hello袒炉，大家好旁理，今天禮拜天，天津霧霾嚴(yán)重我磁，呆在家里學(xué)習(xí)一下吧韧拒。今天給大家分享的是空間轉(zhuǎn)錄組的空間細(xì)胞密度的分析，這個(gè)分析非常重要十性，下面是一張展示圖叛溢。

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大家應(yīng)該都有基本的常識(shí)，那就是組織是一個(gè)有序的細(xì)胞結(jié)構(gòu)劲适，細(xì)胞不會(huì)隨機(jī)出現(xiàn)在組織的各個(gè)區(qū)域楷掉，而是嚴(yán)格按照空間位置進(jìn)行分布，當(dāng)然了霞势，受到了周圍細(xì)胞環(huán)境的很多影響烹植，那么這個(gè)分析體現(xiàn)的就是細(xì)胞類型空間分布的有序性，那么疾病樣本細(xì)胞類型的空間分布愕贡，則體現(xiàn)了疾病對(duì)細(xì)胞空間排布的影響草雕，文章在Spatially-resolved transcriptomics analyses of invasive fronts in solid tumors,很好的方法，今天我們就來(lái)分享這個(gè)內(nèi)容固以。

Abstract

實(shí)體瘤是復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)墩虹，異質(zhì)性是克服腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要挑戰(zhàn)。揭示腫瘤中細(xì)胞類型和功能狀態(tài)的空間異質(zhì)性對(duì)于開發(fā)有效的治療方法至關(guān)重要憨琳，尤其是在腫瘤的侵襲前沿诫钓，即腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和侵襲最活躍的區(qū)域。作者首先使用具有納米級(jí)分辨率的 Spatial 增強(qiáng)分辨率組學(xué)測(cè)序（Stereo-seq篙螟，空間技術(shù)分辨率優(yōu)于10X）來(lái)表征肝內(nèi)膽管癌（ICC）的腫瘤微環(huán)境菌湃。在以腫瘤邊界兩側(cè)為中心的 500μm 寬區(qū)域（即腫瘤的侵襲前沿）中發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特免疫細(xì)胞的富集、抑制性免疫微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞的代謝重編程遍略。此外惧所，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞的損傷狀態(tài)在侵襲性前沿中過(guò)度表達(dá)血清淀粉樣蛋白 A（SAA），募集巨噬細(xì)胞以促進(jìn)進(jìn)一步的腫瘤侵襲绪杏，從而導(dǎo)致更差的預(yù)后下愈。還在肝細(xì)胞癌和其他肝轉(zhuǎn)移癌中證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。這樣的分析突出了高分辨率空間解析轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的顯著潛力寞忿，為全面剖析腫瘤生態(tài)系統(tǒng)和指導(dǎo)實(shí)體瘤新治療策略的開發(fā)提供了有意義的生物學(xué)見解驰唬。

Introduction

實(shí)體瘤是復(fù)雜的器官樣結(jié)構(gòu)顶岸，往往會(huì)擴(kuò)散到附近的組織并通過(guò)淋巴系統(tǒng)和血流轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的器官腔彰。 有證據(jù)表明叫编，實(shí)體腫瘤是具有高度異質(zhì)性的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，涉及癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等各種細(xì)胞類型以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分相互作用的區(qū)域霹抛。 具體來(lái)說(shuō)搓逾，腫瘤浸潤(rùn)邊緣區(qū)域，腫瘤細(xì)胞侵入paranormal tissues并遇到各種各樣的基質(zhì)細(xì)胞和 ECM 成分杯拐，這是腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和侵襲最活躍的區(qū)域霞篡。 全面了解該領(lǐng)域的成分及其空間異質(zhì)性，以及腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境 (TME) 之間的相互作用端逼，將有助于了解腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移朗兵、評(píng)估預(yù)后并探索實(shí)體瘤的新治療方法。

單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 是在單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞成分及其相互作用的強(qiáng)大工具顶滩，已被用于表征多種類型實(shí)體瘤的 TME余掖。然而，空間信息的缺乏是研究局部環(huán)境礁鲁、特定細(xì)胞間相互作用和腫瘤進(jìn)展之間的相關(guān)性的主要障礙，尤其是在腫瘤浸潤(rùn)邊緣區(qū)域。此外杂曲，由于先前研究中缺乏多區(qū)域采樣昼钻，單細(xì)胞分辨率的腫瘤內(nèi)空間異質(zhì)性仍然很差。最近開發(fā)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (ST) 方法使用空間條形碼寡聚脫氧胸苷微陣列促進(jìn)了整個(gè)組織切片上轉(zhuǎn)錄物的無(wú)偏映射析二。然而粉洼，在以前的研究中應(yīng)用的大多數(shù) ST 方法的分辨率都很低，可以識(shí)別與數(shù)十個(gè)細(xì)胞而不是單個(gè)細(xì)胞混合的斑點(diǎn)叶摄。最近漆改，將 DNA 納米球 (DNB) 圖案化陣列芯片和原位 RNA 捕獲相結(jié)合，開發(fā)了具有納米級(jí)分辨率 (220 nm × 220 nm/spot) 和可擴(kuò)展區(qū)域 (10 mm × 10 毫米）准谚，每個(gè)單元捕獲數(shù)百個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)挫剑。因此，立體 seq 可以潛在地彌合 scRNA seq 和 ST 分析之間的差距柱衔，它們一起可以更好地表征整個(gè)腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)研究樊破。因此，Stereo-seq 從腫瘤多區(qū)域組織中產(chǎn)生的單細(xì)胞和高維空間數(shù)據(jù)的整合將促進(jìn)全面和無(wú)偏見的組織分析唆铐，以識(shí)別實(shí)體瘤中的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和 TME 細(xì)胞通訊哲戚，特別是對(duì)于腫瘤浸潤(rùn)邊緣區(qū)域（空間技術(shù)倒是不錯(cuò)，分析方法都是通用的）艾岂。

