- 什么是高通量測(cè)序？
高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS）是對(duì)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序（稱(chēng)為一代測(cè)序技術(shù)）革命性的改變,一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定, 因此在有些文獻(xiàn)中稱(chēng)其為下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing红碑，NGS )足見(jiàn)其劃時(shí)代的改變, 同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能, 所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序(Deep sequencing)。
- 什么是Sanger法測(cè)序（一代測(cè)序）
Sanger法測(cè)序利用一種DNA聚合酶來(lái)延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物镣典。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成赶舆，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)倡蝙，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)猪钮。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)烤低，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A笆载、T或C處終止扑馁。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整凉驻，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物腻要。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上沿侈，可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段缀拭，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。
- 什么是基因組重測(cè)序（Genome Re-sequencing）
全基因組重測(cè)序是對(duì)基因組序列已知的個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序层宫，并在個(gè)體或群體水平上進(jìn)行差異性分析的方法锌历。隨著基因組測(cè)序成本的不斷降低，人類(lèi)疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)域擴(kuò)大到全基因組范圍。通過(guò)構(gòu)建不同長(zhǎng)度的插入片段文庫(kù)和短序列吝镣、雙末端測(cè)序相結(jié)合的策略進(jìn)行高通量測(cè)序拴测，實(shí)現(xiàn)在全基因組水平上檢測(cè)疾病關(guān)聯(lián)的常見(jiàn)妆距、低頻、甚至是罕見(jiàn)的突變位點(diǎn)妆棒，以及結(jié)構(gòu)變異等姆另，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價(jià)值印荔。
- 什么是de novo測(cè)序
de novo測(cè)序也稱(chēng)為從頭測(cè)序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對(duì)某個(gè)物種進(jìn)行測(cè)序茶行，利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)序列進(jìn)行拼接看锉，組裝忿磅，從而獲得該物種的基因組圖譜锤灿。獲得一個(gè)物種的全基因組序列是加快對(duì)此物種了解的重要捷徑叨粘。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測(cè)序所需的成本和時(shí)間較傳統(tǒng)技術(shù)都大大降低，大規(guī)模基因組測(cè)序漸入佳境，基因組學(xué)研究也迎來(lái)新的發(fā)展契機(jī)和革命性突破。利用新一代高通量、高效率測(cè)序技術(shù)以及強(qiáng)大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地測(cè)定并分析所有生物的基因組序列婆殿。
- 什么是外顯子測(cè)序（whole exon sequencing）
外顯子組測(cè)序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。外顯子測(cè)序相對(duì)于基因組重測(cè)序成本較低捞高，對(duì)研究已知基因的SNP氯材、Indel等具有較大的優(yōu)勢(shì)，但無(wú)法研究基因組結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等硝岗。
- 什么是mRNA測(cè)序 （RNA-seq）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在基因組學(xué)后新興的一門(mén)學(xué)科氢哮，即研究特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類(lèi)型與拷貝數(shù)。Illumina提供的mRNA測(cè)序技術(shù)可在整個(gè)mRNA領(lǐng)域進(jìn)行各種相關(guān)研究和新的發(fā)現(xiàn)型檀。mRNA測(cè)序不對(duì)引物或探針進(jìn)行設(shè)計(jì)命浴，可自由提供關(guān)于轉(zhuǎn)錄的客觀和權(quán)威信息。研究人員僅需要一次試驗(yàn)即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息贱除，并分析基因表達(dá)生闲、cSNP、全新的轉(zhuǎn)錄月幌、全新異構(gòu)體碍讯、剪接位點(diǎn)、等位基因特異性表達(dá)和罕見(jiàn)轉(zhuǎn)錄等最全面的轉(zhuǎn)錄組信息扯躺。簡(jiǎn)單的樣品制備和數(shù)據(jù)分析軟件支持在所有物種中的mRNA測(cè)序研究捉兴。
