南京傲因生物

一根资、傳統(tǒng)流式技術(shù)的困局

“世界上沒有兩片完全相同的葉子”盼樟，這是一個(gè)哲學(xué)問題事格，但也是一個(gè)科學(xué)事實(shí)惕艳。復(fù)雜的生物體由眾多不同類型的細(xì)胞組成，每個(gè)細(xì)胞都是一片 ‘葉子’驹愚，這些細(xì)胞存在非常大的異質(zhì)性远搪；一直以來，流式技術(shù)是分析復(fù)雜細(xì)胞群體的重要手段逢捺，它可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)分析谁鳍，進(jìn)而區(qū)分不同種類的細(xì)胞；其所能檢測(cè)參數(shù)的多少劫瞳，也決定了我們對(duì)于所研究群體異質(zhì)性的深度倘潜。

傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀，其核心原理是基于熒光進(jìn)行檢測(cè)志于，廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域窍荧；但是，由于存在不同熒光基團(tuán)發(fā)射光譜的重疊恨憎，會(huì)造成很強(qiáng)的通道干擾蕊退，使得傳統(tǒng)流式技術(shù)的發(fā)展遇到了瓶頸：

流式通道

其一，熒光的發(fā)射信號(hào)具有較長(zhǎng)的帶寬憔恳，使得有限的流式信號(hào)的檢測(cè)窗口已經(jīng)非常擁擠瓤荔，很難容納新的檢測(cè)通道。目前 BD 最高端的分析型流式細(xì)胞儀具有 20 個(gè)檢測(cè)通道钥组，而實(shí)驗(yàn)室常用的通道數(shù)量一般少于 12個(gè)输硝。
其二，發(fā)射光譜的重疊會(huì)導(dǎo)致通道間的信號(hào)干擾程梦，當(dāng)檢測(cè)通道多于 8 個(gè)時(shí)点把，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和補(bǔ)償計(jì)算已經(jīng)變得相當(dāng)復(fù)雜橘荠，使得多參數(shù)檢測(cè)成為了一項(xiàng)復(fù)雜且費(fèi)時(shí)的技術(shù)性工作。
另外郎逃，一些細(xì)胞存在自發(fā)熒光哥童，在進(jìn)行基于熒光的檢測(cè)中，也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成背景噪音干擾褒翰。

隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的興起贮懈，我們更迫切的要了解細(xì)胞群體內(nèi)部的蛋白表達(dá)的各種變化，對(duì)流式的通道數(shù)量和信號(hào)質(zhì)量有了更高的要求优训。傳統(tǒng)的熒光流式細(xì)胞儀已經(jīng)不能完全滿足科研的需要朵你，需要尋求更好的標(biāo)簽和檢測(cè)系統(tǒng)用于以后的科學(xué)研究。

二 揣非、 流式質(zhì)譜技術(shù)簡(jiǎn)介

流式質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)（Mass Cytometry抡医，也稱CyTOF）是一種將流式細(xì)胞技術(shù)與質(zhì)譜分析技術(shù)結(jié)合在一起的新技術(shù)。這種新的融合技術(shù)能夠在單細(xì)胞水平同時(shí)分析超過50種細(xì)胞參數(shù)早敬，能夠分析的參數(shù)包括蛋白質(zhì)忌傻、核酸甚至小分子。它繼承了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的高速分析的特點(diǎn)搁嗓，又具有質(zhì)譜檢測(cè)的高分辨能力，是流式細(xì)胞技術(shù)一個(gè)新的發(fā)展方向箱靴。

技術(shù)原理

質(zhì)譜流式原理如下圖所示腺逛，它采用金屬同位素標(biāo)記的特異性抗體來標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部蛋白，標(biāo)記好的細(xì)胞通過流式細(xì)胞技術(shù)被分離成單個(gè)細(xì)胞并依次進(jìn)入等離子體炬進(jìn)行離子化衡怀，單細(xì)胞形成的離子云被送入飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）棍矛，檢測(cè)出每個(gè)細(xì)胞上各種金屬標(biāo)簽的精確含量，得到單細(xì)胞的質(zhì)譜數(shù)據(jù)抛杨，最后够委，這些數(shù)據(jù)會(huì)被轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)的流式數(shù)據(jù)。

