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酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)

本文主要講述了畢赤酵母蛋白表達(dá)的原理条篷，畢赤酵母表達(dá)能夠高效表達(dá)的機(jī)制。

巴斯德畢赤酵母(以下簡(jiǎn)稱畢赤酵母）能夠高效表達(dá)外源基因粮宛，是因?yàn)槠溆懈鼜?qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子，即醇氧,FDF化酶啟動(dòng)子PAOX侨拦。甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母能將甲醇分解為甲醛和過(guò)氧化氫款咖，在此反應(yīng)中參與的酶是醇氧化

酶(AOX1和AOX2)围苫。其中，AOX2的表達(dá)量比AOX1低得多彼乌，以甲醇為唯—碳源時(shí)泻肯，AOX1增至細(xì)胞總蛋白的40%。PAOX1受甲醇誘導(dǎo)和葡萄糖或甘油的抑制慰照。因此灶挟，AOX1的表達(dá)受到甲醇的嚴(yán)格控制。

巴斯德畢赤酵母所表達(dá)的外源基因位于酵母染色體上毒租，這是通過(guò)把攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒線性化稚铣，以同源重組的方式整合到強(qiáng)啟動(dòng)子PAOX1的下游，目的基因一般插入到5’AOX1啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間的單克隆位點(diǎn)。

畢赤酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)

1.酵母表達(dá)宿主菌. Mut+和Muts

在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中惕医，乙醇氧化酶有兩種基因編碼耕漱，即AOX1和AOX2。細(xì)胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力有AOX1提供抬伺，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表達(dá)的AOX1蛋白提供螟够。當(dāng)AOX1缺失，只存在AOX2時(shí)峡钓，大部分的乙醇氧化酶活力喪失妓笙，這種細(xì)胞利用甲醇能力低，在甲醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢的菌株表現(xiàn)型為Mut椒楣。存在AOX1给郊，細(xì)胞利用甲醇正常生長(zhǎng)牡肉，在甲醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快捧灰，這種菌株表現(xiàn)型為Mut*，這就是甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)兩種Muts和Mut+產(chǎn)生的原理统锤。

酵母表達(dá)系統(tǒng)常用宿主菌

GS115毛俏、KM71、SMD1168是常用的表達(dá)宿主菌饲窿，均為甲醇誘導(dǎo)型煌寇。他們都是組氦酸缺陷型，如果表達(dá)載體上帶有組氨酸基因逾雄，可以補(bǔ)償宿主菌的組氨酸缺陷阀溶，所以可以在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選重組轉(zhuǎn)化子。在以葡萄糖或者甘油等為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)鸦泳，AOX1基因的表達(dá)受到抑制银锻，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)，宿主菌的

AOX1基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo)做鹰，使目的基因大量表達(dá)击纬。

有無(wú)甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的Mut+和Mut5表現(xiàn)型

畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度為28-30℃，誘導(dǎo)期間超過(guò)32℃钾麸，不利于蛋白表達(dá)更振，并可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Mut和Mut*菌株在沒(méi)有甲醇存在的情況下生長(zhǎng)速率一樣饭尝，存在甲醇的情況下肯腕，AOX1啟動(dòng)子被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，Mut*較?Mut5生長(zhǎng)更快(4-5倍)钥平。

2.酵母蛋白表達(dá)載體

酵母蛋白表達(dá)載體的選擇

酵母表達(dá)產(chǎn)物有胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外表達(dá)兩種方式实撒，這取決于表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建是否帶有信號(hào)肽，可根據(jù)基因表達(dá)的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達(dá)載體。

胞內(nèi)表達(dá)載體:主要包括pPIC3奈惑、pPICZ吭净、pPSC3K、pHIL-D2等肴甸。該類載體將目的基因表達(dá)在胞內(nèi)寂殉，可避免酵母的糖基化，適合于通常在胞漿表達(dá)或不含-S-S-的非糖基化蛋白原在，較胞外分泌表達(dá)水平高但純化相對(duì)復(fù)雜友扰。分泌到胞外表達(dá)的載體: pPIC9、pHIL-S1庶柿、pYAM75P等村怪。酵母本身分泌的外源蛋白很少，將外源蛋白分泌到胞外浮庐，有利于目的蛋白的純化和積累甚负。常用的分泌信號(hào)序列由89個(gè)氨基酸組成αx交配因子的引導(dǎo)。