肝癌是全球最惡性的實(shí)體瘤之一顺少，而肝內(nèi)膽管癌 (ICC) 是第二大最常見的原發(fā)性肝癌，在過(guò)去幾十年中全球發(fā)病率不斷增加。 然而脆炎，大多數(shù)患者 (> 70%) 在由于局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病不能手術(shù)治療的診斷時(shí)間梅猿。在這項(xiàng)研究中，作者使用具有高分辨率和厘米級(jí)視野的立體序列來(lái)表征腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性和異質(zhì)性秒裕，以及它們?cè)?ICC 中的細(xì)胞相互作用袱蚓，通過(guò)分析四個(gè)區(qū)域位點(diǎn)，包括腫瘤組織 (T) 几蜻、邊緣區(qū)域 (B)喇潘、鄰近正常組織 (P) 和正常或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié) (LN)梭稚。通過(guò)將 ST 數(shù)據(jù)與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)整合并使用生物信息學(xué)分析颖低，分析方法確定了腫瘤侵襲前沿的高度細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，其中腫瘤細(xì)胞侵入paranormal tissues弧烤。研究發(fā)現(xiàn)免疫逃逸能力增加枫甲，腫瘤細(xì)胞脂肪代謝增加，免疫細(xì)胞積累增加扼褪，尤其是在距腫瘤正常邊界 250 μm 以內(nèi)的區(qū)域想幻。此外，發(fā)現(xiàn)靠近侵襲前沿的肝細(xì)胞中 SAA1 和 SAA2 的表達(dá)增加话浇，這與巨噬細(xì)胞局部募集的增加有關(guān)脏毯，并與 ICC 患者的預(yù)后較差相關(guān)。此外幔崖，在其他四個(gè)額外隊(duì)列中證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝癌中食店。作者的研究強(qiáng)調(diào)了高分辨率、空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法在為實(shí)體瘤新治療策略的開發(fā)提供有意義的生物學(xué)見解方面的重要潛力赏寇。

Results

(1)Spatial resolved transcriptomics profiles of multi-regional tissues from ICC patients

為了表征 ICC 的空間轉(zhuǎn)錄景觀吉嫩，使用高分辨率（220 nm × 220 nm/點(diǎn)）和可擴(kuò)展的立體序列處理來(lái)自瘤內(nèi)組織、鄰近正常組織嗅定、邊緣區(qū)域和正匙悦洌或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的新鮮冷凍組織 區(qū)域（10 mm × 10 mm）（下圖）。 從病理診斷為 ICC（LC0渠退、LC1忙迁、LC2、LC4碎乃、LC5姊扔、LC6、LC7）的 8 名患者的 27 個(gè)樣本（T梅誓，6恰梢；B佛南，8；P嵌言，7嗅回；LN，6）中生成了 50 張切片的立體序列數(shù)據(jù) , 和 LC8) 使用相鄰載玻片的蘇木精和伊紅 (H&E) 染色呀页。

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• 注：Schematic diagram of the spatial transcriptomics acquisition workflow based on 27 samples (T, 6; B, 8; P, 7; LN, 6) from eight patients with ICC with further data analysis. Liver cancers* include ICC (n = 10), HCC (n = 5), liver metastasis of colorectal cancer (n = 3), pancreatic cancer (n = 2), and lung cancer (n = 1).

. In the Discovery Cohort妈拌，從患者 LC5（604 個(gè)細(xì)胞）邊緣區(qū)域組織生成的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)與最近發(fā)布的 ICC scRNA-seq 數(shù)據(jù)集相結(jié)合拥坛，以建立細(xì)胞類型的參考表達(dá)圖譜蓬蝶，以描繪每個(gè)組織切片中細(xì)胞類型群體的空間斷層掃描 . 結(jié)果，使用 Seurat 將 29,793 個(gè)合格細(xì)胞聚集成 11 個(gè)主要細(xì)胞類型猜惋，包括 T 細(xì)胞 (CD3D)丸氛、自然殺傷細(xì)胞 (NKs) (KLRF1)、B 細(xì)胞 (MS4A1)著摔、漿細(xì)胞 (MZB1)缓窜、巨噬細(xì)胞 (CD163/ CD14)、樹突狀細(xì)胞 (DC) (CD1C)谍咆、膽管細(xì)胞/膽管癌細(xì)胞 (KRT19/EPCAM)禾锤、肝細(xì)胞 (ALB)、內(nèi)皮細(xì)胞 (CDH5/ENG) 和成纖維細(xì)胞 (ACTA2)摹察。

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對(duì)于 ST恩掷，每個(gè) DNB 或 bin (220 nm × 220 nm) 檢測(cè)到 2~90 個(gè)（中位數(shù)為 8 個(gè)）轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)肝細(xì)胞（直徑為 25~30 μm）大約有 2,500 個(gè)（50 × 50）個(gè) bin 每個(gè)膽管癌細(xì)胞（直徑為 15 μm）約 900 (30 × 30) 個(gè) bin

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• 注：Spatial transcriptomics (ST) spots were mapped to H&E staining of adjacent slides of LC4-T, and the raw spatial expression matrix with each bin/spot was convoluted into pseudo5 spots with 2.5 μm squares (5 × 5 bins/spot) to show unique molecular identifiers (UMI) counts of the cell nucleus (with a diameter of 15 μm) of a tumor cell by ST spots.

