揭示基因表達(dá)的時空模式對于理解從胚胎發(fā)生到疾病的核心生物學(xué)原理至關(guān)重要。來自澳大利亞和美國的研究團(tuán)隊在《communications biology》發(fā)表綜述，探討了目前用于闡明空間表達(dá)的技術(shù)寸爆，解釋了準(zhǔn)確地定量捕捉空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)的能力。此類技術(shù)為在空間和定量方面對基因表達(dá)水平進(jìn)行無偏倚且詳盡的再現(xiàn)盐欺，促進(jìn)對發(fā)育缺陷的分子起源的理解和改善醫(yī)學(xué)診斷鋪平了道路赁豆。
基于成像的基因表達(dá)空間解析方法
以往空間模式是通過對目標(biāo)基因進(jìn)行直接或原位染色來捕獲的。原位雜交（ISH）技術(shù)用于研究空間復(fù)雜性冗美。雖然原位雜交解決了對空間分辨數(shù)據(jù)的需要魔种，但使用這種方法通常很難實現(xiàn)基因表達(dá)的精確量化，因此需要進(jìn)一步分析粉洼。
提高靈敏度和準(zhǔn)確性
精確定量測量原位基因表達(dá)的進(jìn)一步進(jìn)展包括空間基因組分析流程（SGA）节预，它整合了順序單分子熒光原位雜交和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）的結(jié)果。HCR使用兩個互補(bǔ)的DNA探針属韧，形成熒光標(biāo)記的擴(kuò)增聚合物安拟，能夠相對定量mRNA的表達(dá)。此外宵喂，由于集成了單細(xì)胞成像技術(shù)糠赦，該技術(shù)實現(xiàn)了更高的空間分辨率。RNAscope提供了定性和定量方法的進(jìn)一步整合，探針雜交和信號放大在原位進(jìn)行拙泽，允許單分子分辨率的空間相關(guān)分析淌山。然而，由于SGA的產(chǎn)量受到可分辨染料數(shù)量的限制顾瞻，分析僅限于少數(shù)目標(biāo)基因泼疑。
ClampFISH被開發(fā)以提高在FISH中的效率和由此產(chǎn)生的弱信號響應(yīng)。ClampFISH可以檢測獨特的核酸分子朋其，并允許使用掛鎖式探針王浴，而無需酶的支持。
最近在ISH方面的進(jìn)展引入了一種改進(jìn)信號檢測的新方法梅猿。單分子熒光原位雜交（smFISH）依賴于使用許多短探針氓辣，這些探針針對mRNA轉(zhuǎn)錄物的多個區(qū)域。雖然smFISH不能評估非編碼RNA袱蚓，如許多調(diào)控功能所需的RNA钞啸，因為它的目標(biāo)是核糖體/mRNA的相互作用，但它可以通過直接成像單個RNA分子在單細(xì)胞中提供RNA表達(dá)的空間定位喇潘。通量受限于單細(xì)胞中可同時測量的RNA種類數(shù)量体斩。
osmFISH依賴于一種非條形碼方法，專注于設(shè)計能夠處理大組織區(qū)域和廣泛數(shù)據(jù)集的圖像處理工具颖低。smFISH比scRNA-seq更有效地檢測RNA絮吵，osmFISH結(jié)合了較短的雜交時間和背景降低來獲得高信噪比，從而進(jìn)一步提高了RNA檢測的靈敏度忱屑。osmFISH已被優(yōu)化用于薄組織切片蹬敲。
提高通量和分辨率
MERFISH對smFISH進(jìn)行復(fù)用，并將條形碼分配給單個RNA種類莺戒，這些RNA種類可以依次成像伴嗡，從而實現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。bDNA擴(kuò)增大幅提高了MERFISH的檢測效率从铲，而不增加單個轉(zhuǎn)錄物的熒光斑大小瘪校，現(xiàn)在可以用這種方法研究短RNA。這種方法可產(chǎn)生原位轉(zhuǎn)錄組分析名段，檢測RNA種類>1000種阱扬，并對>100種RNA進(jìn)行誤差校正。