多拷貝插入表達(dá)載體: pPIC9K审残、pPIC3.5K梭域。某些情況下，重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達(dá)量搅轿。

·表達(dá)重組蛋白使其具體天然的N端

想實(shí)現(xiàn)表達(dá)重組蛋白使其具體天然的N端病涨，將目的基因直接連接在Kex2蛋白酶切位點(diǎn)之后。Kex2蛋白酶切位點(diǎn)在信號(hào)肽序列中谷氨酸和精氨酸連接處:Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置為Kex2蛋白酶的酶切位點(diǎn)

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)機(jī)制/原理

畢赤酵母能夠高效的表達(dá)外源基因璧坟，是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)啟動(dòng)子乙醇氧化酶啟動(dòng)子(AOX1和AOX2)既穆。AOX1和AOX2及其產(chǎn)生的Mut和Mut*表現(xiàn)型前文已經(jīng)敘述過(guò)。AOX1受甲醇的誘導(dǎo)和葡糖糖或甘油的抑制雀鹃。畢赤酵母表達(dá)的外源基因位于酵母染色體上幻工，通過(guò)把構(gòu)建的質(zhì)粒/載體線性化(主要采用酶切)，通過(guò)同源重組的方式整合到啟動(dòng)子AOX的下游褐澎，一般是插入到5’AOX啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子信號(hào)之間的單克隆位點(diǎn)会钝。

畢赤酵母同源重組的方式，見(jiàn)酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)介紹工三。

酵母蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程

酵母蛋白表達(dá)步驟/實(shí)驗(yàn)流程

本文主要講述了酵母蛋白表達(dá)步驟迁酸，詳細(xì)酵母表達(dá)流程。從感受態(tài)細(xì)胞制備俭正，轉(zhuǎn)化方法選擇及操作奸鬓，從化學(xué)試劑PEG1000轉(zhuǎn)化，電擊轉(zhuǎn)化掸读，原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化三個(gè)方法入手及轉(zhuǎn)化子的篩 選及最終的蛋白表達(dá)串远，全套酵母蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)操作流程宏多。

質(zhì)粒線性化

在酵母表達(dá)系統(tǒng)中已經(jīng)介紹了酵母蛋白表達(dá)原理，因此線性化是酵母轉(zhuǎn)化的第一步澡罚，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型伸但。

轉(zhuǎn)化方法

畢赤酵母PEG1000轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備

配置緩沖液

1）緩沖液A:1.0M山梨醇，10mM甘氨酸留搔，pH8.35,3%(v/V)乙二醇更胖，濾膜過(guò)濾，-20℃保存;2)緩沖液B: 40% (w/v)PEG1000隔显，0.2M甘氨酸,pH8.35却妨，濾膜過(guò)濾，-20°℃保存;

3）緩沖液C:0.15M NaCl括眠，10mM甘氨酸彪标，pH8.35，濾膜過(guò)濾掷豺，-20℃保存;

4)未污染的新鮮捞烟、試劑級(jí)DMSO,-70°C保存

將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處(即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過(guò)程中迅速下降;樣品的轉(zhuǎn)化萌业，進(jìn)行多組試驗(yàn)坷襟。

感受態(tài)制備

1）接種酵母受體菌單菌落于YPD平板(YPD:蛋白表達(dá)試劑配置)奸柬，30°℃培養(yǎng)2天;2)挑取平板上的單菌落接種于10mIYPD液體培養(yǎng)基中生年，30°℃搖床震蕩過(guò)夜;

3)過(guò)夜培養(yǎng)后按1%左右的接種量接種到100mIYPD培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD值從0.1至0.5~0.8;4) 3000~5000rpm離心收集沉淀菌體，用50ml預(yù)冷A液洗滌廓奕，并重懸與4mlA液中;

5）根據(jù)每次使用量(0.1-0.2ml左右)分裝與1.5ml離心管中抱婉，每管加入10ul的預(yù)冷DMSO，混合后迅速-80℃/液氮（感受態(tài)可以放到-80℃桌粉，但是酵母表達(dá)建議感受態(tài)現(xiàn)做現(xiàn)用)