流式質(zhì)譜技術(shù)原理.jpg

技術(shù)流程

單細(xì)胞懸液的制備-染色-上機(jī)-分析（結(jié)合臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)怖现，以及生物學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的不同研究目的和茁帽，可以基于質(zhì)譜流式產(chǎn)生的高維數(shù)據(jù)進(jìn)行高級(jí)統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)可視化）

技術(shù)流程.png

金屬抗體

質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)的主要?jiǎng)?chuàng)新之一是使用金屬元素及其同位素作為抗體標(biāo)簽，常用標(biāo)簽有稀土元素屈嗤、惰性元素和后過渡金屬潘拨。所選的同位素是無毒性、非放射性的穩(wěn)定同位素饶号。使用這些元素的優(yōu)點(diǎn)是：1）在細(xì)胞內(nèi)含量少铁追，不會(huì)引起高的背景噪音干擾。而熒光流式會(huì)面臨樣本自發(fā)熒光的干擾茫船；2）不會(huì)影響細(xì)胞正常的生理功能琅束；3）ICP質(zhì)譜裝置分辨率高扭屁，彼此信號(hào)無干擾，無需通過計(jì)算補(bǔ)償涩禀。

金屬標(biāo)簽.png

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

第一料滥、通道數(shù)量增加到上百個(gè)
質(zhì)譜流式細(xì)胞儀中的ICP質(zhì)譜裝置具有非常寬的原子量檢測(cè)范圍（88～210Da），因此可以同時(shí)檢測(cè)上百個(gè)不同的參數(shù)埋泵。

第二幔欧、通道間無干擾，無需計(jì)算補(bǔ)償
ICP質(zhì)譜具有超高的分辨能力丽声，可以完全區(qū)分開用來標(biāo)記的各種元素礁蔗。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，其相鄰?fù)ǖ篱g的干擾<0.3%雁社，基本可以忽略不計(jì)浴井，無需計(jì)算補(bǔ)償。這樣不僅使實(shí)驗(yàn)流程得到簡(jiǎn)化霉撵，也節(jié)約了標(biāo)本和試劑磺浙。

第三、金屬標(biāo)簽數(shù)量多徒坡，并具有極低的背景
用來作為標(biāo)簽的金屬元素在細(xì)胞中的含量極低撕氧，而金屬標(biāo)簽與細(xì)胞組分的非特異性結(jié)合能力極低，所以信號(hào)的背景極低喇完。目前用來標(biāo)記抗體的金屬標(biāo)簽有30多種伦泥，隨著技術(shù)進(jìn)步，更多元素可以用來作為標(biāo)簽锦溪，其種類會(huì)進(jìn)一步增加不脯。

第四、多樣化的數(shù)據(jù)處理方式刻诊，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的深入分析防楷。
質(zhì)譜流式細(xì)胞儀通道數(shù)量的激增帶來信息量的成倍增長(zhǎng)。傳統(tǒng)的流式分析方法已經(jīng)不能完全滿足需要则涯，所以需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行各種降維處理复局，提取出其中包含的有用的生物學(xué)信息。常用的分析方法有：SPADE粟判、PCA肖揣、viSNE以及Gemstone等。

總體來說浮入，傳統(tǒng)流式細(xì)胞技術(shù)和質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)相比龙优，主要有兩點(diǎn)不同：第一、標(biāo)簽系統(tǒng)的不同，前者主要使用各種熒光基團(tuán)作為抗體的標(biāo)簽彤断，后者則使用各種金屬元素作為標(biāo)簽野舶；第二、檢測(cè)系統(tǒng)的不同宰衙，前者使用激光器和光電倍增管作為檢測(cè)手段平道，而后者使用ICP質(zhì)譜技術(shù)作為檢測(cè)手段。熒光基團(tuán)發(fā)射光譜一般比較寬供炼，其間往往會(huì)發(fā)生重疊一屋，會(huì)帶來一些問題：一方面限制了檢測(cè)通道的數(shù)量（<20個(gè)）；另一方面袋哼，它會(huì)帶來嚴(yán)重的串色問題冀墨，很多通道的信號(hào)需要復(fù)雜的補(bǔ)償計(jì)算。