為了使用這些reference signatures進(jìn)行空間細(xì)胞類型注釋供嚎，原始空間表達(dá)矩陣被轉(zhuǎn)換為 25 μm 平方大谢颇铩（50 × 50 bins/spot）的SPot，大約代表一個(gè)細(xì)胞克滴，平均 718 個(gè)基因和 1,644 每個(gè)spot檢測(cè)到的 mRNA 分子逼争。

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• 注：Violin plots showing UMI counts (d) and numbers of genes (e) captured in 50 ST slides of 27 samples (T, n = 6; P, n = 7; B, n = 8; LN, n =6) from eight patients with ICC.

ST 載玻片中每個(gè)spot的細(xì)胞成分（50 × 50 bins/spot, 25 μm squares）由 SPOTlight （關(guān)于SPOTlight，大家可以參考文章SPOTlight助力單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析）使用 scRNA-seq 作為參考確定劝赔，然后在空間點(diǎn)中注釋 11 種主要細(xì)胞類型誓焦。

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將每個(gè)spot分配給顯示最高概率比例的特定細(xì)胞類型，因?yàn)榈谝粋€(gè)概率遠(yuǎn)高于第二個(gè)概率(這個(gè)注釋在空間分析中很常見)着帽。

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經(jīng)典細(xì)胞類型標(biāo)記基因在定義的細(xì)胞簇中明顯更高的表達(dá)支持了 ST 點(diǎn)細(xì)胞類型注釋的合理性

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（2）The heterogeneities of cell and ECM compositions as well as spatial distributions in multi-regions of ICC

ICC 患者的四個(gè)區(qū)域位點(diǎn)（T罩阵、P、B 和 LN）的細(xì)胞組成和空間分布高度異質(zhì)启摄。 不同區(qū)域在空間上具有不同的組織結(jié)構(gòu)稿壁，由不同的主要細(xì)胞成分組成。 在腫瘤組織中歉备，成纖維細(xì)胞傅是、巨噬細(xì)胞和 B 細(xì)胞是最豐富的細(xì)胞，幾乎占所有細(xì)胞成分的一半

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• 注： (a) Pie graphs showing the percentages of major cell types in all cell components at four regional sites (T, n = 6; P, n = 7; B, n = 8; LN, n = 6) of eight patients with ICC. (b) H&E staining and heat maps of the spatial distributions of fibroblasts, T/NK cells, and B cells in four regional sites.

具體而言，在腫瘤組織中檢測(cè)到的成纖維細(xì)胞百分比高于其他三個(gè)區(qū)域喧笔，這意味著 ICC 腫瘤組織的高度促纖維化特性帽驯。 正如預(yù)期的那樣，肝細(xì)胞是鄰近正常組織中的主要細(xì)胞類型书闸，其次是膽管細(xì)胞和 B 細(xì)胞尼变。對(duì)于邊緣區(qū)域，除了腫瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞外浆劲，成纖維細(xì)胞嫌术、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是最豐富的細(xì)胞類型。在LNs中牌借，B細(xì)胞度气、T/NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是最豐富的免疫細(xì)胞類型，B細(xì)胞廣泛分布在整個(gè)LN組織中膨报。 與正常 LN 不同磷籍，在 LC4-LN（有 LN 轉(zhuǎn)移）中，腫瘤細(xì)胞覆蓋了玻片中幾乎一半的 LN 區(qū)域现柠，而 B 細(xì)胞覆蓋了其余的正常區(qū)域院领。此外，在 T够吩、P 和 B 中也檢測(cè)到由非淋巴組織中 DC比然、T/NK 和 B 細(xì)胞共聚集產(chǎn)生的典型三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu) (TLS)，這通過(guò) H&E 染色進(jìn)一步證實(shí)

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• 注：The three-dimensional diagram and corresponding heat maps showing tertiary lymphoid structures (TLS) where DCs,T/NK, and B cells co-aggregated

  
  
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• 注：H&E staining and corresponding heat maps illustrating the location of tertiary lymphoid structures (TLS) featured with co-aggregation of B cells, T/NK cells, and DCs in LC6-B

此外废恋，幾種細(xì)胞類型在具有高空間異質(zhì)性的不同組織區(qū)域中表現(xiàn)出不同的富集谈秫。Most of the fibroblasts in tumor tissues showed matrix cancer-associated fibroblast (mCAF) signatures with increased expressions of ECM related genes (LUM, DCN, and COL3A1), while more antigen presenting cancer-associated fibroblasts (AP-CAF) and inflammatory cancer-associated fibroblasts (iCAF) were found in adjacent normal tissues。

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與鄰近的正常組織相比鱼鼓，腫瘤組織和邊緣區(qū)域中耗盡和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞之間的比率更高拟烫，表明 T 細(xì)胞的抑制狀態(tài)和隨后的 TME 中的癌癥免疫逃避。 將 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞細(xì)分為不同的亞群后迄本，在 LN 中觀察到的初始 T 和初始 B 細(xì)胞的百分比顯著增加硕淑，并且空間初始 B 細(xì)胞主要被漿 B 細(xì)胞包圍。在空間細(xì)胞類型圖中也鑒定了以被 B 細(xì)胞包圍的 DC 聚集為特征的Germinal centers

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• 注：The H&E staining, cell type spatial maps and corresponding IF illustrating the structure of the lymph node including the germinal center and the distribution of subpopulations of main cell types in lymph nodes (LC7-LN).