- 什么是small RNA測(cè)序
Small RNA（micro RNAs蝎困、siRNAs和 pi RNAs）是生命活動(dòng)重要的調(diào)控因子，在基因表達(dá)調(diào)控倍啥、生物個(gè)體發(fā)育禾乘、代謝及疾病的發(fā)生等生理過(guò)程中起著重要的作用。Illumina能夠?qū)?xì)胞或者組織中的全部Small RNA進(jìn)行深度測(cè)序及定量分析等研究虽缕。實(shí)驗(yàn)時(shí)首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來(lái)始藕，兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄做成cDNA再做進(jìn)一步處理后，利用測(cè)序儀對(duì)DNA片段進(jìn)行單向末端直接測(cè)序氮趋。通過(guò)Illumina對(duì)Small RNA大規(guī)模測(cè)序分析伍派，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實(shí)現(xiàn)包括新miRNA分子的挖掘剩胁，其作用靶基因的預(yù)測(cè)和鑒定诉植、樣品間差異表達(dá)分析、miRNAs聚類(lèi)和表達(dá)譜分析等科學(xué)應(yīng)用昵观。
- 什么是miRNA測(cè)序
成熟的microRNA（miRNA）是17~24nt的單鏈非編碼RNA分子晾腔，通過(guò)與mRNA相互作用影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯，最終誘導(dǎo)基因沉默啊犬，調(diào)控著基因表達(dá)灼擂、細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程椒惨＄椭粒基于第二代測(cè)序技術(shù)的microRNA測(cè)序，可以一次性獲得數(shù)百萬(wàn)條microRNA序列康谆，能夠快速鑒定出不同組織领斥、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的microRNA及其表達(dá)差異沃暗，為研究microRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具月洛。
- 什么是Chip-seq
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也稱(chēng)結(jié)合位點(diǎn)分析法孽锥，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具嚼黔，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研究。將ChIP與第二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段失仁。
ChIP-Seq的原理是：首先通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段灌灾，并對(duì)其進(jìn)行純化與文庫(kù)構(gòu)建噪猾；然后對(duì)富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序。研究人員通過(guò)將獲得的數(shù)百萬(wàn)條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息狮荔。
- 什么是CHIRP-Seq
CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一種檢測(cè)與RNA綁定的DNA和蛋白的高通量測(cè)序方法胎撇。方法是通過(guò)設(shè)計(jì)生物素或鏈霉親和素探針，把目標(biāo)RNA拉下來(lái)以后殖氏，與其共同作用的DNA染色體片段就會(huì)附在到磁珠上晚树，最后把染色體片段做高通量測(cè)序，這樣會(huì)得到該RNA能夠結(jié)合到在基因組的哪些區(qū)域雅采，但由于蛋白測(cè)序技術(shù)不夠成熟爵憎，無(wú)法知道與該RNA結(jié)合的蛋白。
- 什么是RIP-seq
RNA Immunoprecipitation是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)总滩，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具纲堵，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)巡雨。這種技術(shù)運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)闰渔，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行測(cè)序分析。
RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類(lèi)似應(yīng)用铐望，但由于研究對(duì)象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物冈涧，RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對(duì)不能含有RNA酶正蛙，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等）督弓。RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱(chēng)為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化乒验。
- 什么是CLIP-seq
CLIP-seq,又稱(chēng)為HITS-CLIP愚隧，即紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測(cè)序(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing), 是一項(xiàng)在全基因組水平揭示RNA分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用的革命性技術(shù)。其主要原理是基于RNA分子與RNA結(jié)合蛋白在紫外照射下發(fā)生耦聯(lián)锻全，以RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀之后狂塘，回收其中的RNA片段，經(jīng)添加接頭鳄厌、RT-PCR等步驟荞胡，對(duì)這些分子進(jìn)行高通量測(cè)序，再經(jīng)生物信息學(xué)的分析和處理了嚎、總結(jié)泪漂，挖掘出其特定規(guī)律，從而深入揭示RNA結(jié)合蛋白與RNA分子的調(diào)控作用及其對(duì)生命的意義歪泳。