數(shù)字空間分析是Nanostring的一個新平臺伸辟，可以對蛋白質(zhì)或RNA進(jìn)行多重分析（分別為~100倍和~1000倍）价认，能夠進(jìn)行單細(xì)胞分辨率分析。早期測試表明自娩，這將是了解腫瘤微環(huán)境和識別獨特的用踩、預(yù)后性患者生物標(biāo)志物的強(qiáng)大新工具渠退。
傳統(tǒng)的空間測繪依賴于熒光光學(xué)顯微鏡或直接的物理記錄。而DNA microscopy涉及化學(xué)反應(yīng)脐彩，其中轉(zhuǎn)錄分子被隨機(jī)核苷酸原位標(biāo)記碎乃，每一個都被唯一地標(biāo)記。第二個反應(yīng)是放大這些標(biāo)記的分子惠奸，連接拷貝梅誓，并添加新的隨機(jī)核苷酸。雖然高信號強(qiáng)度是熒光成像技術(shù)的一個缺點佛南，但增加了信號密度對DNA microscopy 十分有利梗掰。DNA microscopy 可以作為一種相當(dāng)于光學(xué)分析的成像介質(zhì)，是研究生物系統(tǒng)復(fù)雜化學(xué)動力學(xué)的重要新興手段嗅回。
seqFISH+連續(xù)重組單個載玻片以生成多個圖像及穗，這些圖像可以通過計算合并并分析為一個完整的轉(zhuǎn)錄文庫，減少光學(xué)擁擠的影響绵载。與來自smFISH的60個基因比較埂陆，seqFISH+的檢測效率為49%，與scRNA-seq相比具有較高的靈敏度娃豹。
總之焚虱，空間基因表達(dá)的原位圖譜既能捕獲RNA數(shù)量，又能捕獲位置懂版。它已經(jīng)克服了挑戰(zhàn)鹃栽，以保持效率，信號強(qiáng)度和準(zhǔn)確性躯畴，同時擴(kuò)展到大的基因數(shù)量民鼓。然而，這些方法在其通量和準(zhǔn)確測量基因表達(dá)水平的能力方面仍然有限私股。
基于下一代測序的基因表達(dá)空間解析方法
雖然在高通量下測量精確基因表達(dá)水平的定量方法已經(jīng)被開發(fā)出來摹察，但是當(dāng)分離的細(xì)胞在空間上與原生組織錯位時恩掷，轉(zhuǎn)錄本就失去了空間背景倡鲸。為了實現(xiàn)從空間和定量方法獲得的數(shù)據(jù)中獲益的分析，需要將這兩個數(shù)據(jù)集結(jié)合起來黄娘。
自動化的混合方法
數(shù)學(xué)模型通過將“標(biāo)志性”內(nèi)參基因與轉(zhuǎn)錄計數(shù)聯(lián)系起來峭状，允許空間和定量結(jié)果的整合。例如逼争，Seurat是一種算法优床，通過整合scRNA-seq數(shù)據(jù)和原位表達(dá)模式來推斷細(xì)胞定位。
最近的一種方法分析了84個特征良好的原位基因標(biāo)記誓焦，結(jié)合高通量胆敞、定量的Drop-Seq生成基于計算的算法DistMap，能夠有把握地解析6期果蠅胚胎中87%的細(xì)胞。
STARmap方法有望在單細(xì)胞分辨率條件下在三維空間中進(jìn)行基因表達(dá)檢測移层。STARmap使用條形碼掛鎖探針仍翰，與靶標(biāo)雜交，但通過添加第二個引物观话，針對掛鎖探針旁邊的位點予借，避免了逆轉(zhuǎn)錄（RT）步驟。這種方法避免了cDNA轉(zhuǎn)換的效率障礙频蛔，并通過增加第二個雜交步驟來降低噪音灵迫。
基于組織切片的高通量方法
Tomo-seq自動產(chǎn)生空間分辨率相當(dāng)于原位雜交與RNA-seq的定量強(qiáng)度，將感興趣的組織在三個不同的方向（前后晦溪、背腹和外側(cè)平面）進(jìn)行冷凍切片瀑粥，然后對每個切片進(jìn)行批量RNA-seq。自動應(yīng)用RNA-tomography算法尼变，估計三個切片交匯處的基因表達(dá)水平利凑，創(chuàng)建整個胚胎的數(shù)字三維表達(dá)模式。Tomo-seq有必要使用相同的樣品嫌术，以便在多個軸上準(zhǔn)確地疊加切片哀澈。
一種補(bǔ)充方法即Geo-seq，僅在一個方向上對感興趣的器官或組織進(jìn)行冷凍切片度气。每個切片都是通過激光捕獲顯微解剖取樣割按，產(chǎn)生細(xì)胞簇（每個細(xì)胞簇約10個細(xì)胞），然后對其進(jìn)行大量RNA-seq磷籍。