除了成纖維細(xì)胞cluster和免疫細(xì)胞在不同部位的空間異質(zhì)性分布外嘉赎，腫瘤細(xì)胞在不同瘤內(nèi)區(qū)域也表現(xiàn)出明顯的癌癥特征富集置媳，表明不同組織之間以及腫瘤組織內(nèi)的空間異質(zhì)性。

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TME 由腫瘤細(xì)胞和 ECM 之間通過(guò)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用和 ECM 重塑的雙向通信動(dòng)態(tài)塑造公条。 為了全面了解四個(gè)regional sites之間的 ECM 重構(gòu)和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用拇囊，啟動(dòng)了區(qū)域分割（1000 × 1000 bins 或 500 μm × 500 μm 每個(gè)點(diǎn)）以obtain approximately 400 spots of local bulk RNA profiles on each ST slide。 根據(jù) ECM 相關(guān)基因和趨化因子/細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄特征靶橱，從 48 張載玻片中捕獲的總共 20,400 個(gè) ST spot被分成 10 個(gè)模式寥袭。

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• 注：Heat map showing the clustering of ECM components according to differentially-expressed genes in segmented spots. Different patterns, tissues and patients are labeled by colors

從不同患者收集的同一部位的分段 ST spot通過(guò)uniform manifold approximation and projection (UMAP) 進(jìn)行可視化路捧，表明特定部位的 ECM 和趨化因子/細(xì)胞因子富集的微環(huán)境。在腫瘤組織中传黄，鑒定出HIF1A杰扫、CXCL6、IL18和MMP14等幾個(gè)高表達(dá)基因膘掰≌滦眨基于 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，MMP14 可通過(guò)降解基質(zhì)屏障和增強(qiáng)血管生成促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲识埋，被確定為腫瘤中最富集的 MMP凡伊，主要由成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌。此外惭聂，IL18 編碼促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的促炎細(xì)胞因子窗声，在腫瘤中含量最高相恃，主要由 DC辜纲、巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。在鄰近的正常組織中拦耐，與其他三個(gè)區(qū)域相比耕腾，包括 IL6R、IL1RAP 和 CXCL2 在內(nèi)的 ECM 成分高表達(dá)杀糯。 發(fā)現(xiàn)趨化因子或細(xì)胞因子簇（包括 CXCL8 和 CXCL1）的表達(dá)主要在邊緣區(qū)域富集扫俺，表明這些區(qū)域有強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。具體而言固翰，根據(jù) scRNA-seq 數(shù)據(jù)狼纬，編碼炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)的 CXCL8 主要由髓細(xì)胞分泌，包括巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞骂际。此外疗琉，與其他三個(gè)區(qū)域相比，CCL19/CCL21 及其受體 CCR7 在 LN 中的表達(dá)最為豐富歉铝，支持 CCL19/CCL21-CCR7 軸在指導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢和組織免疫和炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用盈简。此外，共刺激分子相關(guān)基因（CD28 和 CD80）的表達(dá)太示，它們是 T 細(xì)胞擴(kuò)增柠贤、存活和激活中最重要的分子，以及抑制分子相關(guān)基因（CTLA4类缤、BTLA臼勉、TIGIT、CD96餐弱、CD274 和 LGALS9 ) 在 T 細(xì)胞失活中至關(guān)重要宴霸，都在 LN 中特異性積累镜盯，表明雙向和平衡的免疫調(diào)節(jié)。

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• 注：H&E staining and heat maps of the spatial expression of inhibitory related genes BTLA, TIGIT, CTLA4, CD96, and CD274 in corresponding slide of LC5-LN.

（3）Enrichment of distinctive immune cells, the suppressive immune microenvironment, and metabolic reprogramming of tumor cells at invasive fronts

邊界線周圍的區(qū)域猖败，腫瘤細(xì)胞侵入超自然組織并與各種基質(zhì)細(xì)胞和 ECM 成分直接接觸速缆，已被認(rèn)為是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)和實(shí)體瘤最重要的區(qū)域，用于了解腫瘤進(jìn)展恩闻、免疫監(jiān)視 , 侵犯正常組織艺糜。四個(gè)不同區(qū)域的細(xì)胞和 ECM 成分的轉(zhuǎn)錄景觀也表明邊緣區(qū)域炎癥趨化因子/細(xì)胞因子的富集。研究觀察到巨噬細(xì)胞和 NK/T 細(xì)胞在邊界附近的積累幢尚，其中腫瘤細(xì)胞與相鄰的肝組織直接接觸破停，包括復(fù)雜的邊界微環(huán)境

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因此，為了進(jìn)一步表征侵襲性腫瘤細(xì)胞前沿的微環(huán)境尉剩，使用六層構(gòu)建了一個(gè)精確分割侵襲性腫瘤前沿周圍邊緣區(qū)域的模型（每層是一個(gè)距離橫向邊界線寬度為 250 μm 的區(qū)域）真慢。 方向，每層沿邊界線的軸向等分100等份）為雙側(cè)理茎。

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• 注：Schematic diagram of the identification of borderlines and segmentation of margin areas to characterize the spatial heterogeneity of margin areas. Three layers with a width of 250 μm were drawn from the normal side and from the tumor side of the borderline, respectively,and each layer was divided into 100 subregions along the borderline

