當(dāng)我們做到熒光定量實驗時候锭魔，普遍采用操作簡便的2–ΔΔCT 法。
前提條件：
1. 使用2–ΔΔCT 法之前迷捧，必須驗證目標(biāo)基因和參照基因的擴增效率胀葱。目標(biāo)基因和參照基因擴增效率都接近100%， 且相互間效率偏差在5% 以內(nèi)抵屿。
計算方法：
首先，對所有的測試樣和校準(zhǔn)樣本捅位，用內(nèi)參基因的CT 值歸一目標(biāo)基因的CT 值：
ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)
ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator)
其次，用校準(zhǔn)樣本的ΔCT 值歸一試驗樣本的ΔCT 值：
ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)
最后艇搀，計算表達水平比率：
2–ΔΔCT = 表達量的比值
計算模板建立
而現(xiàn)在我們現(xiàn)在用的這款儀器QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System是無法計算的，所以需要自己手動計算焰雕，理解原理更容易操作。當(dāng)然矩屁，此公式適合于所有2–ΔΔCT 法的熒光定量辟宗。
經(jīng)我修改后計算模板：
Quantitative PCR calculation template for QuantStudio(TM) 7 Flex System_J.F.XIE(均值法) .xls
https://pan.baidu.com/s/1qiubuZxm0y_3F6VYP0obJg
Extract code：hybr
案例展示
以吉瑪生物公司試劑說明書案例為例吝秕，來計算 microRNA 相對于 U6 snRNA 的表達比率。
運用計算模板郭膛，只需對應(yīng)輸入數(shù)據(jù)氛悬，即可自動計算出公式，結(jié)果如下：
值得注意幾點：
1. 數(shù)據(jù)修正：三個重復(fù)如捅，如果CT值差異在0.2以外，則應(yīng)剔除掉镜遣，所得結(jié)果均值會更加好己肮。
2. 數(shù)據(jù)錄入：我們在做PCR時候悲关，已經(jīng)排好版面谎僻，所以再挑出這些基因及內(nèi)參時候寓辱，需要花費精力艘绍。簡單點秫筏，可以將結(jié)果復(fù)制粘貼到新的excle文檔诱鞠，然后“篩選”，依次篩選出不同模板的“內(nèi)參”航夺、“靶標(biāo)基因”的CT值，如下圖篩選出的是EGFP對照處理組內(nèi)參rpl32的CT值阳掐。
3. 對應(yīng)：做定量時候，同一模板做基因锚烦，又檢測內(nèi)參觅闽，所以關(guān)系是一一對應(yīng)涮俄，所以在錄入時候蛉拙，一定要對應(yīng)準(zhǔn)確彻亲，每個孔都有Well Position孕锄，結(jié)合著384孔板來看苞尝，強烈建議在做排版設(shè)計之初畸肆，就做到簡潔宙址、對稱、明了抡砂，便于后續(xù)分析大咱。
如果在下機前注益，有部分孔擴增有問題碴巾，如雙曲線丑搔，不要“剔除”厦瓢，可以直接將其記錄下來或者清空這個孔的CT（不是改為0）啤月，因為一旦“omit”之后煮仇，我們后續(xù)篩選時候谎仲，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不對稱欺抗，會比較麻煩强重，容易出錯绞呈。
4. 計算表達值時候，會有一個生物重復(fù)做歸一化佃声，即2的0次方為1，案例中的calibrator圾亏。這個自己可以選十拣，我習(xí)慣將排版的最開始的那一個做歸一志鹃。
如果你想將所有表達基因，都可以展示在一張圖片上曹铃，那所有值應(yīng)該都與這個歸一化值做比較缰趋。
可以看到陕见，Well Position是比較整齊的秘血，依次為GHIIJK评甜，當(dāng)篩選基因時候，也會一一對應(yīng)忍坷，不會出錯粘舟。
