Novel insight on marker genes and pathogenic peripheral neutrophil subtypes in acute pancreatitis
對(duì)急性胰腺炎的標(biāo)記基因和致病性外周中性粒細(xì)胞亞型的新認(rèn)識(shí)
發(fā)表期刊：Front Immunol
發(fā)表日期：2022 Aug 22
影響因子：8.786
DOI: ?10.3389/fimmu.2022.964622
一初橘、研究背景
????????急性胰腺炎（AP）是一種臨床上常見的危急疾病坐漏，隨著全世界酗酒和肥胖的加劇歇僧，近年來AP的發(fā)病率激增访诱。根據(jù)亞特蘭大的AP分類標(biāo)準(zhǔn)垫挨，AP可以根據(jù)病情程度分為三個(gè)亞型，包括輕度急性胰腺炎（MAP）触菜、中度重度急性胰腺炎（MSAP）和重度急性胰腺炎（SAP）九榔。這三種類型的關(guān)鍵區(qū)別在于AP是否有短暫的器官衰竭或持續(xù)的器官衰竭。
????????大量的報(bào)告表明涡相，COVID-19感染有可能導(dǎo)致AP哲泊。一些單中心研究已經(jīng)證實(shí)了COVID-19和AP之間的這種關(guān)系。一些文獻(xiàn)綜述認(rèn)為催蝗，感染COVID-19的患者AP的發(fā)病率增加切威，SARS-CoV-2本身可能導(dǎo)致一些患者的AP。其中丙号，中性粒細(xì)胞已被證明與COVID-19免疫發(fā)病機(jī)制有關(guān)先朦，包括干擾素（IFN）反應(yīng)失調(diào)和骨髓炎癥缰冤。
????????高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析在醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。事實(shí)上喳魏，有一些基于AP的生物信息學(xué)分析的研究棉浸。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）是一種新型的生物信息學(xué)方法，用于識(shí)別具有相似表達(dá)模式的基因組（基因模塊）刺彩，并分析基因組和樣本表型之間的聯(lián)系迷郑。
二、材料與方法
1创倔、數(shù)據(jù)來源
1） 在GEO中篩選了與AP和COVID-19感染的外周血相關(guān)的高通量批量測(cè)序數(shù)據(jù)集：GSE194331嗡害，包括87名不同嚴(yán)重程度的AP患者（輕度=57，中度至重度=20三幻，重度=10）和32名健康對(duì)照者的外周血基因表達(dá)數(shù)據(jù)
2） 使用GSE152418數(shù)據(jù)集作為COVID組就漾，包括17名COVID-19受試者和17名健康對(duì)照組
3） 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE157789，其中包括14個(gè)COVID-19誘導(dǎo)的72小時(shí)后的敗血癥樣本念搬，3個(gè)細(xì)菌誘導(dǎo)的72小時(shí)后的敗血癥樣本抑堡，7個(gè)COVID-19誘導(dǎo)的7天后的敗血癥樣本，以及2個(gè)細(xì)菌誘導(dǎo)的7天后的敗血癥樣本
4） 2017年至2020年朗徊，從長(zhǎng)海醫(yī)院入院24小時(shí)內(nèi)的AP患者獲得外周血：28個(gè)樣本被納入我們的PCR分析首妖，包括14個(gè)MAP、8個(gè)MSAP和6個(gè)SAP樣本爷恳；這些樣本被分為兩組有缆，包括MAP組和MSAP&SAP組
5） GSE194331（驗(yàn)證集）
2、分析流程
1） 差異表達(dá)基因的鑒定：使用R軟件中的DESeq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析温亲，以比較COVID-19與健康對(duì)照組的差異表達(dá)
2） 基因本體論和通路富集分析：使用Metascape進(jìn)行基因本體分析棚壁、通路富集和樞紐通路鑒定；通過STRING數(shù)據(jù)庫確定栈虚；使用Cytoscape軟件對(duì)PPI進(jìn)行可視化