首先根據(jù)ST載玻片中腫瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞的空間分布擬合邊緣區(qū)域的侵襲邊界線黑界，并通過(guò)相應(yīng)相鄰載玻片的H＆E染色證實(shí)，然后分析正常六層細(xì)胞成分的分?jǐn)?shù)和特征和邊緣的腫瘤slides皂林。發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞從腫瘤側(cè)向邊界周圍區(qū)域募集朗鸠，其軸向異質(zhì)性高，尤其在靠近邊界的 250 μm 寬區(qū)域富集础倍，revealing the high heterogeneities of immune cell distributions around the borderline in both the axial and lateral directions

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此外烛占，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在腫瘤側(cè)富集，但在腫瘤側(cè)不同層之間的分?jǐn)?shù)沒(méi)有明顯變化沟启。在免疫細(xì)胞中忆家，巨噬細(xì)胞、DC德迹、T/NK 細(xì)胞和 B 細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在靠近腫瘤側(cè)邊界的區(qū)域更豐富芽卿。Moreover, the abundance of macrophages was found to be increased from the third layer (750-500 μm) and the second layer (500-250 μm) to the first layer (250-0 μm) in the tumor sides of the borderlines, while there was no change in adjacent normal tissues, further validated by IF result from 10 ICC patients from Validation Cohort 1 。觀察到抗炎巨噬細(xì)胞（M2 樣）而不是促炎巨噬細(xì)胞（M1 樣）的百分比顯著增加從外兩層（750-500 μm 和 500-250 μm）到第一層（250- 0 μm) 靠近腫瘤兩側(cè)的邊界線

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DCs 和 T/NK 細(xì)胞的百分比從第三層（750-500 μm）增加到靠近腫瘤側(cè)面邊界的第一層（250-0 μm）浦辨，而 B 細(xì)胞的百分比從第二層增加到第一層蹬竖。T 細(xì)胞亞型，包括細(xì)胞毒性和耗竭的 T 細(xì)胞流酬，分散在邊緣區(qū)域中币厕，邊緣周圍沒(méi)有任何積累。然而芽腾，BTLA旦装、CTLA4、CD96摊滔、IDO1等免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)在邊界線的腫瘤側(cè)富集阴绢，表明腫瘤側(cè)靠近邊界線區(qū)域的免疫細(xì)胞處于抑制性免疫狀態(tài)!

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相應(yīng)地店乐，與腫瘤側(cè)外層的腫瘤細(xì)胞相比，第一層的腫瘤細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的免疫逃避特征

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總之呻袭，這些結(jié)果顯示了不同的 TME 特征眨八，其中免疫細(xì)胞富集，包括巨噬細(xì)胞（M2 樣）左电、T/NK 細(xì)胞廉侧、DCs 細(xì)胞和來(lái)自腫瘤側(cè)的第一層（250-0 μm）的 B 細(xì)胞以及 在靠近入侵前沿邊界的兩側(cè)最近的層中具有更強(qiáng)的免疫抑制性微環(huán)境。

除了免疫細(xì)胞分布的空間異質(zhì)性和侵襲前沿的不同免疫抑制微環(huán)境外篓足，我們進(jìn)一步表征了邊界線周圍細(xì)胞成分（主要由肝細(xì)胞組成）的代謝變化和增殖能力段誊。 一般來(lái)說(shuō)，與邊界線旁腫瘤側(cè)的所有細(xì)胞相比栈拖，腫瘤側(cè)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較低的缺氧相關(guān)途徑和較高的糖酵解水平

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與相應(yīng)的外部區(qū)域相比连舍，與邊界線最近的雙側(cè)層顯示出更高的缺氧相關(guān)通路激活。與缺氧水平趨勢(shì)一致涩哟，交界旁腫瘤旁第一層細(xì)胞糖酵解水平明顯高于外層索赏。Although there was no difference in glycolysis levels of tumor cells among different layers, upregulated levels of tricarboxylic acid cycle and fatty acid metabolism components, including fatty acyl CoA synthesis and fatty acid beta-oxidation of tumor cells, was found in the first layer, when compared with those in outer areas from the tumor side。這可能表明染簇，由于進(jìn)一步侵襲需要額外的能量参滴，第一層中的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷了代謝重編程以上調(diào)脂質(zhì)代謝强岸。 正如預(yù)期的那樣锻弓，與腫瘤旁側(cè)的細(xì)胞（主要由肝細(xì)胞組成）相比，邊界線腫瘤側(cè)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的 G2M 評(píng)分蝌箍，表明腫瘤細(xì)胞具有更高的增殖能力青灼。除了較高的增殖能力外，與邊界線旁瘤側(cè)的外部區(qū)域相比妓盲，在最接近的層中還檢測(cè)到更高的細(xì)胞凋亡水平杂拨，這可能反映了靠近腫瘤旁邊界線的肝細(xì)胞的嚴(yán)重受損狀態(tài) . 對(duì)于腫瘤細(xì)胞，在最接近的層中凋亡水平較高悯衬，但從侵襲前沿的腫瘤側(cè)觀察到不同層的增殖能力沒(méi)有差異弹沽。在副腫瘤側(cè)的第一層也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞（主要由肝細(xì)胞組成）中更高水平的缺氧、糖酵解筋粗、增殖能力和凋亡策橘。 因此，我們將以邊界線為中心的 500 μm 寬區(qū)域定義為“侵入前沿”娜亿，這比之前定義的以邊界線為中心的 1,000 μm 寬區(qū)域更合理丽已。 綜上所述，這些結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞中脂肪酸代謝的能量供應(yīng)增強(qiáng)买决，并且在靠近邊界的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了占主導(dǎo)地位的抑制性免疫環(huán)境沛婴，尤其是在侵襲前沿吼畏。

（4）The damaged states of hepatocytes at invasive fronts were related to the prognoses of patients with primary and metastatic liver cancers.

