摘要：
新冠患者SARS-CoV-2 entry受體ACE2的表達(dá)比正常高了3倍沐兵，并與免疫細(xì)胞的干擾素表達(dá)相關(guān)上炎。
和中度患者相比荡澎，重癥患者顯示出更強(qiáng)的上皮細(xì)胞免疫細(xì)胞互作谨读，引起免疫細(xì)胞激活局装，炎性巨噬細(xì)胞表達(dá)CCL2, CCL3, CCL20, CXCL1, CXCL3, CXCL10, IL8, IL1B 和 TNF。
和中度患者相比劳殖，重癥患者的轉(zhuǎn)錄差異可能引起了免疫介導(dǎo)的組織損傷铐尚、肺損傷和呼吸衰竭。
藥物抑制CCR1和/或CCR5通路可能可以抑制重癥COVID-19患者的免疫活化哆姻。

為了從分子和細(xì)胞水平探究COVID-19的機(jī)制宣增，該研究通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序?qū)颊吆驼?duì)照的鼻咽和支氣管樣本進(jìn)行了檢測(cè)。此前有研究使用單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)了COVID-19患者肺泡灌洗液樣本矛缨，較全面的揭示了下呼吸道的免疫表型爹脾。然而SARS-CoV2和其它冠狀病毒在上下呼吸道都可以感染和復(fù)制。上呼吸道的主要作用在于清除吸入的病原體從而阻止病毒侵入下呼吸道引起肺部損傷箕昭×榉粒控制病毒擴(kuò)散依賴(lài)于上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用。在病毒清除后落竹，激活的免疫細(xì)胞必須被清除以避免免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活并加重組織損傷闷串。有證據(jù)顯示重癥COVID-19患者的組織損傷是由過(guò)度激活的免疫反應(yīng)而非病毒持續(xù)擴(kuò)散所介導(dǎo)。為了探究這些問(wèn)題筋量，作者對(duì)COVID-19患者的上下呼吸道包括上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的樣本進(jìn)行了檢測(cè)烹吵，以期更全面的研究疾病發(fā)生時(shí)的黏膜免疫。
該研究發(fā)現(xiàn)疾病嚴(yán)重程度和呼吸道上皮和免疫細(xì)胞的相互作用相關(guān)桨武，高度活化的促炎性巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞似乎促進(jìn)了上皮細(xì)胞死亡肋拔。

1. Cellular and molecular characterization of COVID-19 severity

樣本包括8個(gè)中度癥狀新冠患者(取了14個(gè)鼻拭子(圖1b中的方塊)，11個(gè)重癥患者[(取了11個(gè)鼻拭子(圖1b中的方塊呀酸，2個(gè)支氣管灌洗液(圖1b中星號(hào))]凉蜂，5個(gè)正常對(duì)照(只取了鼻拭子)。采集的36（性誉？文中寫(xiě)的36窿吩，我只看到了32個(gè)）個(gè)樣本進(jìn)行了3′ scRNA-seq。

一共得到了160528個(gè)細(xì)胞错览。鼻拭子樣本的細(xì)胞鑒定得到了22個(gè)細(xì)胞群纫雁。細(xì)胞群和比例變化如下圖。

數(shù)據(jù)處理：

• 前期處理：測(cè)得的raw data首先使用了CellRanger處理倾哺，再使用SoupX??過(guò)濾了背景RNA（MUC1, MUC5AC and MUC5B作為marker基因）轧邪。過(guò)濾后的矩陣被載入Seurat刽脖。
• 過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)：< 200 gene & >percent.mt >15%，樣本間UMI過(guò)濾上限標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一（從50000-200000不等）忌愚。（注：同一來(lái)源的樣本曲管，標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)盡量統(tǒng)一）
• 標(biāo)準(zhǔn)化：The samples were normalized to 10,000 reads, scaled and centered.(Seurat標(biāo)準(zhǔn)操作)
• 樣本整合：使用的是Seurat的SelectIntegrationFeatures()錨點(diǎn)整合功能。
  這種整合方法此前介紹過(guò)硕糊，見(jiàn)：多個(gè)10x單細(xì)胞對(duì)象的合并和批次校正--seurat錨點(diǎn)整合+Harmony院水。我個(gè)人更喜歡Harmony。
• 降維：PCA和UMAP都是Seurat常規(guī)操作简十。
• 分群：FindNeighbors()和FindClusters()也是Seurat常規(guī)操作衙耕。
  值得注意的是，在PCA后勺远，F(xiàn)indNeighbors()分析選了90個(gè)PC橙喘。一般不會(huì)用到這么多，是因?yàn)榧?xì)胞數(shù)比較多的原因胶逢？
  FindClusters()的resolution=0.6厅瞎。
• 細(xì)胞注釋?zhuān)簃arker基因見(jiàn)下圖
  a：鑒定上皮細(xì)胞使用的marker；b：鑒定免疫細(xì)胞使用的marker初坠。