3） 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析：使用R WGCNA包對(duì)GSE194331數(shù)據(jù)集進(jìn)行了WGCNA袖外，選擇17個(gè)作為基因模塊的最小數(shù)量；從GSE198533和GSE152418數(shù)據(jù)集中獲得BD樣本和COVID-19樣本的臨床特征數(shù)據(jù)魂务，通過WGCNA計(jì)算基因重要性（GS）和模塊成員（MM）曼验；確定了具有共表達(dá)模式和意義的模塊
4） 隨機(jī)森林算法：R randomForest包，按健康對(duì)照粘姜、MAP和MSAP&SAP分組鬓照，使用隨機(jī)森林算法來識(shí)別基于WGCNA的兩個(gè)鑒定模塊的樞紐基因
5） 免疫浸潤(rùn)估計(jì)和接收器操作特征曲線分析：ImmuCellAI,從基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中估計(jì)24種免疫細(xì)胞豐度的工具
6） 聚合酶鏈反應(yīng)
7） 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的分析：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組矩陣數(shù)據(jù)集GSE157789；前2,000個(gè)高變量基因孤紧，構(gòu)建tSNE和UMAP的基礎(chǔ)是前10個(gè)PCA豺裆；通過基于圖的聚類方法獲得了基于前10個(gè)主函數(shù)的無監(jiān)督細(xì)胞聚類結(jié)果
8） 不同中性粒細(xì)胞類型中明顯相關(guān)的通路的鑒定：使用R軟件中的 "irGSEA "包評(píng)估基因集是否在中性粒細(xì)胞亞群中富集
9） 偽時(shí)間分析：Monocle2；在偽時(shí)空分析的基礎(chǔ)上号显，使用分支表達(dá)分析模型（BEAM分析）來分析分支命運(yùn)決定的基因
10）在單細(xì)胞水平上識(shí)別重要的代謝途徑：R "ScMetabolism "包被用來計(jì)算中性粒細(xì)胞數(shù)據(jù)集中不同細(xì)胞類型之間的代謝狀況
11）急性胰腺炎患者和健康對(duì)照組外周血批量測(cè)序數(shù)據(jù)中的單細(xì)胞測(cè)序估計(jì)的亞型
三留储、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 -通過WGCNA識(shí)別急性胰腺炎的關(guān)鍵基因模塊
????????GSE194331數(shù)據(jù)集包括以AP患者為疾病組（57個(gè)輕度胰腺炎樣本翼抠，20個(gè)中度重度胰腺炎樣本，10個(gè)重度胰腺炎樣本）获讳，以健康志愿者為健康對(duì)照組（32個(gè)樣本）的外周血mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)阴颖，通過DEseq2軟件包進(jìn)行差異表達(dá)分析（圖1A），共鑒定了1064個(gè)DEGs丐膝。如圖1B所示量愧，前50個(gè)上調(diào)和下調(diào)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可以區(qū)分大部分疾病樣本，特別是重癥樣本帅矗，與健康樣本（圖1B）偎肃。"中性粒細(xì)胞脫顆粒"是在輸入基因列表中富集術(shù)語的柱狀圖中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要途徑（圖1C）。"對(duì)刺激的反應(yīng) "是GO分析中最明顯的術(shù)語（圖1D）浑此。這些術(shù)語強(qiáng)調(diào)了中性粒細(xì)胞在AP發(fā)生中的關(guān)鍵價(jià)值累颂。PPI分析表明，存在一些密度顯著的模塊凛俱，包括與IL-1R1紊馏、IL-1RN、IL-1R2蒲犬、IL-10和MMP1的模塊朱监，與HIST家族基因的模塊，以及與MAPK相關(guān)基因的另一個(gè)模塊（圖1E）原叮。IL-10赫编、IL-6、OSM奋隶、MMP9擂送、MMP1、LCN2唯欣、HGF嘹吨、TIMP1、IL1B和HIST1H4F被確定為前10個(gè)富集的基因（圖1F黍聂，G）。
