細胞毒性T淋巴細胞（CTL）是機體抗腫瘤和抗病毒感染的關鍵效應細胞，CTL通過T細胞受體（TCR）特異識別靶細胞表面MHC-I 與抗原多肽形成的復合物亩歹，進而釋放穿孔素、顆粒酶等生物活性物質對靶細胞進行溶解凡橱。鑒于CTL在治療腫瘤和病毒性疾病中的潛在作用小作，對CTL的基礎與應用研究備受關注，大多研究集中于對TCR基因的改造稼钩。隨著分子生物學的發(fā)展顾稀，TCR基因克隆、轉導技術已較成熟坝撑，研究方向主要是如何保證TCR基因高效静秆、正確表達組裝成為具生物活性的分子粮揉。

機體免疫防御主要由體液免疫與細胞免疫兩大系統(tǒng)構成，其中以CD8+Ｔ淋巴細胞介導的細胞免疫在抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用抚笔。CD8+Ｔ從靜息性T細胞活化為具有特異殺瘤作用的細胞毒性Ｔ淋巴 細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)經過如下3個關鍵步驟：第一步是抗原加工與提呈扶认，主要由專職抗原提呈細胞樹突狀細胞（dendritic cell, DC)負責; 第二步是識別與活化，CD8+ T細胞通過其表達的T細胞受體(T cell receptot, TCR)特異識別DC提呈的ＭＨC-Ⅰ-多肽復合物殊橙，接受T細胞活化的第一信號辐宾，DC表面豐富的免疫共刺激分子給予T細胞活化的第二信號;第三步是識別與殺傷，活化的CTL通過TCR特異識別瘤細胞表面MHC-1-多肽復合物膨蛮，釋放穿孔素和顆粒酶等生物活性物質溶解瘤細胞叠纹，或通過Fas-FasL途徑誘導瘤細胞凋亡。CTL的TCR對腫瘤抗原的識別是發(fā)揮其效應的基礎敞葛，抗原識別的特異性取決于TCR結構的多肽性誉察。越來越多的研究小組利用現代分子生物學技術克隆能識別特定抗原表位的TCR基因，構建TCR基因病毒載體再轉染外周CD8+ T細胞制肮，將之修飾成為能識別特定靶抗原的CTL冒窍。體外大規(guī)模擴增經TCR基因修飾的CTL，將為腫瘤及傳染性疾病提供新型豺鼻、特異的治療手段。

1. TCR結構

TCR是T細胞表面能夠特異性識別抗原表位和介導免疫應答的分子款慨，TCR的多態(tài)鏈依編碼基因不同命名為α儒飒、β、γ檩奠、δ鏈桩了，分別形成αβTCR和γδTCR。 人外周血中約95%為γδTCR埠戳，約5%為αβTCR井誉。

TCR分子是由兩條糖基肽鏈通過二硫鍵組成的異二聚體。所有α整胃、β颗圣、γ、δTCR肽鏈均可分為胞外屁使、 跨膜(TM)和胞質(Cy)3部分在岂。胞外部分又分為可變區(qū)（V）、高變區(qū)（D）蛮寂、結合區(qū)（J）和恒定區(qū)（C）蔽午。α鏈 由V、J酬蹋、C基因編碼及老，β鏈由V抽莱、D、J骄恶、C基因編碼食铐。兩鏈不同區(qū)域等位基因的重排決定了TCR的多態(tài)性，賦予了T細胞識別不同抗原的巨大潛力叠蝇。TCRα和β肽鏈可變區(qū)存在4個氨基酸高變區(qū)（hypervariable region, HVR）璃岳，亦稱互補決定區(qū)（complementarity determining region, CDR），其中CDR1悔捶、CDR2铃慷，CDR3又稱為超變區(qū)，是抗原特異性結合部位蜕该。TCR多態(tài)性主要由CDR3決定犁柜。