什么是metagenomic（宏基因組）：
Magenomics研究的對(duì)象是整個(gè)微生物群落萝勤。相對(duì)于傳統(tǒng)單個(gè)細(xì)菌研究來(lái)說(shuō)，它具有眾多優(yōu)勢(shì)呐伞，其中很重要的兩點(diǎn)：(1)微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中敌卓，它們的很多特性是基于整個(gè)群落環(huán)境及個(gè)體間的相互影響的，因此做Metagenomics研究比做單個(gè)個(gè)體的研究更能發(fā)現(xiàn)其特性荸哟；(2) Metagenomics研究無(wú)需分離單個(gè)細(xì)菌假哎，可以研究那些不能被實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的微生物瞬捕。
宏基因組是基因組學(xué)一個(gè)新興的科學(xué)研究方向。宏基因組學(xué)（又稱(chēng)元基因組學(xué)舵抹，環(huán)境基因組學(xué)肪虎，生態(tài)基因組學(xué)等），是研究直接從環(huán)境樣本中提取的基因組遺傳物質(zhì)的學(xué)科惧蛹。傳統(tǒng)的微生物研究依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)扇救，元基因組的興起填補(bǔ)了無(wú)法在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)的微生物研究的空白。過(guò)去幾年中香嗓，DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步以及測(cè)序通量和分析方法的改進(jìn)使得人們得以一窺這一未知的基因組科學(xué)領(lǐng)域迅腔。
10 .什么是SNP、SNV（單核苷酸位點(diǎn)變異）
單核苷酸多態(tài)性singlenucleotide polymorphism靠娱，SNP 或單核苷酸位點(diǎn)變異SNV沧烈。個(gè)體間基因組DNA序列同一位置單個(gè)核苷酸變異(替代、插入或缺失)所引起的多態(tài)性像云。不同物種锌雀、個(gè)體基因組DNA序列同一位置上的單個(gè)核苷酸存在差別的現(xiàn)象。有這種差別的基因座迅诬、DNA序列等可作為基因組作圖的標(biāo)志腋逆。人基因組上平均約每1000個(gè)核苷酸即可能出現(xiàn)1個(gè)單核苷酸多態(tài)性的變化，其中有些單核苷酸多態(tài)性可能與疾病有關(guān)侈贷，但可能大多數(shù)與疾病無(wú)關(guān)惩歉。單核苷酸多態(tài)性是研究人類(lèi)家族和動(dòng)植物品系遺傳變異的重要依據(jù)。在研究癌癥基因組變異時(shí)俏蛮，相對(duì)于正常組織撑蚌，癌癥中特異的單核苷酸變異是一種體細(xì)胞突變（somatic mutation），稱(chēng)做SNV嫁蛇。
- 什么是INDEL (基因組小片段插入）
基因組上小片段（>50bp）的插入或缺失锨并，形同SNP/SNV。
- 什么是copy number variation （CNV）：基因組拷貝數(shù)變異
基因組拷貝數(shù)變異是基因組變異的一種形式睬棚，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數(shù)量第煮。例如人類(lèi)正常染色體拷貝數(shù)是2，有些染色體區(qū)域拷貝數(shù)變成1或3抑党，這樣包警，該區(qū)域發(fā)生拷貝數(shù)缺失或增加，位于該區(qū)域內(nèi)的基因表達(dá)量也會(huì)受到影響底靠。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個(gè)區(qū)域害晦，則A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分別發(fā)生了C區(qū)域的擴(kuò)增及缺失，擴(kuò)增的位置可以是連續(xù)擴(kuò)增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴(kuò)增，如A-C-B-C-D壹瘟。
- 什么是structure variation （SV）：基因組結(jié)構(gòu)變異
染色體結(jié)構(gòu)變異是指在染色體上發(fā)生了大片段的變異鲫剿。主要包括染色體大片段的插入和缺失（引起CNV的變化），染色體內(nèi)部的某塊區(qū)域發(fā)生翻轉(zhuǎn)顛換稻轨，兩條染色體之間發(fā)生重組（inter-chromosome trans-location）等灵莲。一般SV的展示利用Circos 軟件。
15.什么是Segment duplication
一般稱(chēng)為SD區(qū)域殴俱，串聯(lián)重復(fù)是由序列相近的一些DNA片段串聯(lián)組成政冻。串聯(lián)重復(fù)在人類(lèi)基因多樣性的靈長(zhǎng)類(lèi)基因中發(fā)揮重要作用。在人類(lèi)染色體Y和22號(hào)染色體上线欲，有很大的SD序列明场。
- 什么是genotype and phenotype
既基因型與表型；一般指某些單核苷酸位點(diǎn)變異與表現(xiàn)形式間的關(guān)系李丰。
17.什么是soft-clipped reads
當(dāng)基因組發(fā)生某一段的缺失苦锨，或轉(zhuǎn)錄組的剪接，在測(cè)序過(guò)程中嫌套，橫跨缺失位點(diǎn)及剪接位點(diǎn)的reads回帖到基因組時(shí)逆屡，一條reads被切成兩段圾旨，匹配到不同的區(qū)域踱讨，這樣的reads叫做soft-clipped reads，這些reads對(duì)于鑒定染色體結(jié)構(gòu)變異及外源序列整合具有重要作用砍的。
- 什么是multi-hits reads
由于大部分測(cè)序得到的reads較短痹筛，一個(gè)reads能夠匹配到基因組多個(gè)位置，無(wú)法區(qū)分其真實(shí)來(lái)源的位置廓鞠。一些工具根據(jù)統(tǒng)計(jì)模型帚稠，如將這類(lèi)reads分配給reads較多的區(qū)域。
- 什么是Contig?
