Nature:WGBS揭示最全正常人類細(xì)胞類型的綜合DNA甲基化圖譜

DNA甲基化是一種基本的表觀遺傳標(biāo)記,可以調(diào)控基因表達(dá)和染色質(zhì)組裝镐牺,從而為研究細(xì)胞身份和發(fā)育過程提供了重要視角蜓斧。當(dāng)前已有的數(shù)據(jù)集通常只包括部分甲基化位點,并且常辰耐啵基于在培養(yǎng)過程中經(jīng)歷了巨大變化的細(xì)胞系蝌诡,或者是基于包含未指定混合細(xì)胞的組織。

2023年枫吧,以色列耶路撒冷希伯來大學(xué)Tommy Kaplan等人基于深度全基因組亞硫酸鹽測序(WGBS)對來自205個健康組織樣本中分選的39種細(xì)胞類型的數(shù)千個獨特標(biāo)記進(jìn)行片段級分析浦旱,構(gòu)建了人類DNA甲基化圖譜。研究發(fā)現(xiàn)由蘑,相同細(xì)胞類型的重復(fù)樣本之間的相似性超過99.5%闽寡,顯示出細(xì)胞身份程序?qū)Νh(huán)境動態(tài)變化的穩(wěn)健性(robustness)代兵。相關(guān)研究成果以“A DNA methylation atlas of normal human cell types”為題發(fā)表在《自然》(Nature)期刊上尼酿。

題目:A DNA methylation atlas of normal?human cell types

期刊:Nature

影響因子:50.5

技術(shù)平臺:WGBS

本研究通過WGBS對不同細(xì)胞類型的DNA甲基化圖譜進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析,追溯到組織發(fā)育的關(guān)鍵因子植影,并鑒定出自胚胎發(fā)育起始的保守甲基化模式裳擎。研究揭示特定細(xì)胞類型中特異性未甲基化位點通常位于轉(zhuǎn)錄增強子中,并包含組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合位點思币。特異性高甲基化位點則較為罕見鹿响,且富含CpG島、Polycomb靶點和CTCF結(jié)合位點谷饿,表明其在塑造細(xì)胞類型特異性染色質(zhì)回路中可能發(fā)揮新作用惶我。該圖譜為研究基因調(diào)控和與疾病相關(guān)的遺傳變異提供一個基本資源,并為液體活檢中使用的潛在組織特異性生物標(biāo)志物提供了大量可能性博投。


人類細(xì)胞類型的DNA甲基化圖譜

為了繪制不同細(xì)胞類型中的全基因組DNA甲基化圖譜绸贡,研究人員對205個樣本(包括77種主要細(xì)胞類型)進(jìn)行WGBS(平均深度至少為30×的150bp的配對末端測序)。所選樣本經(jīng)過仔細(xì)分選并比對到人類參考基因組(hg19,hg38)听怕,通過流式細(xì)胞術(shù)捧挺、基因表達(dá)和DNA甲基化分析鑒定平均樣本純度(所需細(xì)胞類型材料比例)超過90%。所分析的細(xì)胞類型(圖1)代表了大多數(shù)主要的人類細(xì)胞類型尿瞭,可以對生理系統(tǒng)(如胃腸道闽烙、造血細(xì)胞和胰腺)進(jìn)行綜合觀察,以及比較不同環(huán)境中的類似細(xì)胞類型(如組織駐留的巨噬細(xì)胞)声搁。

圖1:成人人體的甲基化圖譜黑竞。 在18kb區(qū)域中顯示了344個CpG位點(列)上205個甲基化體(行)的DNA甲基化模式。突出顯示的是B細(xì)胞(藍(lán)色)疏旨、神經(jīng)元(綠色)摊溶、甲狀腺上皮(黃色)和神經(jīng)元/少突膠質(zhì)細(xì)胞(少突膠質(zhì))(粉紅色)中未甲基化的區(qū)域。

