板塊“如何發(fā)高分”代號“Masterpiece”（杰作）旨在以圖講文，讓大家更快速更直觀的了解每篇高分文獻的“閃光點”亭敢。
文獻信息
【文章標題】Single-cell sequencing of human midbrain reveals glial activation and a Parkinson-specific neuronal state
【發(fā)表雜志】Brain（IF：15.255）
【發(fā)表時間】2022年4月
【應(yīng)用技術(shù)】10x Genomics snRNA-seq
【關(guān)? 鍵? 詞】帕金森疾病（Parkinson’s disease）慎皱，小神經(jīng)膠質(zhì)細胞（Microglia）署惯，中腦黑質(zhì)（Midbrain substantia nigra），神經(jīng)退行性疾苍始帷（Neurodegenerative diseases）
閃光點
1、 通過特發(fā)性帕金森中腦組織單核細胞測序蛾号，形成第一個單核RNA測序數(shù)據(jù)集稠项，細胞注釋發(fā)現(xiàn)只在疾病組中存在的代表功能失調(diào)多巴胺能神經(jīng)元的細胞群。
2须教、 通過帕金森患者和對照的分析皿渗，發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的疾病特異性增加及少突膠質(zhì)細胞的缺失，擬時分析發(fā)現(xiàn)對錯誤折疊蛋白的應(yīng)激反應(yīng)是帕金森炎癥信號的主要觸發(fā)條件轻腺。
3乐疆、 結(jié)合帕金森GWAS數(shù)據(jù)和具有細胞類型特異性的基因表達模式，分析帕金森風險變異基因的富集情況贬养，將帕金森患病風險與中腦組織中的細胞類型聯(lián)系起來挤土。
方法與結(jié)論
樣本：特發(fā)性帕金森患者和對照樣本的死后中腦組織樣本
亮點解析
帕金森病是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，超過20種基因的突變與該疾病有關(guān)误算。迄今為止仰美，全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定了90個獨立的風險相關(guān)變異，然而這些變異在疾病發(fā)展中的相關(guān)作用并不明晰[1-2]儿礼。同時以往的研究大都基于 bulk 水平的轉(zhuǎn)錄組咖杂，或者基于激光捕獲顯微解剖的多巴胺能神經(jīng)元細胞分析，未能解開與帕金森疾病相關(guān)的不同細胞類型特異性貢獻蚊夫。因此在疾病研究中诉字，單細胞測序可以增加我們從不同類型細胞貢獻對疾病影響進行分析的角度[3]。
發(fā)現(xiàn)新的細胞類型如何判斷來源和注釋
對 5 例特發(fā)性帕金森患者和 6 例對照樣本的死后中腦組織樣本進行單核 RNA 測序，通過細胞注釋得到 12 個細胞群壤圃，其中除了通過基因表達標記的常見細胞類型外陵霉，作者發(fā)現(xiàn)了一個由 120 個細胞組成的神經(jīng)元細胞群，其特征為高表達 CADPS2 基因伍绳，但無法根據(jù)已知的標記基因?qū)ζ溥M行注釋踊挠。并且有意思的是，這些CADPS2high?細胞幾乎全部來源于帕金森患者組（圖1）冲杀。
為了對這群細胞進行注釋效床，首先對基因表達做了分析。這些神經(jīng)元細胞除了 TH 基因表達較低外漠趁，表現(xiàn)出與多巴胺能細胞相似的特征（圖2）扁凛。此外，CADPS2high?細胞表達的 TIAM1 水平甚至高于多巴胺能細胞闯传。TIAM1 已被確定為 Wnt/Dvl/Rac1 通路的調(diào)節(jié)因子，該通路控制中腦多巴胺能細胞分化卤妒。因此甥绿，作者推斷 CADPS2high 細胞可能是退化的多巴胺能細胞。
進一步则披，作者用樣本冷凍中腦組織切片進行激光捕獲顯微解剖（Laser-capture microdissection）共缕，包括用于單細胞測序的 1 例患者樣本和 1 例對照，以及4例先前沒有進行過研究的 4 例患者樣本和 4 例對照士复。從每個樣本中图谷，分離出 150 個含神經(jīng)黑色素的神經(jīng)元（Neuromelanin-containing neurons），通過數(shù)字 PCR 對其進行 CADPS2 基因表達分析阱洪，其中β -肌動蛋白作為 house keeping 基因便贵。該實驗表明，與具有神經(jīng)黑色素沉積的對照組多巴胺能細胞相比冗荸，帕金森組的 CADPS2 與β -肌動蛋白比例明顯更高承璃，表明 CADPS2 高的細胞確實是多巴胺能來源的（圖3）。