拼接軟件基于reads之間的overlap區(qū)床佳，拼接獲得的序列稱(chēng)為Contig（重疊群）滋早。 - 什么是Scaffold?
基因組de novo測(cè)序，通過(guò)reads拼接獲得Contigs后砌们，往往還需要構(gòu)建454 Paired-end庫(kù)或Illumina Mate-pair庫(kù)杆麸，以獲得一定大小片段（如3Kb、6Kb浪感、10Kb昔头、20Kb）兩端的序列∮笆蓿基于這些序列揭斧，可以確定一些Contig之間的順序關(guān)系，這些先后順序已知的Contigs組成Scaffold峻堰。
21.什么是Contig N50讹开？
Reads拼接后會(huì)獲得一些不同長(zhǎng)度的Contigs盅视。將所有的Contig長(zhǎng)度相加，能獲得一個(gè)Contig總長(zhǎng)度旦万。然后將所有的Contigs按照從長(zhǎng)到短進(jìn)行排序左冬，如獲得Contig 1，Contig 2纸型，Contig 3...………Contig 25拇砰。將Contig按照這個(gè)順序依次相加，當(dāng)相加的長(zhǎng)度達(dá)到Contig總長(zhǎng)度的一半時(shí)狰腌，最后一個(gè)加上的Contig長(zhǎng)度即為Contig N50除破。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig總長(zhǎng)度1/2時(shí)，Contig 4的長(zhǎng)度即為Contig N50琼腔。Contig N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個(gè)判斷標(biāo)準(zhǔn)瑰枫。值越大，contig越長(zhǎng)組裝效果越好丹莲，測(cè)序效率也就越好了.
給定一組具有其自身長(zhǎng)度的重疊群光坝，L50計(jì)數(shù)被定義為長(zhǎng)度總和占基因組大小一半的重疊群的最小數(shù)量。
21.1 什么是Scaffold N50甥材？
Scaffold N50與Contig N50的定義類(lèi)似盯另。Contigs拼接組裝獲得一些不同長(zhǎng)度的Scaffolds。將所有的Scaffold長(zhǎng)度相加洲赵，能獲得一個(gè)Scaffold總長(zhǎng)度鸳惯。然后將所有的Scaffolds按照從長(zhǎng)到短進(jìn)行排序，如獲得Scaffold 1叠萍，Scaffold 2芝发，Scaffold 3...………Scaffold 25。將Scaffold按照這個(gè)順序依次相加苛谷，當(dāng)相加的長(zhǎng)度達(dá)到Scaffold總長(zhǎng)度的一半時(shí)辅鲸，最后一個(gè)加上的Scaffold長(zhǎng)度即為Scaffold N50。舉例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold總長(zhǎng)度1/2時(shí)腹殿，Scaffold 5的長(zhǎng)度即為Scaffold N50独悴。Scaffold N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個(gè)判斷標(biāo)準(zhǔn)。
22.什么是測(cè)序深度和覆蓋度赫蛇？
測(cè)序深度是指測(cè)序得到的總堿基數(shù)與待測(cè)基因組大小的比值绵患。假設(shè)一個(gè)基因大小為2M，測(cè)序深度為10X悟耘，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M落蝙。覆蓋度是指測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在筏勒，測(cè)序最終拼接組裝獲得的序列往往無(wú)法覆蓋有所的區(qū)域移迫，這部分沒(méi)有獲得的區(qū)域就稱(chēng)為Gap。例如一個(gè)細(xì)菌基因組測(cè)序管行，覆蓋度是98%厨埋，那么還有2%的序列區(qū)域是沒(méi)有通過(guò)測(cè)序獲得的。
- 什么是RPKM捐顷、FPKM
RPKM,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads, is defined in thisway [Mortazavi etal., 2008]: 每1百萬(wàn)個(gè)map上的reads中map到外顯子的每1K個(gè)堿基上的reads個(gè)數(shù)荡陷。 假如有1百萬(wàn)個(gè)reads映射到了人的基因組上，那么具體到每個(gè)外顯子呢迅涮，有多少映射上了呢废赞，而外顯子的長(zhǎng)度不一，那么每1K個(gè)堿基上又有多少reads映射上了呢叮姑，這大概就是這個(gè)RPKM的直觀解釋唉地。