除了代謝重編程現(xiàn)象和腫瘤細(xì)胞在侵襲前沿的免疫逃逸特征增強(qiáng)外，侵襲前沿的細(xì)胞成分（主要由肝細(xì)胞組成）也表現(xiàn)出增殖能力增強(qiáng)和細(xì)胞凋亡增加嘁灯。 一些研究報(bào)道了肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝癌或肝轉(zhuǎn)移泻蚊。 為了表征細(xì)胞成分的炎癥反應(yīng)并在腫瘤侵襲期間識(shí)別不同的細(xì)胞簇，我們根據(jù)其在侵襲前沿的副腫瘤側(cè)的三層（0-750 μm 寬區(qū)域）中的基因表達(dá)譜重新聚集肝細(xì)胞丑婿。 我們根據(jù)不同的基因表達(dá)譜確定了兩種肝細(xì)胞亞型（Hep1 和 Hep2）藕夫，其中 Hep1 細(xì)胞的 SAA1（急性期蛋白血清淀粉樣蛋白 A1）和 SAA2（血清淀粉樣蛋白 A2）的表達(dá)水平顯著高于 Hep2 細(xì)胞。

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• 注：Volcano plot showing differentially-expressed genes between Hep1 and Hep2. The red dots represent genes upregulated in Hep1 cells and the blue dots represent genes upregulated in Hep2 cells

關(guān)于它們的空間分布枯冈，Hep1 細(xì)胞主要聚集在第一層毅贮，靠近邊界線的寬度為 250 μm，揭示了肝細(xì)胞由于直接暴露于腫瘤侵襲而嚴(yán)重受損的狀態(tài)尘奏，這一點(diǎn)使用 IF 得到證實(shí)

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The bulk RNA-seq data from Validation Cohort 2 also showed much higher expression levels of SAA1 and SAA2 around the border areas (bilateral sampling of tissues with a width of 5 mm along the borderline) than corresponding tumor tissues and adjacent normal tissues滩褥。此外，來(lái)自另外 93 名 ICC 患者（驗(yàn)證隊(duì)列 3）的 IHC 結(jié)果也顯示在侵襲性前沿的 SAA 表達(dá)高于腫瘤組織或鄰近正常組織外部區(qū)域的 SAA 表達(dá)

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使用基因富集分析炫加，與 Hep2 細(xì)胞相比瑰煎，在 Hep1 細(xì)胞中還鑒定了包括氧化磷酸化、MYC 靶向 V1 和上調(diào)基因的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 在內(nèi)的富集途徑俗孝。與 Hep2 細(xì)胞相比酒甸，單細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)推理和聚類 (SCENIC) 分析還確定了不同的上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 (TF)，包括 Hep1 細(xì)胞中的 CEBPG赋铝、YY1插勤、ETV6、CDX1 和 CTCFL

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在這些TF中革骨，ETV6农尖、CEBPG、YY1和BHLHE40在SCENIC中被注釋為SAA1和SAA2的潛在TF良哲，表明靠近侵入前沿的第一層活動(dòng)得分增加盛卡，這可能參與介導(dǎo)了SAA1的高表達(dá) Hep1 細(xì)胞中的 SAA2

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• 注：The TF activity scores of ETV6, CEBPG, YY1, and BHLHE40 in hepatocytes at invasive fronts in ST sides (LC5-B).

另一方面，根據(jù) scRNA-seq 數(shù)據(jù)筑凫，報(bào)道的 SAA 受體基因滑沧，包括 FPR1、FPR2巍实、TLR4滓技、TLR2、SCARB1 和 CD36蔫浆，主要在巨噬細(xì)胞中富集殖属，這也得到了 ST slides結(jié)果的證實(shí)。

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此外瓦盛，表達(dá)編碼 SAA 受體基因的巨噬細(xì)胞斑點(diǎn)和 Hep1 細(xì)胞在侵襲前沿在空間上積累洗显，進(jìn)一步表明巨噬細(xì)胞在侵襲前沿從肝細(xì)胞分泌 SAA

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The accumulation of FPR1⁺ macrophages close to SAA⁺ hepatocytes at invasive fronts was further confirmed by multiplexed IF in Validation Cohort 1, including ICC (n = 10), HCC (n = 5), liver metastasis of colorectal cancer (n = 3), liver metastasis of pancreatic cancer (n = 2), and liver metastasis of lung cancer (n=1)

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具體而言外潜，在包括 ICC 和 HCC 在內(nèi)的原發(fā)性肝癌以及上述轉(zhuǎn)移性肝癌中，發(fā)現(xiàn)腫瘤側(cè) FPR1⁺ 巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加挠唆，侵襲前沿旁腫瘤側(cè)的 SAA⁺ 肝細(xì)胞數(shù)量顯著增加.