2. TCR基因克隆

克隆TCR基因的關鍵是分離到具有高親和力的識別抗原肽的T細胞克隆。已經有多個課題組利用不同技術從不同來源獲得CTL克隆堂淡。Morgan等從黑色素瘤患者的腫瘤浸潤性淋巴細胞中分離出能識 別MART-1抗原表位的T細胞克隆馋缅。Zhang等從慢性丙型肝炎患者外周血中分離得到HCV特異性的CTL克隆。Morgan等運用HLA-A2限制性多肽體外致敏預先免疫該多肽患者的外周血淋巴細胞 （peripheral blood lymphocyte, PBL）绢淀，然后用有限稀釋法獲得CTL克隆萤悴。Varela-Rohena等運用噬菌體展示技術分離抗原特異性TCR。利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）皆的、反轉錄PCR （reverse transcription PCR覆履，RT-PCR）技術克隆上述TCRα、β鏈全長基因费薄。利用基因掃描技術對TCR CDR3區(qū)域進行分析硝全，了解其可能存在的亞家族。 Meyerhuber等運用此方法從HER2(369-377)特異性CTL中成功克隆了TCR基因楞抡。

3. TCR基因轉移載體

3.1 逆轉錄病毒載體

目前在TCR基因轉染過程中報道較多的是運用逆轉錄病毒載體伟众。逆轉錄病毒載體有多方面優(yōu)勢，感染細胞范圍廣召廷，不僅適用于單層培養(yǎng)的細胞凳厢，而且適用于懸浮培養(yǎng)的淋巴細胞;機體對載體產生的免疫反 應較低，在宿主內可以穩(wěn)定遺傳;往往以低拷貝整合柱恤，避免了基因重排;經特殊構建的反轉錄病毒載體是缺陷型的数初，比較安全;選擇不同的外殼蛋白進行包裝，可賦予病毒特定的宿主選擇性梗顺，從而達到靶向導入的目的泡孩。

Morgan等從黑色素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）中獲得能識別 MART-1抗原表位的CTL克隆寺谤，從中克隆到TCR基因仑鸥，利用逆轉錄病毒載體將該基因轉導入至人外周血 T淋巴細胞吮播，經體外擴增后治療17例Ⅳ期黑色素瘤患者，15例患者在治療2個月后循環(huán)T細胞數量至少增加了10％眼俊，2例患者病情得到控制意狠，在18個月內未復發(fā)。Parkhurst等將癌胚抗原（carcino-embry-onic antigen, CEA）特異性TCR構建入逆轉錄病毒載體轉導人外周血淋巴細胞疮胖，在TCRα鏈CDR3區(qū)域引入單核苷酸突變环戈，增強了TCR的親和性。臨床試驗對3例轉移性結直腸癌患者進行治療澎灸，結果所有病例血清CAE水平均有所下降（74％~99％）院塞。

目前較常用的逆轉錄病毒載體為Moloney小鼠白血病病毒改構的各類逆轉錄病毒載體，理論上它能轉染幾乎100％的靶細胞性昭，但實際的轉染效率遠低于此拦止。近年來人們通過各種改良方法不斷提高逆轉錄 病毒載體轉染效率。Yang等運用高速離心法濃縮病毒糜颠，4℃汹族，6000rpm，過夜其兴，可使病毒滴度提高50~100倍顶瞒，進而提高轉染效率。研究人員利用逆轉錄病毒載體將TCRαβ基因轉導人初始T細胞,發(fā)現在相同的病毒滴度下元旬，以骨髓瘤病毒（myeloproliferative sarcoma virus,MPSV）或鼠干細胞病毒（murine stem cell virus, MSCV）為基礎載體比以小鼠白血病病毒（murine leukaemia virus, MLV）為基礎的載體有高轉染效率和高TCR表達搁拙。

改良的逆轉錄病毒載體已被多個研究組用于不同腫瘤相關抗原特異性TCR基因轉移中。但逆轉錄病毒只能感染分裂期細胞法绵，容納外源基因的DNA片段長度不超過8000bp，病毒滴度低酪碘，有的反轉錄病毒可能具有激活癌基因的危險朋譬。