如果對(duì)應(yīng)特定基因的話(huà)，那么就是每1000000 mapped到該基因上的reads中每kb有多少是mapped到該基因上的exon的read Total exon reads:This is the number in the column with header Total exonreads in the row for the gene. This is the number of reads that have beenmapped to a region in which an exon is annotated for the gene or across theboundaries of two exons or an intron and an exon for an annotated transcript ofthe gene. For eukaryotes, exons and their internal relationships are defined byannotations of type mRNA.映射到外顯子上總的reads個(gè)數(shù)传透。這個(gè)是映射到某個(gè)區(qū)域上的reads個(gè)數(shù)耘沼，這個(gè)區(qū)域或者是已知注釋的基因或者跨兩個(gè)外顯子的邊界或者是某個(gè)基因已經(jīng)注釋的轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子、外顯子朱盐。對(duì)于真核生物來(lái)說(shuō)群嗤，外顯子和它們自己內(nèi)部的關(guān)系由某類(lèi)型的mRNA來(lái)注釋。
Exonlength: This is the number in the column with the header Exon length inthe row for the gene, divided by 1000. This is calculated as the sum of thelengths of all exons annotated for the gene. Each exon is included only once inthis sum, even if it is present in more annotated transcripts for the gene.Partly overlapping exons will count with their full length, even though theyshare the same region.外顯子的長(zhǎng)度托享。計(jì)算時(shí)骚烧，計(jì)算所有某個(gè)基因已注釋的所有外顯子長(zhǎng)度的總和。即使某個(gè)基因以多種注釋的轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)闰围，這個(gè)外顯子在求和時(shí)只被包含一次。即使部分重疊的外顯子共享相同的區(qū)域既峡，重疊的外顯子以其總長(zhǎng)來(lái)計(jì)算羡榴。 Mapped reads: The sum of all the numbers in the column with header Totalgene reads. The Total gene reads for a gene is the total number ofreads that after mapping have been mapped to the region of the gene. Thus thisincludes all the reads uniquely mapped to the region of the gene as well asthose of the reads which match in more places (below the limit set in thedialog in figure18.110) that have been allocated tothis gene's region. A gene's region is that comprised of the flanking regions(if it was specified in figure 18.110), the exons, the introns andacross exon-exon boundaries of all transcripts annotated for the gene. Thus,the sum of the total gene reads numbers is the number of mapped reads for thesample (you can find the number in the RNA-Seq report).map的reads總和。映射到某個(gè)基因上的所有reads總數(shù)运敢。因此這包含所有的唯一映射到這個(gè)區(qū)域上的reads校仑。
舉例：比如對(duì)應(yīng)到該基因的read有1000個(gè)，總reads個(gè)數(shù)有100萬(wàn)传惠，而該基因的外顯子總長(zhǎng)為5kb迄沫，那么它的RPKM為：109*1000(reads個(gè)數(shù))/106(總reads個(gè)數(shù))5000(外顯子長(zhǎng)度)=200或者：1000(reads個(gè)數(shù))/1(百萬(wàn))5(K)=200這個(gè)值反映基因的表達(dá)水平。
FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped). FPKM與RPKM計(jì)算方法基本一致卦方。不同點(diǎn)就是FPKM計(jì)算的是fragments羊瘩，而RPKM計(jì)算的是reads。Fragment比read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣尘吗，可以是pair-end的一個(gè)fragment逝她，也可以是一個(gè)read。
什么是轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)
用測(cè)序的數(shù)據(jù)組裝成轉(zhuǎn)錄本睬捶。有兩種組裝方式：1黔宛，de-novo構(gòu)建； 2擒贸，有參考基因組重構(gòu)臀晃。其中de-novo組裝是指在不依賴(lài)參考基因組的情況下，將有overlap的reads連接成一個(gè)更長(zhǎng)的序列介劫，經(jīng)過(guò)不斷的延伸积仗，拼成一個(gè)個(gè)的contig及scaffold。常用工具包括velvet蜕猫，trans-ABYSS寂曹，Trinity等。有參考基因組重構(gòu)回右，是指先將read貼回到基因組上隆圆，然后在基因組通過(guò)reads覆蓋度，junction位點(diǎn)的信息等得到轉(zhuǎn)錄本翔烁，常用工具包括scripture渺氧、cufflinks。
什么是genefusion
將基因組位置不同的兩個(gè)基因中的一部分或全部整合到一起蹬屹，形成新的基因侣背，稱(chēng)作融合基因，或嵌合體基因慨默。該基因有可能翻譯出融合或嵌合體蛋白贩耐。
什么是表達(dá)譜
基因表達(dá)譜(geneexpression profile)：指通過(guò)構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫(kù),大規(guī)模cDNA測(cè)序,收集cDNA序列片段、定性厦取、定量分析其mRNA群體組成,從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類(lèi)和豐度信息,這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱(chēng)為基因表達(dá)譜
什么是功能基因組學(xué)
功能基因組學(xué)（Functuionalgenomics）又往往被稱(chēng)為后基因組學(xué)（Postgenomics）潮太，它利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段虾攻，通過(guò)在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能铡买，使得生物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白質(zhì)得研究轉(zhuǎn)向多個(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。這是在基因組靜態(tài)的堿基序列弄清楚之后轉(zhuǎn)入對(duì)基因組動(dòng)態(tài)的生物學(xué)功能學(xué)研究霎箍。研究?jī)?nèi)容包括基因功能發(fā)現(xiàn)奇钞、基因表達(dá)分析及突變檢測(cè)∑担基因的功能包括：生物學(xué)功能景埃，如作為蛋白質(zhì)激酶對(duì)特異蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾媒至；細(xì)胞學(xué)功能，如參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞途徑纠亚；發(fā)育上功能塘慕，如參與形態(tài)建成等。采用的手段包括經(jīng)典的減法雜交蒂胞，差示篩選图呢，cDNA代表差異分析以及mRNA差異顯示等，但這些技術(shù)不能對(duì)基因進(jìn)行全面系統(tǒng)的
分析骗随，新的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生蛤织，包括基因表達(dá)的系統(tǒng)分析（serial analysis of gene expression,SAGE），cDNA微陣列（cDNA microarray）鸿染，DNA 芯片（DNA chip）和序列標(biāo)志片段顯示（sequence tagged fragmentsdisplay指蚜。
什么是比較基因組學(xué)
比較基因組學(xué)(ComparativeGenomics)是基于基因組圖譜和測(cè)序基礎(chǔ)上，對(duì)已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較涨椒，來(lái)了解基因的功能摊鸡、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式生物基因組與人類(lèi)基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性蚕冬，克隆人類(lèi)疾病基因免猾，揭示基因功能和疾病分子機(jī)制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系囤热，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)猎提。