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還觀察到巨噬細(xì)胞富集與 SAA⁺ 肝細(xì)胞在侵襲前沿之間的強(qiáng)相關(guān)性（R = 0.73处窥，P = 0.017）.此外，沿著正常腫瘤邊界的侵襲前沿也存在高度異質(zhì)性玄组。 我們發(fā)現(xiàn)靠近 SAA 富集區(qū)域的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的 EMT滔驾、上調(diào)能量代謝過(guò)程（ATP 代謝過(guò)程、氧化磷酸化和呼吸電子傳遞鏈）和激活的免疫反應(yīng)（干擾素 α 反應(yīng)和 IL2-STAT5 信號(hào)傳導(dǎo)） ) 與附近腫瘤細(xì)胞 Hep1 非富集 (Hep2 富集) 區(qū)域的侵襲性前沿相比.Finally, the damaged states of hepatocytes at invasive fronts were found to be related to the prognoses of patients with primary liver cancers. The higher expressions of SAA1 and SAA2 in the border areas from Validation Cohort 2 were significantly associated with worse overall survival (OS) of ICC patients (P = 0.019 for SAA1 and P = 0.019 for SAA2).IHC results from 93 ICC patients (Validation Cohort 3) also showed significant negative correlations between SAA expression levels at invasive fronts and the OS, as well as relapse-free survival (RFS) for ICC patients.這些結(jié)果表明肝細(xì)胞的受損狀態(tài)與腫瘤進(jìn)展以及患者的預(yù)后有關(guān)俄讹。 最重要的是哆致，我們確定了肝細(xì)胞的受損狀態(tài)，其特征在于響應(yīng)于腫瘤侵襲的 SAA 過(guò)表達(dá)患膛，隨后募集巨噬細(xì)胞以進(jìn)一步侵襲腫瘤摊阀，最終導(dǎo)致更差的預(yù)后。

Discussion

在這項(xiàng)研究中踪蹬，將亞細(xì)胞分辨率的空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)與 scRNA-seq 相結(jié)合胞此，以繪制來(lái)自 8 名 ICC 患者的四個(gè)區(qū)域位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)圖。與其他 ST 方法相比跃捣，我們的 Stereo-seq 數(shù)據(jù)具有前所未有的納米級(jí)分辨率（220 nm × 220 nm/點(diǎn)）和可擴(kuò)展區(qū)域（10 mm × 10 mm）漱牵，能夠更準(zhǔn)確地原位研究細(xì)胞類型或細(xì)胞狀態(tài)，并且空間分割和進(jìn)一步分析的更多空間疚漆。在我們的研究中使用 Stereo-seq 能夠識(shí)別 ICC 患者不同區(qū)域的細(xì)胞類型和 ECM 成分分布酣胀。結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞和ECM的組成異質(zhì)性，以及它們?cè)诓煌瑓^(qū)域之間的空間分布愿卸。通過(guò)構(gòu)建腫瘤邊緣區(qū)域周圍區(qū)域的分割模型灵临，我們首先確定了侵襲前沿周圍區(qū)域（以邊界為中心的 500 μm 寬區(qū)域）中免疫細(xì)胞簇的獨(dú)特富集、腫瘤細(xì)胞的代謝重編程和肝細(xì)胞的炎癥狀態(tài)趴荸。 , 每邊 250 μm)。

腫瘤細(xì)胞侵入旁組織并直接接觸的侵襲前沿被認(rèn)為是了解腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移所必需的實(shí)體瘤中最重要的區(qū)域宦焦。對(duì)這些區(qū)域的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面繪制有助于更好地了解分子病理學(xué)和個(gè)性化治療策略的開發(fā)发钝，例如實(shí)體瘤的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法。作為 TME 的一個(gè)基本生物學(xué)特征波闹，由于研究工具的局限性酝豪，空間異質(zhì)性在很大程度上被忽略了。在本研究中精堕，基于使用立體序列的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)構(gòu)的綜合映射孵淘，將侵襲前沿的空間異質(zhì)性與 ICC 中的其他區(qū)域進(jìn)行了比較，這有助于了解腫瘤行為歹篓，包括侵襲和轉(zhuǎn)移瘫证∪嘌郑基于由 ST 載玻片邊界線兩側(cè)的三層組成的構(gòu)建模型，發(fā)現(xiàn)在離腫瘤最近的 250 μm 寬的層中觀察到免疫細(xì)胞的富集和獨(dú)特的免疫抑制微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞的代謝重編程邊界線的一側(cè)背捌。在免疫細(xì)胞中毙籽，巨噬細(xì)胞主要由聚集在侵襲前沿的主要 M2 樣巨噬細(xì)胞組成，表明抗炎巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤進(jìn)展的主要促進(jìn)作用毡庆。此外坑赡，我們發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)增強(qiáng)，包括免疫細(xì)胞中的 CTLA4么抗，我們還發(fā)現(xiàn)最靠近邊界層的腫瘤細(xì)胞中的免疫逃避特征上調(diào)毅否。因此，在侵襲前沿發(fā)現(xiàn)了更具抑制性的免疫微環(huán)境蝇刀，這可以促進(jìn)實(shí)體瘤的進(jìn)一步腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移搀突。