3.2 慢病毒載體

慢病毒載體其優(yōu)點在于可有效轉染分裂和未分裂細胞;能穩(wěn)定整合到靶細胞的基因組中;可轉移約 8000~10000bp基因片段;能持久穩(wěn)定表達外源基因，不易導致基因沉默;沒有整合位點偏好性兴垦。

Yang等將識別MART-1和gp100的TCR基因重組入VSV-G假型第3代慢病毒載體徙赢，轉染外周T細胞，轉染細胞出現了特異性抗瘤活性探越，包括釋放γ干擾素和溶解瘤細胞狡赐。2010年該課題組運用CD3抗體和PBL飼養(yǎng)細胞預刺激T細胞，明顯提高Ｔ細 胞轉染效率钦幔，12 d內CD8+ T細胞數量擴增達600倍枕屉，且具有特異性殺傷活性和記憶性。Stauss等對比逆轉錄病毒載體與慢病毒載體轉移WT-1特異性TCR研究表明鲤氢，慢病毒載體相對比較安全搀擂，可獲得較高轉染效率西潘。Canderan等設計了雜合非小細胞肺癌特異性TCR，該TCR是由人TCRV區(qū)和鼠TCRC區(qū)嵌合而成哨颂，后將該TCR構建入慢病毒載體轉導T 細胞前體喷市，產生特異性CD4＋ CD8＋可穩(wěn)定表達雜合TCR，T細胞體外增殖良好威恼，并可特異性識別非小細胞肺癌品姓。雖然慢病毒載體有較多優(yōu)勢，但存在有毒力恢復箫措、垂直感染等潛在的安全隱患腹备，仍需要臨床更多的深入研究。

3.3 非病毒載體系統(tǒng)

將外源基因直接用理化方法轉導入靶細胞蒂破。常用的轉導方法有電穿孔技術馏谨、磷酸鈣共沉淀法、脂質體介導法附迷、顯微注射法等惧互，其對外源基因片段大小無要求，安全性很高喇伯，但轉染效率很低喊儡。

TCR基因轉染的載體主要還是病毒載體，但研究人員一直都在嘗試尋找更理想載體系統(tǒng)稻据。值得一 提的是艾猜，“睡美人”（sleeping beauty, SB）轉座子系統(tǒng)已被應用于TCR基因轉移過程中，Peng等報道捻悯， 該方法TCR轉導效率可與病毒載體相媲美匆赃，但該系統(tǒng)缺陷在于存在整合位點偏好性，這將是其應用于臨床前亟待解決的問題今缚。

4. TCR基因表達

研究人員將TCRα和β兩條鏈分別構建入兩個獨立病毒載體中算柳，因為編碼CR單鏈基因的小病毒載體容易包裝，可獲得較高的病毒滴度姓言。但為了得到功能性的TCR瞬项，含有α和β兩條鏈的兩個病毒顆粒必 須同時轉染同一個T細胞。這種雙感染容易增加插入突變的風險何荚，此外囱淋，引入TCR單鏈易形成內源與外源TCR鏈的雜合體。Dossett等用不同的啟動子來調控TCR兩條鏈的表達餐塘，其中TCRα鏈受控于一 個長末端重復序列（long terminal repeat, LTR）元件妥衣，該元件也驅動報告基因neo的表達，TCRβ鏈的表達由雜合HTLV-I/SV40啟動子SRα來驅動。該方法易受啟動子的干擾称鳞，導致TCR表達下調涮较。Wang等將HC/2G-1 TCR兩條鏈由一個內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site, IRES）原件連接，在一般啟動子啟動下作為一個單一轉錄盒來表達冈止。IRES原件可以保證TCR兩條鏈同時表達狂票，但IRES5′端基因通常較3′端基因表達量高，會導致突變的發(fā)生熙暴。 Chinnasamy等將TCR基因兩條鏈通過一個源自 微小RNA病毒的肽原件2A（2A peptide, p2A）來進行連接闺属。這種連接方式可以產生一條單一的編碼TCRα和β鏈的ｍRNA。翻譯時周霉，核糖體可跳過2A肽序列掂器，從而產生兩條單獨的肽鏈：TCRα-2A融合蛋白和甘氨酸TCRβ，這種連接方式可以等量表達TCRα和β鏈俱箱，此外肽序列要比IRES原件短国瓮，構建的病毒載體較小，容易包裝狞谱，可獲得較高病毒滴度乃摹。