什么是表觀遺傳學(xué)
表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)了可遺傳的變化的一門(mén)遺傳學(xué)分支學(xué)科旁蔼。表觀遺傳的現(xiàn)象很多锨苏，已知的有DNA甲基化（DNAmethylation），基因組印記（genomicimpriting）棺聊，母體效應(yīng)（maternaleffects）伞租，基因沉默（genesilencing），核仁顯性躺屁，休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯（RNA editing）等肯夏。
什么是計(jì)算生物學(xué)
計(jì)算生物學(xué)是指開(kāi)發(fā)和應(yīng)用數(shù)據(jù)分析及理論的方法、數(shù)學(xué)建模犀暑、計(jì)算機(jī)仿真技術(shù)等。當(dāng)前烁兰，生物學(xué)數(shù)據(jù)量和復(fù)雜性不斷增長(zhǎng)耐亏，每14個(gè)月基因研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)就會(huì)翻一番，單單依靠觀察和實(shí)驗(yàn)已難以應(yīng)付沪斟。因此广辰，必須依靠大規(guī)模計(jì)算模擬技術(shù)暇矫，從海量信息中提取最有用的數(shù)據(jù)。
什么是基因組印記
基因組印記(又稱(chēng)遺傳印記)是指基因根據(jù)親代的不同而有不同的表達(dá)择吊。印記基因的存在能導(dǎo)致細(xì)胞中兩個(gè)等位基因的一個(gè)表達(dá)而另一個(gè)不表達(dá)李根。基因組印記是一正常過(guò)程几睛，此現(xiàn)象在一些低等動(dòng)物和植物中已發(fā)現(xiàn)多年房轿。印記的基因只占人類(lèi)基因組中的少數(shù)，可能不超過(guò)5%所森，但在胎兒的生長(zhǎng)和行為發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用囱持。基因組印記病主要表現(xiàn)為過(guò)度生長(zhǎng)焕济、生長(zhǎng)遲緩纷妆、智力障礙、行為異常晴弃。目前在腫瘤的研究中認(rèn)為印記缺失是引起腫瘤最常見(jiàn)的遺傳學(xué)因素之一掩幢。
什么是基因組學(xué)
基因組學(xué)（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門(mén)學(xué)問(wèn)上鞠。用于概括涉及基因作圖际邻、測(cè)序和整個(gè)基因組功能分析的遺傳學(xué)分支。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用旗国，試圖解決生物枯怖，醫(yī)學(xué)，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問(wèn)題能曾。
什么是DNA甲基化
DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下度硝，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。正常情況下寿冕，人類(lèi)基因組“垃圾”序列的CpG二核苷酸相對(duì)稀少蕊程，并且總是處于甲基化狀態(tài)，與之相反驼唱，人類(lèi)基因組中大小為100—1000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG島則總是處于未甲基化狀態(tài)藻茂，并且與56％的人類(lèi)基因組編碼基因相關(guān)。人類(lèi)基因組序列草圖分析結(jié)果表明玫恳，人類(lèi)基因組CpG島約為28890個(gè)辨赐，大部分染色體每1 Mb就有5—15個(gè)CpG島，平均值為每Mb含10．5個(gè)CpG島京办，CpG島的數(shù)目與基因密度有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系[9]掀序。由于DNA甲基化與人類(lèi)發(fā)育和腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活問(wèn)題惭婿，DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容不恭。
什么是基因組注釋?zhuān)?/p>
基因組注釋(Genomeannotation) 是利用生物信息學(xué)方法和工具,對(duì)基因組所有基因的生物學(xué)功能進(jìn)行高通量注釋,是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)叶雹。基因組注釋的研究?jī)?nèi)容包括基因識(shí)別和基因功能注釋兩個(gè)方面换吧≌刍蓿基因識(shí)別的核心是確定全基因組序列中所有基因的確切位置。