基于邊緣區(qū)域的精確分割，我們的研究還全面表征了腫瘤細(xì)胞在侵襲前沿的不同細(xì)胞狀態(tài)熊泵。通過(guò)分析與腫瘤細(xì)胞行為相關(guān)的常規(guī)途徑仰迁，我們觀察到更多來(lái)自脂肪酸代謝上調(diào)的能量供應(yīng)成分，包括與腫瘤外層相比顽分，腫瘤側(cè)最接近層的腫瘤細(xì)胞中脂肪酸合成和氧化增加 -副腫瘤邊界徐许，進(jìn)一步表明這些位置的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷了增強(qiáng)脂肪酸代謝的明顯代謝重編程，以增加能量供應(yīng)卒蘸，以更好地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲雌隅。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)缸沃，與外部區(qū)域相比恰起，離邊界線旁瘤側(cè)最近的層的細(xì)胞成分的缺氧狀態(tài)、糖酵解水平以及增殖能力和凋亡水平均有所增強(qiáng)趾牧。由于所有這些結(jié)果都揭示了侵襲前沿周圍區(qū)域的不同炎癥狀態(tài)和特殊代謝特征检盼，我們將以腫瘤邊界為中心的 500 μm 寬區(qū)域重新定義為“侵襲前沿”，這比之前定義的 1,000 μm 寬區(qū)域更合理以邊界為中心翘单。此外吨枉，為了增加能量供應(yīng)，腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)的脂肪酸代謝的代謝重編程可以解釋實(shí)體瘤的進(jìn)一步腫瘤侵襲哄芜。因此貌亭，阻斷這一過(guò)程的治療方法可能是一種抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的新療法。

通過(guò)進(jìn)一步表征侵襲前沿細(xì)胞成分的特征认臊，我們發(fā)現(xiàn)侵襲前沿的肝細(xì)胞也發(fā)生了明顯的炎癥變化圃庭，SAA及其TFs高表達(dá)，包括ETV6、CEBPG剧腻、YY1和BHLHE40拘央，反映了肝細(xì)胞的受損狀況被腫瘤細(xì)胞侵入 45, 46。 SAA 可以直接協(xié)調(diào)先天免疫細(xì)胞的積累恕酸，如單核細(xì)胞堪滨、未成熟的 DC、中性粒細(xì)胞和 T 細(xì)胞蕊温。在侵襲前沿的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到 SAA 受體袱箱，包括 FPR1 和 FPR2，并在靠近 Hep1 細(xì)胞處顯著積累义矛，這可能是由于受損的肝細(xì)胞分泌 SAA发笔，在靠近邊界處募集巨噬細(xì)胞所致。這種可能性與一項(xiàng)研究一致凉翻，該研究報(bào)告肝細(xì)胞上調(diào) SAA1 表達(dá)并為小鼠模型中胰腺癌的肝轉(zhuǎn)移提供了促轉(zhuǎn)移生態(tài)位 45了讨。 SAA 在侵襲前沿的高表達(dá)和富集可以解釋該部位免疫細(xì)胞的聚集，這在其他研究以及我們自己的研究中都有報(bào)道制轰。據(jù)報(bào)道前计，SAA 有助于 M2-巨噬細(xì)胞分化，這可以解釋在侵襲性前沿發(fā)現(xiàn)更多 M2 樣巨噬細(xì)胞的存在垃杖。此外男杈，在其他實(shí)體瘤包括 HCC、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和胰腺癌的侵襲前沿也證實(shí)了 SAA 的高表達(dá)和巨噬細(xì)胞的積累调俘，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與患者較差的預(yù)后相關(guān)伶棒。我們的工作確定了軸向侵入前沿的異質(zhì)性，腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的高度變化和沿邊界的受損肝細(xì)胞分布彩库。最重要的是肤无，我們發(fā)現(xiàn)了SAA在侵襲前沿對(duì)肝細(xì)胞表達(dá)的新作用，它反映了肝細(xì)胞的受損狀態(tài)骇钦，并介導(dǎo)巨噬細(xì)胞（主要是M2樣巨噬細(xì)胞）的募集以進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤進(jìn)展.

盡管 Stero-seq 提供了高納米級(jí)分辨率（220 nm × 220 nm/點(diǎn)）來(lái)捕獲每個(gè)細(xì)胞幾百個(gè)點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄物宛渐，但仍然難以識(shí)別細(xì)胞邊界并在單個(gè)細(xì)胞水平上捕獲準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄物。 在我們的研究中司忱，納米級(jí)分辨率的原始空間表達(dá)矩陣被轉(zhuǎn)換為 25 μm 平方大谢史蕖（50 × 50 bins/pseudo-spot）的細(xì)胞大小的偽點(diǎn)，并以最高概率分配給特定的細(xì)胞類型坦仍。 因此，由于技術(shù)限制叨襟，仍然難以在空間上繪制解析的單細(xì)胞遺傳信息并精確推斷細(xì)胞類型

總之繁扎，本研究表征了腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性和異質(zhì)性，以及 ICC 不同區(qū)域位點(diǎn)的細(xì)胞相互作用，確定了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)梳玫、抑制性免疫微環(huán)境爹梁、腫瘤細(xì)胞的代謝重編程以及在侵襲前沿富集的受損肝細(xì)胞。 . 我們還在 HCC提澎、結(jié)直腸癌或胰腺癌的肝轉(zhuǎn)移中驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)姚垃。 總體而言，該結(jié)果提供了對(duì)腫瘤侵襲前沿存在的異質(zhì)性的全面理解和詳細(xì)表征盼忌，這將有助于開發(fā)更精確和有效的治療實(shí)體瘤的治療靶點(diǎn)积糯。

Method(我們來(lái)關(guān)注一下分析的方法)

聚類

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空間注釋

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很有想法的文章，值得借鑒谦纱，尤其是空間細(xì)胞密度的分析和通路開關(guān)

生活很好看成，有你更好