01 啟動子的基本類型
啟動子是基因的重要組成部分祷愉，其主要功能為調(diào)控基因表達（轉(zhuǎn)錄）的起始時間和表達程度涣仿。但啟動子本身并不控制基因活動，而是通過與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來控制基因活動嗜桌。根據(jù)啟動子對轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控程度奥溺，將其分為弱啟動子和強啟動子；此外骨宠，參照轉(zhuǎn)錄模式浮定，其又可被分為：
（1）組成型啟動子（Constitutive promoter），能夠調(diào)控基因表達层亿，使其基本恒定在一定程度上桦卒，從而使基因在不同部位或組織中的表達水平不存在明顯差異；（2）組織特異性啟動子（Tissue specific promoter）匿又，其調(diào)控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達方灾，且表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性；（3）誘導(dǎo)型啟動子（Inducible promoter）碌更，即在某些特定的物理或化學信號刺激后裕偿，基因轉(zhuǎn)錄水平在該類啟動子的調(diào)控下大幅度地提升。
02 啟動子的特點
（1）通常含一些特定的元件痛单，如TATA box嘿棘；
（2）具有方向性，調(diào)控啟動下游的基因表達桦他；
（3）長度的不確定性蔫巩，一般認為ATG上游2500bp的序列是該基因的啟動子序列谆棱；
（4）一個基因通常含有多個啟動子，啟動不同轉(zhuǎn)錄本的表達圆仔；
（5）某些啟動子具有表達的時空性和組織特異性垃瞧。
03 啟動子的研究思路
啟動子功能及結(jié)構(gòu)的研究，可以從以下幾個方面著手：
（1）啟動子結(jié)構(gòu)研究坪郭，包括核心啟動子區(qū)域个从、正調(diào)控區(qū)域、負調(diào)控區(qū)域以及增強子的確定歪沃；
（2）組織特異性啟動子篩選及確定嗦锐；
（3）轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件相互作用研究；
（4）啟動子甲基化作用研究沪曙；
（5）新順式作用元件發(fā)現(xiàn)及功能鑒定奕污。
04 研究路線
05 啟動子研究的相關(guān)技術(shù)方法
5.1 啟動子克隆
啟動子克隆，一般分為兩種類型：一種是已知啟動子序列液走，可以直接采用基因克隆的方法進行實驗碳默；另一種是未知啟動子序列，只知道轉(zhuǎn)錄組或部分編碼序列缘眶，這個時候就可以采用特殊的的擴增方法——染色體步移進行未知序列的擴增嘱根。
染色體步移（Genome Walking）可以克隆已知序列的側(cè)翼未知序列，基于PCR技術(shù)的染色體步移技術(shù)先后有十幾種方法巷懈，目前最常使用的是TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR）该抒，即交錯式熱不對稱PCR技術(shù)。利用特異性套嵌引物顶燕，結(jié)合簡并引物釣取側(cè)翼序列凑保，其基本原理是利用目標序列附近的已知序列設(shè)計3個嵌套的特異引物（SP1，SP2割岛，SP3）愉适，用它們分別和1個具有低Tm值的短的隨機簡并引物（AD）相結(jié)合，根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計不對稱的溫度循環(huán)癣漆，通過分級反應(yīng)來擴增特異產(chǎn)物维咸。
圖1 TAIL-PCR原理示意圖。
5.2 啟動子活性分析
啟動子的表達模式及強度只能通過報告基因來檢測惠爽，目前在植物啟動子的研究中常用的報告基因有β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）癌蓖、綠色熒光蛋白基因（GFP）及其衍生出來的其他熒光蛋白、熒光素酶基因（LUC）等婚肆，其中最常用的是GUS報告基因租副。使用“啟動子-報告基因-終止子”的載體構(gòu)建方式，該方式適用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)较性、基因槍轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定表達系統(tǒng)等用僧。將啟動子與GUS報告基因相連進行轉(zhuǎn)化结胀，根據(jù)植物組織染色的結(jié)果可判斷啟動子表達的時空性和表達強度。
圖2 GUS作為報告基因分析啟動子在不同組織的表達模式(Qin et al., 2011)责循。
5.3 啟動子核心元件分析
對于啟動子糟港，我們可以通過5’非翻譯區(qū)一系列的缺失突變，構(gòu)建啟動子分析載體（如pCAMBIA1391院仿，pBWA（v）H-gus載體）秸抚，不斷縮小范圍，找到某一段對于該基因的啟動子活性是必須的或者是最重要的序列歹垫。當找到這個比較核心的啟動子序列后剥汤，可以通過一些在線的軟件去預(yù)測其順式作用元件的位點，每個在線軟件都有自己獨特的算法分析排惨，得到的結(jié)果并不都是可靠的吭敢，每個軟件都有自己的優(yōu)勢，需要多綜合一些軟件預(yù)測的結(jié)果若贮，并通過分析預(yù)測出來的轉(zhuǎn)錄因子是不是和該基因有功能上的聯(lián)系等做進一步的選擇省有，繼續(xù)做下面的驗證實驗痒留。常見的啟動子預(yù)測軟件有：