從不同細胞類型基因表達探究對帕金森疾病的影響
通過帕金森組和對照組中不同細胞亞群的比較蚌本，發(fā)現(xiàn)帕金森病中腦中盔粹，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的比例增加，少突膠質(zhì)細胞的比例減少程癌。進一步舷嗡，對這些有比例變化的細胞進行再分群。
以小膠質(zhì)細胞為例嵌莉，文章鑒定了七個小膠質(zhì)細胞亞群进萄，這些亞群以高表達基因進行標記。對由 P2RY12、GPNMB 和 HSP90AA1 高表達定義的三個細胞數(shù)量最多的亞群進行擬時分析垮斯。結(jié)果顯示小膠質(zhì)細胞的激活軌跡從 P2RY12high?細胞跨越到兩個激活分支郎仆，一個包含 GPNMBhigh 細胞，另一個包含高表達 HSP90AA1 或 IL1B 的細胞（圖4）兜蠕。
進一步扰肌，分析小膠質(zhì)細胞激活軌跡中相關(guān)的變化基因，GO 分析顯示功能富集于細胞因子分泌和對未折疊蛋白通路的應(yīng)激反應(yīng)熊杨。為了與帕金森疾病關(guān)聯(lián)曙旭，作者將軌跡相關(guān)基因與帕金森組差異上調(diào)基因取了交集，鑒定出 29 個與特發(fā)性帕金森病中腦小膠質(zhì)細胞差異激活相關(guān)的基因晶府。文章同時對星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞做了類似的分析桂躏。
單細胞基因表達與疾病風險變異結(jié)合分析
為了深入了解帕金森病相關(guān)遺傳變異如何影響中腦細胞，文章對中腦細胞特異性表達基因與帕金森病相關(guān)遺傳變異進行了富集分析川陆。首先將以往GWAS研究中得到的相關(guān)基因標記到參考基因組上剂习，使用MAGMA基因集分析，對每種細胞類型中的差異表達基因或細胞類型特異性表達基因進行分析[4]较沪。
結(jié)果顯示鳞绕，帕金森病風險變異與小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元尸曼、星形膠質(zhì)細胞和少突前體細胞顯著相關(guān)们何。在GO、KEGG和Reactome分析中控轿，發(fā)現(xiàn)了多巴胺能細胞中的“磷酸化”和“激酶活性”以及小膠質(zhì)細胞中的“NLRP3炎性體復(fù)合物”等富集冤竹，支持了炎癥信號在帕金森中的作用（圖5）。
詳細解析
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參考文獻
[1]BlauwendraatC, Nalls MA, Singleton AB. The genetic architecture of Parkinson's disease.?Lancet Neurol. 2020;19(2):170-178. doi:10.1016/S1474-4422(19)30287-X
[2] Corces MR, Shcherbina A, Kundu S, et al.Single-cell epigenomic analyses implicate candidate causal variants atinherited risk loci for Alzheimer's and Parkinson's diseases.?Nat Genet. 2020;52(11):1158-1168. doi:10.1038/s41588-020-00721-x
[3] Smaji? S, Prada-Medina CA, Landoulsi Z, etal. Single-cell sequencing of human midbrain reveals glial activation and aParkinson-specific neuronal state.?Brain. 2022;145(3):964-978. doi:10.1093/brain/awab446
[4]deLeeuw CA, Mooij JM, Heskes T, Posthuma D. MAGMA: generalized gene-set analysisof GWAS data.?PLoS Comput?Biol. 2015;11(4):e1004219. Published 2015 Apr 17.doi:10.1371/journal.pcbi.1004219