205個甲基化圖譜在重復(fù)樣本中相似充石,而在不同細(xì)胞類型之間則以區(qū)塊方式顯著變化莫换。研究人員在特定細(xì)胞類型中鑒定差異甲基化區(qū)域,以揭示細(xì)胞類型特異性的生物過程骤铃,定義細(xì)胞身份拉岁,并促進(jìn)甲基化生物標(biāo)志物的發(fā)展,以鑒定循環(huán)cfDNA片段的細(xì)胞起源惰爬。

研究人員開發(fā)了一個名為wgbstools的計算機器學(xué)習(xí)套件喊暖,用于分析WGBS數(shù)據(jù),通過鑒定多個條件下DNA甲基化模式的變化點撕瞧,將基因組切割成7104162個不重疊連續(xù)區(qū)塊陵叽。每個區(qū)塊跨越高度相關(guān)的CpG位點,在每個樣本中甲基化程度相似丛版,保留至少包含三個CpG位點的2783421個甲基化塊(平均長度為544 bp)巩掺,以及8個CpG位點。對這些緊湊的基因組進(jìn)行穩(wěn)健分析比單獨CpG位點更為直接页畦,并且由于甲基化的區(qū)域性質(zhì)胖替,可以被視為人類DNA甲基化的生物學(xué)“原子”。


甲基化記錄發(fā)展歷程

DNA甲基化模式不僅可以反映細(xì)胞的功能身份豫缨,還可以追溯其發(fā)展歷程独令。為了鑒定早期祖先后代共有模式,研究人員計算了至少包含四個CpG位點的區(qū)塊平均甲基化水平好芭,并選擇樣本中的最高變異性區(qū)塊(21000個區(qū)塊燃箭,前1%)。使用無監(jiān)督聚類分析對所有205個甲基化圖譜進(jìn)行聚類舍败,系統(tǒng)地將相同細(xì)胞類型的生物學(xué)樣本分組(圖2)招狸,類似于純化的人血細(xì)胞基于陣列的聚類碗硬。支持了細(xì)胞分離的可重復(fù)性,并表明每個正常細(xì)胞類型的三~四個重復(fù)足以檢測其甲基化模式瓢颅,可用于生物標(biāo)志物鑒定等實際應(yīng)用中恩尾。

圖2:無監(jiān)督聚類揭示健康細(xì)胞類型的人類發(fā)育譜系。

細(xì)胞類型特異性甲基化標(biāo)志物

接下來研究以細(xì)胞類型特異性方式差異甲基化的基因組區(qū)域挽懦,作者將205個樣本分為39種特定細(xì)胞類型翰意,每種細(xì)胞類型的前25個差異性未甲基化區(qū)域構(gòu)成了一個包含1246個標(biāo)記的人類細(xì)胞類型特異性甲基化圖譜(圖3)。這些區(qū)域在特定細(xì)胞類型中表現(xiàn)出特異性未甲基化(平均甲基化水平為13%)信柿,而在所有其他樣本甲基化(平均甲基化水平為91%)冀偶,可以作為敏感的生物標(biāo)志物,用于定量混合物中特定細(xì)胞類型渔嚷。這些標(biāo)記包括953個細(xì)胞類型特異性未甲基化位點进鸠,以及另外293個在少數(shù)相關(guān)細(xì)胞類型中未甲基化的位點。