（1）Promoter 2.0 Prediction Server<u>http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/</u>（2）Softberry預(yù)測TSSW谴麦、TSSP、TSSG伸头、FPROM都是Softberry提供的啟動子預(yù)測工具匾效，<u>http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter</u>（3）Plant CARE<u>http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/</u>
5.4 基因編輯技術(shù)
基因編輯技術(shù)主要是利用序列特異性核酸酶在特定基因位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，借助編輯受體自身的DNA修復(fù)系統(tǒng)在非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）過程中產(chǎn)生隨機的Indels（Small insertions and deletions）或在同源重組修復(fù)過程中插入或替換相應(yīng)的基因片段恤磷，最終實現(xiàn)基因組序列的突變面哼。
植物的啟動子功能分析中，可以基于基因編輯技術(shù)扫步，對啟動子核心區(qū)域進行大片段刪除魔策，使啟動子功能缺失，更好的研究啟動子的核心功能河胎。另外闯袒，還可以借助點編輯進行關(guān)鍵性元件的點突變，研究啟動子元件的重要意義游岳。
圖3 gRNA指導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因剪切系統(tǒng)政敢。
5.5 EMSA
凝膠遷移實驗（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相互結(jié)合的技術(shù)，可用于定性和定量分析胚迫，是轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法喷户。反式作用因子一般指的就是轉(zhuǎn)錄因子，順式作用元件一般是指轉(zhuǎn)錄因子和啟動子結(jié)合的那部分序列访锻，一般是10-20bp左右褪尝。點突變證實該順式作用元件對于啟動子活性是有影響的闹获，接下來就要用EMSA實驗驗證反式作用因子和該順式作用元件在體外是有直接結(jié)合的，反式作用因子可以用細胞核抽提物做河哑，也可以用體外表達純化的蛋白做或該反式作用因子的抗體做Super shift實驗昌罩，利用這些實驗可以證實順式作用元件與反式作用因子的特異性結(jié)合。
圖4 EMSA基本原理示意圖灾馒。
5.6 ChIP實驗
EMSA的實驗結(jié)果并不能說明反式作用因子和順式作用元件有結(jié)合茎用，畢竟體外的結(jié)合并不能代表生理條件下的結(jié)合。接下來就要用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation assay睬罗，ChIP）技術(shù)來驗證順式作用元件和反式作用因子是否有結(jié)合轨功。
ChIP是在生理條件下將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與DNA進行交聯(lián)并在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，在超聲波作用下將其隨機切斷成一定長度的染色質(zhì)片段容达，然后沉淀該復(fù)合物古涧，特異性富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，經(jīng)過DNA純化以及其鑒定花盐，從而獲得蛋白質(zhì)和DNA相互作用的信息羡滑。
圖5 ChIP原理圖。
5.7 DNase I足跡法
DNase I足跡法是一種確定DNA結(jié)合蛋白在DNA分子上的結(jié)合位點的方法算芯。先將含有特定順式元件的雙鏈DNA片段進行單鏈末端標記柒昏，然后加入適當濃度的DNase I，對DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物進行酶切熙揍，形成不同長度的DNA片段职祷，最好保證相鄰的DNA片段只相差一個核苷酸，片段經(jīng)變性后用PAGE電泳分離届囚，放射自顯影有梆，便可形成只有一個核苷酸差異的DNA梯形帶。DNase I由于空間位阻不能直接綁定相鄰的DNA結(jié)合蛋白意系，因此泥耀，足跡特征比較明顯，一般比自身位點大8~10bp個堿基對蛔添。
圖6 DNase I足跡法原理圖(Song et al., 2015)痰催。
5.8 雙熒光報告系統(tǒng)