·酵母轉(zhuǎn)化

1)線性化質(zhì)粒50ug (可預(yù)冷）溶于200ul的TE中蒸绩，直接加入凍存的酵母感受態(tài)中;2) 37°℃水浴5min，過(guò)程混合樣品2次;

3）取出加入1.5ml緩沖液B铃肯，徹底混勻;4) 30°C水浴1小時(shí);

5）室溫2000rpm離心10min患亿，去上清，得沉淀押逼，重懸菌體與1.5ml緩沖液C中;6）再次離心步藕，去上清，得沉淀挑格，輕輕加入0.2ml緩沖液C重曇;

7）將重懸的轉(zhuǎn)化液涂與選擇性培養(yǎng)基（根據(jù)抗性配置)中咙冗，30℃孵育3-4天，進(jìn)行鑒定漂彤。

畢赤酵母電擊感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化

感受態(tài)制備

1）接種酵母受體菌單菌落于YPD平板雾消，30°℃培養(yǎng)2天;

2）挑取平板上的單菌落接種于10mlYPD液體培養(yǎng)基中灾搏，30°C搖床震蕩過(guò)夜;

3)過(guò)夜培養(yǎng)后按1%左右的接種量接種到100mIYPD培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD值1.2~1.5;4) 4℃，5000rpm離心5min收集沉淀菌體立润，用100ml預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體;

5)4℃狂窑，5000rpm離心10min收集沉淀菌體，用100ml預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體;6)再次4℃桑腮，5000rpm離心10min收集沉淀菌體蕾域，用100ml預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體;7) 20ml，1mol/L山梨醇洗滌1次;

8）將菌體溶于200ul到旦，1mol/L預(yù)冷山梨醇中旨巷，不加甘油，-80℃放置幾小時(shí)添忘，待轉(zhuǎn)化

·酵母電轉(zhuǎn)

1）準(zhǔn)備好80ul的酵母感受態(tài)與線性化的質(zhì)粒1-5ug (冰上預(yù)冷15min)混合采呐，迅速放入0.2cm的電擊杯中(電擊杯冰上預(yù)冷滅菌)，電擊;

2）電擊結(jié)束搁骑，迅速加入1ml山梨醇斧吐，涂平板（在搖床上培養(yǎng)1h后涂平板也可);3）MD培養(yǎng)基生長(zhǎng)3-4天，ROB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4-5天后仲器，鑒定煤率。

·電擊注意點(diǎn)

1）線性化質(zhì)粒的含量在1-5ug，純度越高越好乏冀，量要有保證蝶糯，很多人找不到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以考慮是否是這個(gè)因素造成;

2）感受態(tài)菌液收集，確定OD值在1.2-1.5之間辆沦，可以稀釋不同倍數(shù)昼捍，判斷是否是線性關(guān)系，菌液渾濁單OD值不高肢扯，可能是OD稀釋倍數(shù)不夠;

3）感受態(tài)保存妒茬，感受態(tài)制備但其他還沒(méi)處理好，冰上放置的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率也會(huì)有影響蔚晨，因此還是那個(gè)原則;現(xiàn)做現(xiàn)用;且分裝成每次夠用的量乍钻，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染;

4)電擊杯清洗铭腕，先洗凈吹干银择，浸泡在75%乙醇中，使用前超凈臺(tái)紫外滅菌谨履，重復(fù)使用對(duì)實(shí)驗(yàn)也會(huì)有一定影響;5）電擊參數(shù)欢摄，電壓及電擊時(shí)間可以摸索，適當(dāng)增加電壓或延長(zhǎng)電擊時(shí)間笋粟，電擊過(guò)程冰上操作

畢赤酵母原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備

·原生質(zhì)轉(zhuǎn)化原理

酵母細(xì)胞具有細(xì)胞壁怀挠，細(xì)胞壁會(huì)組織其對(duì)外源DNA的攝入析蝴，因此，去除掉部分的細(xì)胞壁有利于酵母細(xì)胞對(duì)DNA的吸收绿淋。利用藤黃節(jié)桿菌酶（為一種葡聚糖酶）闷畸，可以部分消化細(xì)胞壁。關(guān)鍵在于不能過(guò)度的消化細(xì)胞壁吞滞，否則將造成細(xì)胞死亡佑菩。藤黃節(jié)桿菌酶的消化能力受到SDS的影響，可以加入SDS對(duì)其消化進(jìn)行控制裁赠，以得到消化適度的細(xì)胞殿漠。消化獲得70%的原生質(zhì)細(xì)胞時(shí)，效果最好佩捞。