圖3:39種細(xì)胞類型共205個樣本的人類甲基化圖譜形病。 a. 總共有953個基因組區(qū)域以細(xì)胞類型特異性方式未甲基化客年。圖中的每個單元格標(biāo)記了39個細(xì)胞類型(行)中每個基因組區(qū)域(列)的平均甲基化水平。每個細(xì)胞類型顯示多達(dá)25個區(qū)域漠吻,每個區(qū)域的平均長度為356 bp(9個CpG位點)量瓜。 b. 心肌細(xì)胞的前25個區(qū)域。每個區(qū)域繪制了圖譜中所有29種細(xì)胞類型205個樣本中每個CpG位點(列)的平均甲基化水平途乃。 c. 心肌細(xì)胞特異性未甲基化位點绍傲。淺藍(lán)色高亮標(biāo)記為120 bp(6個CpG位點),位于MYL4基因的第一個內(nèi)含子中耍共,MYL4是一個心臟特異性基因(心房附屬物TPM表達(dá)量為2518)烫饼。基因組快照顯示六個心肌細(xì)胞樣本试读、四個心臟成纖維細(xì)胞樣本和三個主動脈樣本(兩個內(nèi)皮細(xì)胞和一個平滑肌細(xì)胞)的平均甲基化水平(紫色軌跡)杠纵。 d. 三個心肌細(xì)胞樣本、一個心臟成纖維細(xì)胞樣本和兩個主動脈樣本(內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化片段可視化鹏往。黃色和藍(lán)色點分別表示甲基化和未甲基化的CpG位點淡诗。

人類細(xì)胞類型特異性調(diào)控圖

接下來骇塘,研究人員表征這些細(xì)胞類型特異性差異未甲基化區(qū)域伊履。分別利用轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序(ATAC-seq)、DNase I超敏位點測序(DNaseI-seq)分析細(xì)胞類型特異性標(biāo)記的DNA可及性和染色質(zhì)狀態(tài)款违。分析結(jié)果表明唐瀑,單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中前250個未甲基化標(biāo)記高度可及,并且以單核細(xì)胞中的H3K27ac和H3K4me1為特征插爹,而其他細(xì)胞類型標(biāo)記在單核細(xì)胞中沒有富集哄辣,同時還揭示了細(xì)胞類型特異性標(biāo)記chromHMM增強子注釋的強烈協(xié)調(diào)富集(圖4a)请梢。這些發(fā)現(xiàn)與之前將組織特異性去甲基化與基因增強子聯(lián)系起來的研究一致。

為進(jìn)一步評估細(xì)胞類型特異性未甲基化區(qū)域的生物學(xué)重要性力穗,作者研究了它們與轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的關(guān)聯(lián)毅弧。使用每種細(xì)胞類型前1000個未甲基化標(biāo)記進(jìn)行motif分析,計算這些標(biāo)記所富集的TF結(jié)合motif当窗,研究結(jié)果表明對于大多數(shù)細(xì)胞類型够坐,Top motifs包括主調(diào)控因子和關(guān)鍵TFs(圖4b)。例如崖面,B細(xì)胞富含Ebf2/HEB/E2A元咙,粒細(xì)胞富含CEBP/AP1/ETS,T細(xì)胞富含ETS/RUNX巫员。細(xì)胞類型特異性未甲基化區(qū)域與TF結(jié)合motif之間的關(guān)聯(lián)可以鑒定新的基因調(diào)控回路庶香,并暴露在特定細(xì)胞類型中活躍的遠(yuǎn)端增強子。

圖4:作為潛在增強子的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記简识。 a. 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的前250個細(xì)胞類型特異性未甲基化標(biāo)記赶掖,顯示了活性調(diào)控標(biāo)記H3K27ac、增強子標(biāo)記H3K4me1七扰、DNA可及性和chromHMM增強子注釋的平均ChIP-seq信號倘零。作為比較,其他血細(xì)胞類型(粒細(xì)胞和B戳寸、T及NK細(xì)胞)的前250個標(biāo)記的平均信號以灰色線條顯示呈驶。 b. 細(xì)胞類型特異性標(biāo)記調(diào)控motif的富集。顯示每個細(xì)胞類型中前1000個差異性未甲基化區(qū)域富集的top轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點motif疫鹊。

細(xì)胞類型特異性高甲基化位點

作者研究了在一種細(xì)胞類型中甲基化而在人體其他部位未甲基化的基因組區(qū)域(即特異性高甲基化區(qū)域)袖瞻,這些區(qū)域富含CpG島且在其他細(xì)胞類型中被H3K27me3和Polycomb標(biāo)記(圖5a-c)。