Spatial transcriptomics是從片段中捕獲空間基因表達(dá)的最小偏差方法适荣。這種方法無需進(jìn)行細(xì)胞分離，能夠檢測到低水平的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)院领，比激光捕獲顯微解剖捕獲到更多的基因和轉(zhuǎn)錄物弛矛，與Tomo-seq和Geo-seq相比，靈敏度和分辨率更高比然。
Slide-seq使用DNA條形碼珠結(jié)合到3毫米的載玻片上丈氓，并將其暴露于釋放mRNA的新鮮組織切片中，從該組織切片中可以通過寡核苷酸連接和檢測進(jìn)行測序來確定條形碼序列强法。在Slide-seq方法發(fā)表后不久万俗，另一種使用更小的條形碼珠子的技術(shù)發(fā)布，命名為高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（HDST）饮怯，它采用2μm的空間條形碼闰歪，并允許組織學(xué)分析。
解析空間基因表達(dá)的計算方法
整合空間和表達(dá)信息
利用非負(fù)矩陣分解回歸(NMFreg)將scRNA-seq數(shù)據(jù)映射到Slide-seq數(shù)據(jù)上蓖墅，將Slide-seq表達(dá)重建為scRNA-seq的細(xì)胞類型特征組合库倘。LIGER是一種從原位轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中對存在于scRNA-seq數(shù)據(jù)中的細(xì)胞進(jìn)行空間定位的計算方法临扮，從而提高原位數(shù)據(jù)的分辨率。Harmony算法將細(xì)胞投射到一個共享的嵌入中教翩，在這個嵌入中公条，細(xì)胞按照細(xì)胞類型而不是數(shù)據(jù)集特定條件進(jìn)行分組，該算法被證明是高效和準(zhǔn)確的迂曲。SpaOTsc利用基因與空間測量來推斷scRNA-seq數(shù)據(jù)的空間特性靶橱。Giotto是一個用戶友好的工作空間，利用細(xì)胞類型特異性基因簽名推斷細(xì)胞類型富集分?jǐn)?shù)路捧，用于下游分析关霸，具有整合空間信息的能力。
僅用于表達(dá)數(shù)據(jù)的從頭空間位置預(yù)測
novoSpaRc是一種最新的基因表達(dá)制圖技術(shù)杰扫，它利用概率優(yōu)化技術(shù)队寇，根據(jù)組織切片上的基因表達(dá)情況進(jìn)行制圖。然而章姓，由于缺乏參考圖譜佳遣，精確性可能低于標(biāo)準(zhǔn)，并且需要一組具有已知表達(dá)模式的先驗標(biāo)記基因凡伊。coMAP是另一種無參考的技術(shù)零渐，它將表達(dá)數(shù)據(jù)在空間上整合到虛擬的潛在空間中。在單細(xì)胞分辨率水平上系忙，CSOmap算法可以部分重建基于配體-受體相互作用的組織空間诵盼。
高通量?native 單細(xì)胞方法
novoSpaRc是一個新的計算框架，它允許對單細(xì)胞基因表達(dá)進(jìn)行新的空間重建银还。novoSpaRc不需要先驗知識风宁，因為該方法將從分離細(xì)胞測序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜作為輸入，然后返回所選形狀的虛擬組織蛹疯，可以查詢數(shù)據(jù)中量化的所有基因的表達(dá)戒财。
NASC-seq是一種新興的顛覆性技術(shù)，它通過對4-硫尿嘧啶(4sU)標(biāo)記反應(yīng)的T-C化學(xué)轉(zhuǎn)換進(jìn)行測序捺弦，同時監(jiān)測新合成的和已存在的RNA饮寞。這可以通過序列分析，在計算上分離羹呵、新舊RNA轉(zhuǎn)錄物骂际，提供單細(xì)胞水平的空間和時間監(jiān)測疗琉。
數(shù)據(jù)可視化和管理