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游作郭，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒陨囊，然后轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)適當刺激或處理后裂解細胞夹攒，測定熒光素酶活性蜘醋。通過熒光素酶活性高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。雙熒光報告系統(tǒng)在啟動子分析中有如下應(yīng)用：
（1）啟動子結(jié)構(gòu)分析：將待測啟動子區(qū)域序列進行分段截短咏尝，或?qū)μ囟ㄎ稽c進行突變压语，再分別插入LUC/GUS報告基因上游啸罢，檢測其啟動子的活性。
圖7 啟動子結(jié)構(gòu)分析胎食。
（2）啟動子SNP分析：一些基因的啟動子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性扰才，將待測啟動子插入FLuc報告基因上游，檢測螢光素酶活性厕怜，從而判斷這些啟動子的相對活性衩匣。
圖8 啟動子SNP分析。
（3）轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的互作分析：將該啟動子序列插入LUC報告基因上游粥航，同時在細胞中共轉(zhuǎn)表達轉(zhuǎn)錄因子琅捏，分析轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)控螢光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的調(diào)控作用递雀。
圖9 啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的互作分析柄延。
5.9 啟動子區(qū)域甲基化
DNA甲基化是一個生物過程，可在DNA分子中引入甲基化基團缀程，其不會改變DNA序列本身搜吧，而只是改變DNA片段的活性。據(jù)報道杨凑，在幾乎所有已分析過的生物中滤奈，啟動子區(qū)域的甲基化水平均與基因表達負相關(guān)，且具有轉(zhuǎn)錄活性基因的CpG密集啟動子從未被甲基化蠢甲，但是僵刮，轉(zhuǎn)錄沉默基因并不一定帶有甲基化的啟動子。值得注意的是鹦牛，盡管CpG島的DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制作用明確相關(guān)，但對CG缺乏的啟動子中DNA甲基化的功能仍不清楚勇吊。研究顯示曼追，DNA甲基化可能以兩種方式影響基因轉(zhuǎn)錄：其一為DNA本身的甲基化可能在物理上阻礙轉(zhuǎn)錄因子與基因的結(jié)合；其二為甲基化的DNA可能被稱為甲基CpG結(jié)合域（methyl-CpG-binding domain汉规，MBD）的蛋白結(jié)合礼殊，促使MBD蛋白將其他蛋白募集到位點，例如組蛋白脫乙跽胧罚基酶和其他可以修飾組蛋白的染色質(zhì)重塑因子晶伦，從而形成致密的、無活性的異染色質(zhì)啄枕。
圖10 BSP甲基化檢測結(jié)果(Date from labreal. net)婚陪。
5.10 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)
植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把從動物、植物频祝、微生物中分離到的目的基因或者人工設(shè)計合成的核酸片段泌参，通過多種方法轉(zhuǎn)移到植物的基因組中脆淹，使之穩(wěn)定遺傳。植物啟動子研究過程中往往需要進行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化沽一，實驗中需要將構(gòu)建的啟動子分析載體盖溺，借助于農(nóng)桿菌或者基因槍，穩(wěn)定轉(zhuǎn)入植物之中铣缠，獲得轉(zhuǎn)基因苗烘嘱，然后對其進行進一步的實驗分析，（PS：我司目前可提供的常規(guī)轉(zhuǎn)化物種有：水稻蝗蛙、煙草拙友、油菜、番茄歼郭、擬南芥遗契、棉花、大豆病曾、玉米牍蜂、楊樹、馬鈴薯泰涂、苜蓿和黃瓜等）鲫竞。
圖11 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化流程。
REFERENCES
Qin BX, Tang D, Huang J, et al. Rice OsGL1-1 is involved in leaf cuticular wax and cuticle membrane. Mol Plant, 2011, 4(6): 985-95.
Song C, Zhang S, Huang H. Choosing a suitable method for the identification of replication origins in microbial genomes. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.