• ??圖b展示細(xì)胞比例的方法比普通的堆疊條形圖要直觀一些和簸，不知道是怎么畫(huà)出來(lái)的，后續(xù)研究一下碟刺。

2. Dynamics of epithelial differentiation upon SARS-CoV-2 infection.

正常情況下锁保，基底細(xì)胞（basal cells, TP63+/KRT5+）可以分化為分泌細(xì)胞（secretory cells），分泌細(xì)胞再分化為纖毛細(xì)胞（ciliated cells）半沽。這個(gè)過(guò)程由FOXN4細(xì)胞介導(dǎo)（圖a,b,d中的Different path 1）槐脏。驅(qū)動(dòng)這一過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子包括FOXJ1和TCTEX1D2或辖。
在刺激或損傷的情況下琳拭，基底細(xì)胞直接分化為纖毛細(xì)胞喘漏，繞過(guò)了分化成分泌細(xì)胞這個(gè)階段（圖a,b,d中的Different path 2）。參與了這個(gè)過(guò)程的基因包括cytokeratins (KRT4 and KRT7)和細(xì)胞纖毛組成基因 (IFT43)占哟。
此外心墅，該研究預(yù)測(cè)出了一條新的分化途徑different path 3。該過(guò)程由IFNG-反應(yīng)性細(xì)胞介導(dǎo)不成熟的分泌細(xì)胞直接分化為纖毛細(xì)胞榨乎，并有干擾素刺激基因（ISG）如ISG15, IFIT1 和 CXCL10的參與怎燥。

這個(gè)monocle3的圖出的好好哦，但是蜜暑！感覺(jué)就算我的結(jié)果出成這樣铐姚，我也不能解讀的這么好，這大概就是我跟nature biotechnology的差距吧史煎。谦屑。驳糯。

• 這一部分用到的分析主要是在做比對(duì)的時(shí)候額外比對(duì)了一個(gè)特制的參考基因組篇梭，SARS-CoV-2基因組（Refseq-ID: NC_045512）作為額外的染色體被加入了human reference genome hg19氢橙。An entry summarizing the entire SARS-CoV-2 genome as one ‘gene’ was appended to the hg19 annotation gtf file, and the genome was indexed using ‘cellranger_mkref ’.??
• 上圖所展示的擬時(shí)序分析是monocle3做的(參考：monocle3)，所以他的圖a(細(xì)胞注釋圖)和圖b(擬時(shí)序圖)可以是一樣形狀的umap圖恬偷，這也是monocle3和monocle2相比的一個(gè)大改進(jìn)悍手。但Monocle3只是用來(lái)畫(huà)了軌跡圖，作者算擬時(shí)基因還是用monocle2(To identify genes that are significantly regulated as the cells differentiate along the cell-to-cell distance trajectory, we used the differentialGeneTest() function implemented in Monocle2)
  ??d圖也是用monocle2畫(huà)的袍患，是把三個(gè)path的細(xì)胞分開(kāi)坦康，然后用ggplot2分別畫(huà)的density圖。

3. Variable ACE2 expression in the upper airway epithelium.

SARS-CoV-2通過(guò)結(jié)合宿主ACE2受體和S蛋白感染上呼吸道黏膜诡延，通過(guò)細(xì)胞蛋白酶TMPRSS2或FURIN的協(xié)同作用進(jìn)入細(xì)胞滞欠。和正常對(duì)照相比，COVID-19患者的SCE2和協(xié)同蛋白（蛋白酶TMPRSS2或/和FURIN）的表達(dá)水平增加了三倍(Sup1b)肆良。盡管感染后ACE2+的纖毛細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有增加筛璧，總的ACE2+細(xì)胞數(shù)目增加了，提示機(jī)體對(duì)新冠的易感性增強(qiáng)惹恃。