????????為了進(jìn)一步明確正常外周血和不同的AP亞型（MAP身腻、MSAP和SAP）之間的潛在機(jī)制和基因模塊产还，在批量歸一化后對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集的疾病樣本進(jìn)行了WGCNA（圖2A）。如圖2B嘀趟、C所示脐区，所有的樣本都被包括在內(nèi)。棕色模塊和綠松石模塊是兩個(gè)重要的基因模塊她按，分別與AP的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)（圖2D）牛隅。其他基因模塊具有緊湊的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖5C）炕柔。WGCNA的結(jié)果表明，棕色模塊和綠松石模塊中的基因操縱著AP的共同生物過程媒佣。
02 - 篩選基因模塊中關(guān)鍵GO術(shù)語和KEGG通路的研究
????????為了進(jìn)一步調(diào)查所確定的模塊中的基因功能和重要的KEGG途徑匕累，使用了Metascape數(shù)據(jù)庫。與T細(xì)胞激活和病毒感染有關(guān)的 "RNA的代謝 "途徑在綠松石模塊中明顯富集默伍。綠松石模塊的路徑網(wǎng)絡(luò)顯示欢嘿，這三個(gè)方面的相關(guān)路徑獨(dú)立作用（圖3A）。此外也糊，"中性粒細(xì)胞脫顆粒"炼蹦、"炎癥反應(yīng)"和 "對(duì)細(xì)菌的反應(yīng) "在棕色模塊中明顯富集。綠松石模塊的路徑網(wǎng)絡(luò)顯示狸剃，這些相關(guān)的路徑發(fā)揮了協(xié)同作用（圖3B）掐隐。
03-急性胰腺炎中免疫細(xì)胞亞型和可靠生物標(biāo)志物的鑒定
????????在免疫細(xì)胞類型浸潤(rùn)分析中，結(jié)果表明钞馁，隨著AP的進(jìn)展虑省，外周血DCs、單核細(xì)胞指攒、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈上升趨勢(shì)慷妙，而B細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞允悦、CD8 T細(xì)胞膝擂、Treg細(xì)胞、T輔助（Th）細(xì)胞隙弛、Th1細(xì)胞架馋、Th2細(xì)胞和Tfh細(xì)胞呈下降趨勢(shì)（圖4A）。然后全闷，在嚴(yán)重AP組（MSAP&SAP）和對(duì)照組（健康對(duì)照和MAP）之間執(zhí)行隨機(jī)森林分析（圖4B）叉寂。前30個(gè)基因被列出（圖4C）。在這些基因中总珠，有10個(gè)基因屏鳍，包括S100A6、S100A9局服、S100A12钓瞭、CD63、ITK淫奔、CD5山涡、ANXA3、KLF12、TRABD2A和CCR7鸭丛，被確認(rèn)具有重要的診斷價(jià)值（圖4D）竞穷。
????????如圖5A所示，所有八個(gè)基因在健康對(duì)照組鳞溉、MAP組和MSAP&SAP組之間都有明顯的差異瘾带。由于檢測(cè)錯(cuò)誤率較低，表達(dá)量較高的基因更適合作為診斷因素穿挨。按照這一標(biāo)準(zhǔn)月弛，篩選出三個(gè)具有重要價(jià)值的基因作為診斷因子（最小相對(duì)表達(dá)量>500），包括S100A6科盛、S100A9和S100A12帽衙。為了測(cè)試這些基因在鑒定AP嚴(yán)重程度方面的穩(wěn)健性，作者收集了28份外周血樣本贞绵，并檢測(cè)了這些基因的相對(duì)表達(dá)厉萝。患者按AP的嚴(yán)重程度進(jìn)行分組（MSAP&SAP組和MAP組）榨崩。在這兩組中谴垫，所有基因的表達(dá)值都有明顯的差異（圖5B）。ROC分析也驗(yàn)證了這些基因在SAP和MAP之間具有明顯的診斷價(jià)值（圖5C）母蛛。
04-識(shí)別急性胰腺炎和COVID-19之間的共同生物過程和關(guān)鍵的外周血細(xì)胞類型
????????為了進(jìn)一步探索COVID-19誘導(dǎo)的胰腺炎的共同生物學(xué)過程和關(guān)鍵細(xì)胞類型翩剪，在以下研究中使用了GSE152418數(shù)據(jù)集。通過DEseq2軟件包共鑒定了1494個(gè)DEGs彩郊，在AP和COVID-19患者的外周血中共發(fā)現(xiàn)161個(gè)共同上調(diào)的基因和12個(gè)下調(diào)的基因（圖6A）前弯。在這些常見基因的KEGG通路分析中，"中性粒細(xì)胞脫顆粒 "被顯著富集（圖6B）秫逝。"中性粒細(xì)胞脫顆粒 "途徑在網(wǎng)絡(luò)的中心作用中被確定為最有意義的價(jià)值（圖6C恕出，D）。
