1.二代測序
2.flow cell（流動(dòng)池）有8條通道推掸，通道內(nèi)表面有兩種DNA引物與兩端接頭以共價(jià)鍵連接
1.DNA文庫
許多在兩頭接上了特定DNA接頭的DNA片段形成的DNA混合物
- 兩端接頭為人為加上去的，且序列已知
- 中間的DNA片段序列多種多樣邀泉，待測序
2.構(gòu)建DNA文庫
- 超聲波打斷基因組DNA
- 用酶補(bǔ)平兩端
- 連接酶連接接頭
3. 橋式PCR
- 文庫加到芯片上其徙，接頭與芯片上的引物共價(jià)互補(bǔ)連接
- 加入dNTP和聚合酶胚迫，合成新的DNA鏈
- 加入NaOH堿溶液，DNA雙鏈解鏈唾那，接頭未共價(jià)連接的鏈被沖走
- 加入中性液访锻，DNA片段另一端接頭與芯片引物互補(bǔ)連接
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然后重復(fù)上述，DNA成指數(shù)擴(kuò)增
4.把合成的雙鏈變成測序的單鏈
- 把芯片上的一個(gè)引物上的特定基團(tuán)切掉
- 堿溶液洗芯片闹获，洗掉一條單鏈
- 加入中性乳液和測序引物
5.測序
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加入熒光dNTP（3'端被一個(gè)疊氮基堵住期犬，保證一個(gè)循環(huán)只能延長一個(gè)堿基）和聚合酶
- 用水把多余的dNTP和聚合酶沖掉
- 顯微鏡激光掃描，根據(jù)熒光判斷堿基
- 一輪循環(huán)后加入化學(xué)試劑切段熒光基團(tuán)和疊氮基團(tuán)避诽，從而暴露3'段-OH
- 加入新的dNTP和聚合酶龟虎，重復(fù)（邊測序邊合成）
6. 讀取index（barcode）
barcode定義：在接頭里做特定標(biāo)記，使每個(gè)接頭里有一段特定的序列沙庐，從而每一個(gè)樣本都有一個(gè)特定的接頭鲤妥，標(biāo)記樣本的來源
- 用堿把上面測序完的鏈解鏈，并加入中性液
- 加入barcode引物拱雏，進(jìn)行第二輪測序
- 一般測6-8個(gè)堿基就可以知道某段序列來自于哪個(gè)樣本
7.雙端測序（paired-end sequence）
定義：一根DNA鏈從正向測序一遍棉安，再從負(fù)向測序一遍，延長有效測序長度
- 先合成互補(bǔ)鏈
- 切段原來的模版鏈
- 加入第二端測序的引物進(jìn)行測序