質(zhì)譜流式應(yīng)用

質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)通過測(cè)量蛋白質(zhì)的量以及修飾狀態(tài)涛贯，從而依據(jù)特定蛋白類型鑒定細(xì)胞類型或者依據(jù)可發(fā)揮功能的修飾過的蛋白類型研究細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程（如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）等诽嘉，在臨床上配合分型診斷以及預(yù)后預(yù)測(cè)。

基礎(chǔ)科研應(yīng)用

1.1細(xì)胞分型

通常通過檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白種類可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類弟翘。來自斯坦福大學(xué)的Sean C. Bendall等人于2011年使用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞34個(gè)參數(shù)虫腋。首先通過檢測(cè)常規(guī)使用的蛋白，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分型稀余，得到B細(xì)胞悦冀，NKT細(xì)胞，CD8+ T細(xì)胞等[1]睛琳。

圖1.jpg

1.2信號(hào)通路

為了分析人體組織中單細(xì)胞水平的信號(hào)傳導(dǎo)盒蟆，研究人員利用 CYTOF 技術(shù)對(duì)臨床上收集的福爾馬林固定、石蠟包埋的正常及患者腸道標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比分析掸掏，發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)胞茁影、杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α的差異信號(hào)宙帝，表明下游 RAS-RAF-MEK 途徑?jīng)Q定杯狀細(xì)胞的特性[2]丧凤。

圖2.jpg

臨床科研應(yīng)用

1. 尋找與疾病發(fā)生、發(fā)展步脓、復(fù)發(fā)相關(guān)的生物標(biāo)志物（早期診斷愿待、伴隨診斷、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)）靴患。
2. 免疫系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)仍侥，尋找與臨床結(jié)果相關(guān)的生物標(biāo)志物（治療有效人群篩選、藥效分析鸳君、預(yù)后評(píng)估）农渊。
3. 輔助進(jìn)行疾病分型、分級(jí)或颊。

4. 特定人群砸紊、部位的免疫特征分析（如孕婦传于、胎兒、腸道等）醉顽。

   
   
   圖3.jpg

已預(yù)后評(píng)估為例沼溜，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院梁廷波教授分析肝癌（HCC）樣本與正常組織樣本的免疫微環(huán)境差異顯著，而8個(gè)HCC患者之間的差異也很大游添。根據(jù)差異基因表達(dá)聚類出3個(gè)亞型系草，這些亞型的免疫細(xì)胞組成差異較大。簡(jiǎn)單的說唆涝，亞型2 的特征是較低的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)找都，以及較高的樹突細(xì)胞與NK細(xì)胞組成。亞型3中Treg石抡、Breg以及M2極化巨噬細(xì)胞較多檐嚣，這些細(xì)胞都是免疫抑制細(xì)胞。亞型1具有正常的T細(xì)胞浸潤(rùn)水平啰扛，但是B細(xì)胞浸潤(rùn)水平較差嚎京。從PD-1, PD-L1, CTLA-4以及Tim-1的表達(dá)上看，這些免疫抑制分子在亞型3中表達(dá)上調(diào)隐解。根據(jù)免疫細(xì)胞功能與分布鞍帝，我們將亞型1、2煞茫、3定義為免疫能力型帕涌、免疫缺陷型、以及免疫抑制型续徽。根據(jù)免疫組分與免疫功能蚓曼，作者將HCC分為三個(gè)亞型。這些亞型有著獨(dú)特的代謝特征與細(xì)胞因子表達(dá)钦扭，或可被用于患者的預(yù)后評(píng)估[3]纫版。

圖4.jpg

常用的金屬抗體Panel

圖5.jpg

圖6.jpg

【參考文獻(xiàn)】

1. Bendall & Simonds et al., Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science , 2011, 332: 687-96.
2. Simmons, A.J., et al., Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling,2016, 9(449): 11.
3. Zhang Qi, et al., Integrated multiomic analysis reveals comprehensive tumour heterogeneity and novel immunophenotypic classification in hepatocellular carcinomas.Gut, 2019, 68: 2019-2031.