什么是Q30沾瓦？
Q30是指一個(gè)堿基的識(shí)別可靠性等于99.9%满着，或者說(shuō)出錯(cuò)可能性是0.1%。Q20則是指堿基識(shí)別的可靠性等于99%暴拄。
Q30數(shù)據(jù)量是指一批數(shù)據(jù)中漓滔，質(zhì)量高于等于Q30的數(shù)據(jù)的量的總和。
測(cè)序數(shù)據(jù)的PF data/PF reads是什么意思乖篷？
PF是pass filter的意思响驴。也就是質(zhì)量合格的意思。Illumina的測(cè)儀序會(huì)自動(dòng)地對(duì)一個(gè)read(序列)的質(zhì)量可靠性進(jìn)行打分撕蔼。
對(duì)于前25個(gè)堿基中的是否有兩個(gè)堿基的識(shí)別可靠性低于0.6豁鲤，是PF的判斷標(biāo)準(zhǔn)。這句話(huà)翻譯成較容易理解的話(huà): 就是前25個(gè)堿基中鲸沮，如果低質(zhì)量的數(shù)據(jù)有2個(gè)或更多琳骡，則這條read被判定為不合格，PF就不通過(guò)讼溺。反之楣号，則質(zhì)檢通過(guò)。
PF是國(guó)際公認(rèn)的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)怒坯。
你們給的數(shù)據(jù)是什么質(zhì)量的炫狱？
對(duì)于哺乳動(dòng)物基因組重測(cè)序、外顯子測(cè)序剔猿，我們保證數(shù)據(jù)質(zhì)量是Q30的比例高于80%视译。對(duì)于mRNA測(cè)序，smRNA測(cè)序归敬，我們保證對(duì)照Lane的數(shù)據(jù)質(zhì)是Q30的比例高于80%酷含。
一般情況下:
哺乳動(dòng)物基因組重測(cè)序、外顯子測(cè)序汪茧，GC比例在40%左右椅亚，Q30的比例是80~95%
RNA-seq，GC比例在50%左右舱污，Q30的比例是~80%什往。如果Poly(A)特別多的情況下，Q30會(huì)更低一些
SmRNA-seq慌闭，因?yàn)橛性S多的read讀通之后别威，只剩下一串的A，質(zhì)量會(huì)更低驴剔，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果%Q30在70~75%
測(cè)序中的Duplication是什么省古，如何避免，一般會(huì)有多少Duplication?
所謂Duplication是指起始與終止位置完全一致的片段丧失。
引起Duplication的主要原因是因?yàn)樵跍y(cè)序中有PCR過(guò)程豺妓，來(lái)源于同一個(gè)DNA片段PCR的產(chǎn)物被重復(fù)測(cè)序，就會(huì)是Duplication布讹。次要原因是正巧兩個(gè)片段的頭和尾的位置完全一致琳拭。
一般通過(guò)控制PCR的循環(huán)數(shù)來(lái)控制Duplication。我們一般控制PCR的循環(huán)次數(shù)在10~12個(gè)循環(huán)描验。
在藥明康德外顯子測(cè)序中白嘁，如果用illumina的捕獲試劑盒Duplication的比例約為10%，如果用Nimblegen的捕獲試劑盒Duplication的比例波動(dòng)較大膘流，在5~50%范圍 絮缅，平均為30%。
在RNA-seq中呼股，Duplication的比例約為40%耕魄。RNA-seq中，因?yàn)楦哓S度的mRNA集中在幾個(gè)基因上彭谁，集中度很高吸奴，所以Duplication的比例也就高。
測(cè)序的插入片段一般是多長(zhǎng)缠局？
測(cè)序的插入片段一般是100bp到600bp.
因?yàn)镠iseq測(cè)序過(guò)程中有一個(gè)橋式PCR的過(guò)程则奥。如果插入片段過(guò)長(zhǎng)，測(cè)橋式PCR產(chǎn)生的Cluster就會(huì)太大甩鳄，而且光強(qiáng)也會(huì)減弱逞度。所以插入片段的長(zhǎng)度是有限制的。
PhiX文庫(kù)有什么用妙啃？
PhiX文庫(kù)是一種用病毒基因組做的文庫(kù)档泽。其基因序列已精確知曉，GC比例約為40%揖赴，與人類(lèi)馆匿、哺乳類(lèi)的基因組的GC比例接近。其基因序列又與人類(lèi)的基因序列相去甚遠(yuǎn)燥滑，在與哺乳類(lèi)基因組一些測(cè)序時(shí)渐北，可以輕松地通過(guò)基因序列比對(duì)而將之去除。
在測(cè)四種堿基不平衡（A铭拧、G赃蛛、C恃锉、T四種堿基的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離25%）的樣本時(shí)，可以加入大量的PhiX文庫(kù)呕臂，以部分抵消樣本的不平衡性破托。例如ChIPed DNA測(cè)序，或者亞硫酸氫鹽處理過(guò)的DNA文庫(kù)歧蒋，或者擴(kuò)增子測(cè)序（PCR樣測(cè)序）土砂，都可以加入PhiX，以部分彌補(bǔ)堿基不平衡性谜洽。
也可以少量地加入樣本萝映，以作為control library來(lái)驗(yàn)證測(cè)序質(zhì)量。
