)一致（圖6）。同樣塔插，F(xiàn)RK2在白楊（Populus tremuloides）的發(fā)育木材中高度表達(dá)梗摇，它的抑制通過(guò)減少發(fā)育木材中的磷酸己糖和UDP-葡萄糖池而導(dǎo)致更薄的纖維細(xì)胞壁形成。相比之下想许，LoFRK和LoHXK的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致羅勒烯和芳樟醇的排放水平更高伶授，與關(guān)鍵結(jié)構(gòu)揮發(fā)性合成基因的高度上調(diào)mRNA轉(zhuǎn)錄本一致（圖7）。在Malusdomestica（蘋(píng)果）流纹，MdFRK2轉(zhuǎn)錄本水平在葉子中最高糜烹，過(guò)表達(dá)導(dǎo)致葉子中的FRK活性增加，碳水化合物水平改變以及參與糖代謝的關(guān)鍵基因（SPS1漱凝，SUSY4疮蹦，NINV1和NINV2）表達(dá)改變，這些結(jié)果證實(shí)了我們目前的研究結(jié)果茸炒。LeFRK1在毛茛中的過(guò)度表達(dá)影響了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)愕乎，籽棉產(chǎn)量和棉鈴數(shù)量。同樣壁公，AtHXK1和AtHXK2的過(guò)表達(dá)通過(guò)控制糖依賴(lài)基因的表達(dá)/抑制導(dǎo)致糖的溢出性感论。在本研究中，Y2H和BiFC實(shí)驗(yàn)表明LoFRK與LoMYB1和LoMYB2相互作用（圖8）紊册。在水稻中比肄，果糖激酶樣蛋白1（FLNs）與硫氧還蛋白z（OsTRXz）相互作用以調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育。同樣擬南芥FRK樣酶（FLN1和FLN2）與AtTRXz相互作用以調(diào)節(jié)質(zhì)體基因的表達(dá)囊陡。同樣芳绩，AtFRK3與ft(TSF)的雙胞胎姐妹相互作用，這是FT (FLOWERING LOCUST)的同源物撞反，在開(kāi)花調(diào)控中起關(guān)鍵作用妥色。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明，與我們的研究結(jié)果相似遏片，TSF定位在細(xì)胞核中嘹害，而AtFRK3主要定位在葉綠體中鳍侣，然而，本研究中的Y2H和BiFC揭示了這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中的相互作用吼拥。然而倚聚，該機(jī)制并不完全清楚，因?yàn)橹暗难芯靠赡鼙砻鞑荒芘懦@兩種相互作用分子之間存在介質(zhì)凿可』笳郏總體而言，這些數(shù)據(jù)表明Glc和Fru通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)合成基因的表達(dá)枯跑，在花香生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用惨驶。
5.?結(jié)論
簡(jiǎn)而言之，我們鑒定并鑒定了LoFRK和LoHXK敛助，它們?cè)凇鞑麃啞俸匣ǖ男廴镏懈叨缺磉_(dá)粗卜。在Glc和Fru處理下，不僅奧辛烯和芳樟醇的排放水平上升纳击，而且關(guān)鍵結(jié)構(gòu)揮發(fā)性合成基因的表達(dá)水平隨著晝夜節(jié)律的增加而上升续扔。LoFRK和LoHXK的過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)表明，它們顯著改變了奧辛烯和芳樟醇的排放焕数，以及關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)纱昧；此外，LoFRK在體內(nèi)與LoMYB1和LoMYB2堡赔。
6. 小編聲明
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