對空間解析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的公共存儲庫有很高的需求冈欢，它允許比較和整合多種來源和分析輸出的分辨率數(shù)據(jù)。三維可視化細(xì)胞圖集的發(fā)展超越了管理數(shù)據(jù)庫的范疇盈简，為詳細(xì)的空間數(shù)據(jù)建模將在研究和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中提供最大的益處凑耻。一些應(yīng)用程序允許高保真成像數(shù)據(jù)集與定量數(shù)據(jù)集成以進(jìn)行完全交互分析太示，例如Virtual Fly Brain、結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和scRNA-seq的人類胚胎心臟圖譜等香浩。來自DistMap的結(jié)果被用來生成果蠅虛擬表達(dá)資源管理器（DVEX）类缤，該數(shù)據(jù)庫是一個在線的可瀏覽數(shù)據(jù)庫，它生成了能夠預(yù)測第6階段胚胎空間分辨表達(dá)模式的虛擬ISHs邻吭。其他3D可視化工具餐弱，如MorphoNet，將有助于整合來自不同平臺或來源的定量信息在同一三維對象上囱晴。
數(shù)據(jù)管理標(biāo)準(zhǔn)
為了促進(jìn)可重復(fù)性膏蚓，迫切需要數(shù)據(jù)存儲、分析和交換的標(biāo)準(zhǔn)畸写，因為與更成熟的測序技術(shù)（如RNA-seq驮瞧、scRNA-seq）相比，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)目前缺乏數(shù)據(jù)管理的共同準(zhǔn)則枯芬。目前空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的大部分分析工具都在GitHub上公開提供论笔，如https://github.com/10XGenomics，https://github.com/SpatialTranscriptomicsResearch千所。此外狂魔，公開預(yù)印本已成為研究界的標(biāo)準(zhǔn)做法（如BioRXiv.org,MedRXiv.org），可以快速傳播方法和結(jié)果淫痰，可以從系統(tǒng)生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)中吸取經(jīng)驗毅臊。
目前，已有多項單細(xì)胞圖譜項目公共資源黑界，為許多模式生物提供了寶貴的信息來源管嬉，包括人類細(xì)胞圖譜和單細(xì)胞斑馬魚轉(zhuǎn)錄組圖譜等±署空間分辨的轉(zhuǎn)錄組學(xué)將是為這些單細(xì)胞圖譜項目增加空間坐標(biāo)的最重要因素蚯撩。整合時間表達(dá)數(shù)據(jù)集將提高對空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的理解。隨著臨床組織學(xué)和病理學(xué)對高效分析流程的需求日益增加烛占，高通量空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)正成為臨床和床旁醫(yī)學(xué)的重要組成部分胎挎，其最終目標(biāo)是生成空間組學(xué)數(shù)據(jù)，其中單個樣本可以進(jìn)行無損分析忆家，以同時揭示時間犹菇、空間和定量數(shù)據(jù)。? ??
首發(fā)公號：國家基因庫大數(shù)據(jù)平臺??
參考文獻(xiàn)
Waylen, L.N., Nim, H.T., Martelotto, L.G.?et al.?From whole-mount to single-cell spatial assessment of gene expression in 3D.?Commun Biol?3,?602 (2020).?
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