Sup1b

大多數(shù)的纖毛細(xì)胞是ACE2+/TMPRSS2+夭谤，分泌細(xì)胞和FOXN4+細(xì)胞是ACE2+/TMPRSS2+/FURIN+。在被SARS-CoV-2感染的細(xì)胞感染的細(xì)胞中巫糙，分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞占了最多的比例（下圖d）朗儒。此外，每百萬(wàn)（CPM）reads中檢測(cè)到的病毒轉(zhuǎn)錄本在所有的COVID-19患者中都相當(dāng)?shù)筒窝停掖蠖鄶?shù)都是在出現(xiàn)癥狀前11天檢測(cè)到（下圖e）醉锄。

Fig2

4. Immune cell–epithelial cell interactions increase infectability of epithelial cells.

SARS-CoV-2感染讓人比較困惑的一個(gè)問(wèn)題是正常人群呼吸道ACE2+受體細(xì)胞數(shù)目相當(dāng)少。我們的研究發(fā)現(xiàn)浙值，感染后一個(gè)上皮細(xì)胞亞群的ACE2表達(dá)量增加了三倍（上上圖sup1b）榆鼠。此外，ACE2+的纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞百分比和這些細(xì)胞與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs）之間的互作（配體受體表達(dá)）呈現(xiàn)相關(guān)性（下圖）亥鸠。此前的研究提示妆够，ACE2的表達(dá)是干擾素反應(yīng)性的。我們的研究發(fā)現(xiàn)负蚊，干擾素反應(yīng)的一個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子STAT1是ACE2表達(dá)的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)之一神妹，這進(jìn)一步證實(shí)了先前的研究結(jié)論。CTLs高表達(dá)IFNG家妆，分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞表達(dá)IFNG的受體IFNGR1和IFNGR2鸵荠，提示免疫細(xì)胞的IFNG信號(hào)通路（至少是部分）參與了上皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的上調(diào)。

5. Immune-mediated epithelial damage in severe COVID-19

在病毒感染的部位伤极，被感染的上皮細(xì)胞分泌趨化因子蛹找，招募和活化不同的免疫細(xì)胞群姨伤。和對(duì)照組相比，中度COVID-19患者的分泌細(xì)胞明顯高表達(dá)趨化因子配體CXCL1, CXCL3, CXCL6, CXCL16和CXCL17（下圖中）庸疾。纖毛細(xì)胞高表達(dá)CCL5乍楚，可能通過(guò)CCR1參與了單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞招募。和中度患者相比届慈，重癥患者不同細(xì)胞群趨化因子和趨化因子受體的表達(dá)顯著增加（下圖下）徒溪，提示感染部位免疫細(xì)胞招募增強(qiáng)。

細(xì)胞互作結(jié)果顯示金顿，如下左圖臊泌，中度患者的纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞與各種免疫細(xì)胞（包括CTLs, CTLs, CD4T/Tregs, B細(xì)胞, 非原駐巨噬細(xì)胞 (nrMa), 單核來(lái)源的巨噬細(xì)胞 (moMa) 和中性粒細(xì)胞）的相互作用可能反應(yīng)了有效清除病毒感染的內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)必要和適度的免疫反應(yīng)（下左圖）。和中癥患者相比揍拆，重癥患者各種細(xì)胞之間的互作顯著增強(qiáng)渠概，尤其是CTL，nrMa和moMa（下右圖）嫂拴。