05-單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中中性粒細(xì)胞類型的鑒定
????????以前的研究表明违帆，COVID-19誘導(dǎo)的敗血癥可以潛在地誘發(fā)和加速AP浙巫。然而，目前還沒有與細(xì)菌誘導(dǎo)的敗血癥（另一種常見的敗血癥原因）有關(guān)的報(bào)道刷后。根據(jù)上述分析的畴，中性粒細(xì)胞可能是一個(gè)重要的亞型，作為COVID-19感染和外周血中AP的共同致病因素尝胆。因此丧裁，接下來通過分析單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)來研究細(xì)菌引起的敗血癥和COVID引起的敗血癥之間中性粒細(xì)胞的變化，以確定COVID-19引起的AP中外周血的致病因素班巩。如圖7A所示渣慕，在以下步驟中選擇0.05作為分辨率。第1抱慌、6和9組被確定為中性粒細(xì)胞（圖7B-D）逊桦。
????????然后，對(duì)確定的中性粒細(xì)胞進(jìn)行篩選抑进，并提取到以下分析中强经。確定了五個(gè)中性粒細(xì)胞亞組（圖8A-C）。如圖8D所示寺渗，0組在COVID-19組中明顯上調(diào)匿情，3組在細(xì)菌誘導(dǎo)的敗血癥中明顯增加。每組的前10個(gè)基因被篩選出來（圖8E）信殊。重要的是炬称，第0組的top基因與IFN反應(yīng)性表型和炎癥有關(guān)。第3組和第4組更有可能表現(xiàn)出增殖型表型涡拘。中性粒細(xì)胞脫顆粒與中性粒細(xì)胞的激活明顯相關(guān)玲躯。中性粒細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志基因是MPO、ELANE鳄乏、CAMP跷车、CYBA、MMP8和MMP25橱野。如圖8F所示朽缴，中性粒細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)記基因在0組中明顯上調(diào)。綜上所述水援，0組代表成熟的活化中性粒細(xì)胞的一個(gè)亞型密强，主要在COVID-19誘導(dǎo)的敗血癥中富集，IFN相關(guān)基因高表達(dá)裹唆。
06- 0組中性粒細(xì)胞是急性胰腺炎的潛在致病亞型
????????最后誓斥，通過單細(xì)胞通路分析驗(yàn)證后，0組被確定為IFN相關(guān)組（圖9A许帐，B）劳坑。偽時(shí)間位點(diǎn)分析說明，第5組代表了敗血癥中中性粒細(xì)胞的幼稚和失活表型成畦，第0組的進(jìn)化軌跡與其他成熟中性粒細(xì)胞不同（圖9C距芬，D）。然后循帐，在第0組中確定了一些共同的代謝相關(guān)途徑框仔，包括 "脂肪酸降解"、"α-亞麻酸代謝"拄养、"硫代謝"和 "脂肪酸生物合成"（圖9E离斩，F(xiàn)）银舱。最后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證確定的IFN相關(guān)的中性粒細(xì)胞致病亞型跛梗，使用cibersoftx軟件從AP患者和健康對(duì)照組中所有中性粒細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)中估計(jì)確定的亞型的比例（基于前GEO批量測(cè)序數(shù)據(jù)集：GSE194331）寻馏。該亞型的比例在健康對(duì)照組的外周血中幾乎為0，在AP患者的外周血中明顯上調(diào)核偿，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而上升（圖9G）诚欠。
四、結(jié)論
????????作者首次對(duì)100多個(gè)人類血液樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了WGCNA漾岳，分為健康組轰绵、MAP組、MSAP組和SAP組尼荆，并確定了功能基因模塊左腔。然后，通過機(jī)器學(xué)習(xí)方法確定了功能基因模塊中具有重要診斷價(jià)值的關(guān)鍵基因捅儒。最后翔悠，研究了COVID-19誘導(dǎo)的AP的潛在機(jī)制和致病的中性粒細(xì)胞亞型。這些結(jié)果有助于急性胰腺炎的預(yù)后預(yù)測(cè)和COVID-19誘發(fā)的急性胰腺炎的研究野芒。