·試劑配制

轉(zhuǎn)化當(dāng)天绞幌，配制如下溶液:

SE:1M山梨醇，25mM EDTA,pH8.0

SCE: SE: 1M山梨醇一忱，1mM EDTA莲蜘，10mM檸檬酸鈉緩沖液，pH8.5ssos: 1M山梨醇帘营，0.3xYPD票渠，10mM CaCl2

CaS: 1M山梨醇，10mM Tris-HCl芬迄，pH7.5问顷，10mM CaCl2DTT，PEG: DTT水配制為1M濃度薯鼠，PEG用水配制40% (w/v)CaT: 20mM Tris pH7.5,20mM CaCl2

⑦藤黃節(jié)桿菌酶:用水配制成3mg/ml的濃度⑧5%SDS溶液择诈，RD融化瓊脂100ml，1M山梨醇每次轉(zhuǎn)化時(shí)配制

SED: 19mlILSE加1ml DTT

PEG/Cat: 1:1混合40%PEG及Cat其他試劑

YPD培養(yǎng)基1L出皇，YPD平板1LRDB平板1L，RDHB平板1L

·感受態(tài)制備及消化細(xì)胞壁

1)接種酵母受體菌單菌落于YPD平板哗戈，30°℃培養(yǎng)2天;

2）挑取平板上的單菌落接種于10mIYPD液體培養(yǎng)基中郊艘，30℃搖床震蕩過(guò)夜;

3）取培養(yǎng)的細(xì)胞5ul，10ul唯咬，20ul分別加入到含有200mILYPD的液體培養(yǎng)基中纱注，30℃C震蕩過(guò)夜(300rpm) ;4)第二天測(cè)每個(gè)培養(yǎng)瓶中的OD600值，并取出事先配置好的轉(zhuǎn)化溶液胆胰，室溫放置:

5）收集OD600值在0.2-0.3對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞狞贱，室溫離心(1500rpm5min左右)，得到沉淀;如果沒(méi)有培養(yǎng)瓶中的OD值在0.3左右的話蜀涨，選擇一個(gè)培養(yǎng)瓶瞎嬉，用新配置的培養(yǎng)基以1:4稀釋蝎毡，再次培養(yǎng)(2-3h左右)，直至出現(xiàn)OD值為0.2-0.3氧枣，收集細(xì)胞;

6)準(zhǔn)備去除細(xì)胞壁沐兵，準(zhǔn)備去壁試劑和待去壁的細(xì)胞;

7)準(zhǔn)備去壁試劑:現(xiàn)配SED，保證DTT(分析級(jí))的新鮮度便监，配完放-20°℃;

8）準(zhǔn)備帶去壁細(xì)胞:先用滅菌水清洗扎谎，轉(zhuǎn)入離心管;1500rpm離心5min，收集細(xì)胞烧董，用20mISED重懸并洗滌離心;再次用1M山梨醇洗滌毁靶，離心(同上)﹔用SCE重懸，分開(kāi)至兩個(gè)離心管中（每管10ml左右);

9）準(zhǔn)備藤黃節(jié)桿菌酶逊移，取―管酶放置冰上老充，以上準(zhǔn)備的兩管細(xì)胞取出一管加入藤黃節(jié)桿菌酶，開(kāi)始消化細(xì)胞(這—步可確定酶消化的最佳時(shí)間);

最佳時(shí)間的確定

準(zhǔn)備20ml 5%SDS溶液分光光度計(jì)調(diào)至800nm螟左，空白對(duì)照為800ul5%SDS及200ul SCE;②準(zhǔn)備10個(gè)離心管啡浊，編號(hào)為0,2,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50(根據(jù)時(shí)間編號(hào));取上述8步中的另—管細(xì)胞，取出200ul加入至0號(hào)管中胶背，放置冰上巷嚣，此為0點(diǎn);

加入7.5ul藤黃節(jié)桿菌酶在剩余的細(xì)胞中，輕混钳吟，30C孵育（不要晃動(dòng))用來(lái)建立最佳時(shí)間所用2min時(shí)取200ul懸浮液至2號(hào)管中廷粒，同理4,5,6,7,8min時(shí)重復(fù)操作，讀樣品OD800值;