在綜合分析所有細(xì)胞類型特異性高甲基化區(qū)域后拆吆,結(jié)果揭示特異性高甲基化區(qū)域?qū)θ旧|(zhì)調(diào)節(jié)因子CTCF的靶向序列強富集(圖5d)聋迎,表明CTCF結(jié)合位點的DNA甲基化可能作為組織特異性調(diào)控開關(guān)來調(diào)控其結(jié)合,可能影響組織特異性的三維基因組枣耀。為了驗證這一假設(shè)霉晕,作者比較了CTCF位點的DNA甲基化模式與特定組織中全基因組CTCF蛋白結(jié)合模式(圖5e),結(jié)果顯示在結(jié)腸和腸道特異性甲基化位點的甲基化模式和已發(fā)表的體內(nèi)CTCF占有情況捞奕。與DNA甲基化抑制CTCF結(jié)合一致牺堰,ChIP數(shù)據(jù)顯示結(jié)腸中這個位點CTCF結(jié)合的選擇性丟失。此外颅围,在特定細(xì)胞類型中甲基化位點富集了神經(jīng)基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子RE1-沉默TF/神經(jīng)元限制性沉默因子(REST/NRSF)的靶標(biāo)伟葫,且在胰島細(xì)胞的甲基組中最突出(圖5f)。

圖5:細(xì)胞類型特異性高甲基化區(qū)域富集于CpG島院促、Polycomb靶點以及CTCF和REST/NRSF筏养。 a. Top細(xì)胞類型特異性高甲基化標(biāo)記中有38%(3,613個中的1363個)與CpG島重疊斧抱。 b. 這些區(qū)域通常在其他細(xì)胞類型中富含H3K27me3。 c. 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的Polycomb注釋(chromHMM)渐溶,包括所有或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記辉浦。 d. 細(xì)胞類型中前100個細(xì)胞類型特異性高甲基化區(qū)域的motif分析鑒定出已知CTCF和REST/NRSF motif。 e. 對hg19位點(chr. 1: 209364093–209364250)的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析茎辐,該位點在小腸和結(jié)腸上皮中特異甲基化(紅框1)盏浙,在其他地方未甲基化。 f. 在內(nèi)分泌胰腺中荔茬,前100個細(xì)胞類型特異性高甲基化區(qū)域中有14%存在REST/NRSF motif废膘,頂級delta細(xì)胞標(biāo)記中有7%,頂級alpha細(xì)胞標(biāo)記中有2%慕蔚,與背景序列中大約0.1%相比丐黄,這與內(nèi)分泌胰腺中REST靶標(biāo)表達(dá)一致。

片段級甲基化組反卷積

圖6:使用細(xì)胞類型特異性生物標(biāo)志物的片段級反卷積孔飒。

易小結(jié):

本研究通過WGBS繪制了人類原代細(xì)胞類型的全面DNA甲基化圖譜灌闺,篩選出一套廣泛的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記,并開發(fā)出一套用于混合細(xì)胞類型樣本片段級分析的計算工具坏瞄。這些工具的開發(fā)補充了現(xiàn)有的大量基于芯片陣列甲基化圖譜和去卷積工具桂对,也可用于分析陣列數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)共同揭示了DNA甲基化在細(xì)胞生物學(xué)和基因調(diào)控中的作用鸠匀,并促進(jìn)了在每種細(xì)胞類型中活躍的增強子的鑒定蕉斜。本研究的圖譜最有前景的用途可能是混合細(xì)胞類型樣本的片段級去卷積,允許在癌癥和其他疾病患者的血漿中高靈敏度的鑒定cfDNA的起源組織缀棍。

參考文獻(xiàn):

Loyfer N, et al.A DNA methylation atlas of normal human cell types. Nature. 2023Jan;613(7943):355-364. pii: 10.1038/s41586-022-05580-6. doi:10.1038/s41586-022-05580-6. PubMed PMID: 36599988.

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