重癥患者更多的上皮-免疫細(xì)胞互作與nrMa播揪，moMa和CTL更高的激活狀態(tài)相一致。nrMa的各種趨化因子編碼基因CCL2 (編碼MCP1), CCL3 (編碼MIP1α), CCL20, CXCL1和CXCL3顷牌，以及各種促炎細(xì)胞因子IL1B, IL8, IL18和TNF表達(dá)顯著增加剪芍。moMa主要表達(dá)CCL2, CCL3和CXCL10，而重癥COVID-19患者CCL3表達(dá)也增強(qiáng)（下圖c）窟蓝。值得注意的是罪裹，增加的CCL2和CCL3表達(dá)和中性粒細(xì)胞、CTLs运挫、不同的巨噬亞群顯著增加的CCR1(編碼的受體可與MIP1a和MCP1相結(jié)合)表達(dá)相對(duì)應(yīng)（下圖d）状共。在中度癥狀患者中，CTLs顯示出抗病毒的CD8+T細(xì)胞的表達(dá)譜谁帕，高表達(dá)IFNG, TNF, CCL5和PRF1 (編碼穿孔素perforin) 以及GZMB和GZMA (編碼顆粒酶granzymes) 還有編碼cytotoxic receptors的基因(KLRB1, KLRC1和KLRD1)峡继。重癥患者的CTL低表達(dá)CCL5, IFNG和TNF但表現(xiàn)出更強(qiáng)的胞溶功能（下圖c）。
隨后對(duì)上下呼吸道都采集了樣本的兩組配對(duì)樣本進(jìn)行了分析（都是重癥的）匈挖，顯示下呼吸道免疫反應(yīng)更強(qiáng)碾牌。

這一部分的細(xì)胞互作分析都是cellphonedb做的，參考：cellphonedb

6. Patient-specific inflammatory profiles.

因?yàn)榛颊邩颖静傻氖遣煌瑫r(shí)間點(diǎn)的儡循，所以這部分選了四個(gè)不同嚴(yán)重程度（12舶吗，07，06择膝，02）的樣本進(jìn)行了分別分析誓琼，以探究整個(gè)發(fā)病時(shí)程。

中度12患者和重度初期07患者表達(dá)譜類(lèi)似，而06和02兩個(gè)嚴(yán)重的患者CCL20, CXCL5, CXCL3, CXCL1, CCL和CCL2表達(dá)增加腹侣，TNF和IL1B表達(dá)也增加叔收。對(duì)極重的02患者，上述細(xì)胞因子表達(dá)更高傲隶。
免疫細(xì)胞的溢出饺律、招募外周血單核細(xì)胞到受感染或損傷的部位以及它們沿著內(nèi)皮遷移是早期機(jī)體對(duì)抗病毒感染的重要免疫防御機(jī)制。很多分子參與了單核細(xì)胞穿越血管壁的遷移（monocyte trafficking）伦籍。評(píng)估不同COVID-19嚴(yán)重程度下溢出級(jí)聯(lián)反應(yīng)（extravasation cascade）的marker表達(dá)蓝晒，結(jié)果顯示這些基因在nrMa中出現(xiàn)了顯著的增強(qiáng)腮出。ITGAL (編碼CD11a), ITGAM (編碼CD11b), ITGAX (編碼CD11c), ITGB1 (編碼CD29)和ITGB1 (編碼CD18) 以及LFA-1, Mac-1和VLA-4這些基因都在單核細(xì)胞穿越內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中起到重要作用帖鸦。
和中癥12號(hào)患者相比，06患者出現(xiàn)了明顯的ITGAM, ITGAX, ITGB2和ITGB1表達(dá)增加胚嘲。這與表達(dá)CD44（機(jī)體免疫防御的關(guān)鍵介質(zhì)）的細(xì)胞比例增加相一致作儿。此外，ICAM1和VEGFA（通常由上皮細(xì)胞表達(dá)以招募白細(xì)胞）在單核細(xì)胞表達(dá)增加馋劈，顯示單核細(xì)胞可以也招募單核細(xì)胞攻锰。增加的溢出marker的表達(dá)也預(yù)示著增強(qiáng)的抗病毒反應(yīng)和因此引起的內(nèi)皮和上皮屏障等的破壞

這部分值得注意的是：Extravasation cascade這個(gè)概念和extravasation相關(guān)基因的變化及其解讀。??

創(chuàng)新點(diǎn)：

1. 同時(shí)提供了上下呼吸道的細(xì)胞水平研究妓雾。同一時(shí)間點(diǎn)同一患者上下呼吸道的對(duì)比娶吞，顯示下呼吸道出現(xiàn)了免疫過(guò)度活化表型。
2. 免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的互作可能引起了過(guò)度免疫活化介導(dǎo)的組織損傷械姻、肺損傷和呼吸衰竭妒蛇。（主要依賴(lài)于細(xì)胞互作分析）
3. 對(duì)整個(gè)病程不同時(shí)間點(diǎn)的樣本進(jìn)行了分析。