用公式計(jì)算細(xì)胞去壁的效率:%去壁率=100-{ (T時(shí)間OD800-0時(shí)間OD800值)x100}

10）計(jì)算出去壁率為70%左右時(shí)红且，得出最佳消化時(shí)間坝茎，同樣操作加入7.5ul消化酶于另一管中消化細(xì)胞11)室溫離心去除懸浮液，1M山梨醇洗滌一次暇番，0.6mlCaS懸浮細(xì)胞嗤放，立即轉(zhuǎn)化，去壁的細(xì)胞應(yīng)立即轉(zhuǎn)化壁酬。

轉(zhuǎn)化畢赤酵母

1）取100ul將去壁細(xì)胞次酌，放入1.5ml離心管中(滅菌);

2)準(zhǔn)備10ug線性化質(zhì)粒（預(yù)冷）與去壁細(xì)胞混合，加入1ml新鮮PEG/Cat溶液舆乔，輕混岳服，室溫孵育10min;3）室溫750rpm離心10min，去除PEG/Cat溶液;并用150ulISOS培養(yǎng)基懸浮轉(zhuǎn)化細(xì)胞希俩，室溫孵育20min;4)加入800ul 1M山梨醇吊宋，涂平板;

5）取200ul轉(zhuǎn)化細(xì)胞和RD(液體）混勻倒于RDB平板上，凝固后導(dǎo)致平板颜武，30℃培養(yǎng)4-6天璃搜，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子;6）取100ul稀釋細(xì)胞拖吼，與RDH（(液體)混勻，涂在RDHB上腺劣，凝固后倒置生長(zhǎng)绿贞，30℃培養(yǎng)4-6天，出現(xiàn)克隆橘原，表明去壁細(xì)胞可再次生長(zhǎng)為分裂細(xì)胞籍铁。

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選與蛋白表達(dá)- Mut+和Mut表型的判斷

待轉(zhuǎn)化子在平板上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，進(jìn)行Mut*和Mut的篩選趾断。挑取單克隆拒名，在MM及MD培養(yǎng)基上劃線或點(diǎn)(先在MM平板上點(diǎn)，再在MD平板上點(diǎn)芋酌，一個(gè)克隆換一次牙簽)增显，30C培養(yǎng)2天。觀察脐帝，在MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在MM培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或長(zhǎng)的很小即為Mut5表型同云，其余為Mut+表型。

Mut+的誘導(dǎo)表達(dá)

1）挑取單菌落堵腹，搖菌炸站，在25mlIMGY或BMG或BMGY培養(yǎng)基中，30°℃C疚顷，30Orpm培養(yǎng)至OD600為2-6(培養(yǎng)15-18h左右觀察);

2）室溫2000rpm離心5min旱易，收集菌體，用上述培養(yǎng)基重懸腿堤，使OD600為1.0左右;將菌液至于1L搖瓶中阀坏，30°C300rpm培養(yǎng)，每24小時(shí)加入100%甲醇笆檀，至終濃度為0.5-1.0%;

3）根據(jù)時(shí)間點(diǎn)取樣（1ml）至于1.5ml離心管中忌堂，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達(dá)量和最佳收獲時(shí)間;

4)可以用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析鑒定表達(dá)情況误债。

Mut5的誘導(dǎo)表達(dá)

1）挑取單菌落浸船，搖菌，在25mlMGY或BMG或BMGY培養(yǎng)基中寝蹈，30°C，300rpm培養(yǎng)至OD600為2-6(培養(yǎng)15-18h左右觀察);

2）室溫2000rpm離心5min登淘，收集菌體箫老，用上述培養(yǎng)基重曇，使OD600為1.0左右;將菌液至于1L搖瓶中黔州，30°℃300rpm培養(yǎng)耍鬓，每24小時(shí)加入100%甲醇阔籽，至終濃度為0.5-1.0%;

3）根據(jù)時(shí)間點(diǎn)取樣(1ml)至于1.5ml離心管中，離心收集上清和菌體牲蜀，分析蛋白表達(dá)量和最佳收獲時(shí)間;4）可以用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析鑒定表達(dá)情況笆制。