5. 影響TCR基因正確表達與表達效率的因素

TCR組裝和表達是一個復雜的過程，在細胞表面進行表達之前跟衅，TCRα鏈和β鏈首先形成異源二聚體寇壳，然后與CD3復合物在內質網結合俗冻，最終TCR CD3復合物由內質網釋放后轉移至細胞膜，在這個過程中會有諸多因素影響TCR的表達效率论皆。

5.1 TCRα和β鏈密碼子優(yōu)化

密碼子優(yōu)化是指用人類基因組中常見的同義密碼子置換非常見密碼子挺庞。已有證據表明病附，密碼子優(yōu)化的TCR基因在轉導T細胞中表達水平比野生型TCR基因有所提高冤今，從而增強其體內功能经宏。但是，密碼子優(yōu)化可能產生免疫源性TCR雇初，此過程也可能會伴隨多肽序列的改變產生另一種開放讀碼框雾狈，有一定風險。

5.2 TCRα和β鏈載體配置

TCR基因轉移載體構建時最好使用單病毒載體抵皱，可以同時編碼TCRα鏈和β鏈，這樣可以防止插入突變和轉導T細胞僅表達引入的1條鏈辩蛋，可以減少引入鏈與相應內源性TCR鏈誤配的風險呻畸。如果存在TCR其中1條鏈供應不足的情況，會削弱TCR異源二聚體的聚合細胞表面表達悼院。近年來伤为，研究人員運用IRES序列或者P2A，連接TCRα鏈和β鏈構建載體，很大程度上克服了載體配置造成的兩條鏈表達不均衡的問題绞愚。

5.3 外源性與內源性TCR對CD3的競爭

有效的細胞表面TCR表達需要穩(wěn)定的TCR CD3復合體構建叙甸。沒有CD3的情況下，TCR不能聚合而被降解位衩。因此向T細胞內引入外源性TCR時裆蒸，CD3分子的存在是主要限速步驟。競爭可降低引入性TCR細胞表面表達糖驴。 引入性TCR的表達水平通常比內源性TCR低僚祷，內源性TCR可以削弱轉導T細胞對低濃度TCR識別抗原的反應活性，這一結果驗證了引進TCR與內源性TCR競爭有限的CD3分子贮缕。 Sachiko等通過小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的表達使內源性TCR沉默以提高外源性TCR基因的表達和活性辙谜。最近研究表明，帶有編碼TCR α和β鏈基因載體與另一個編碼CD3γ感昼、δ装哆、ε、ζ基因的載體進行雙重轉導CD8+T細胞定嗓，可以提高CD8+T細胞活性蜕琴。

5.4 外源性與內源性TCRα和β鏈的誤配

有研究表明單獨α或β鏈轉導Ｔ淋巴細胞可導致外源性TCR鏈和內源性TCR鏈混合二聚體的形成。外源性TCRα或β鏈與內源性TCRα或β鏈的誤配導致目標TCR自身配對減少蜕乡，從而影響TCR的親和性奸绷。此外，誤配二聚體的形成可能會導致自身免疫反應等安全問題层玲。Thomas等將TCR恒定區(qū)鼠源化号醉，或進行半胱氨酸修飾產生分子間二硫鍵，發(fā)現均可提高外源性TCRα和β鏈的正確配對辛块。 Voss等在TCRα和β鏈恒定區(qū)插入一對相互作用氨基酸畔派，改變TCR恒定區(qū)二級結構（從“knob-into-hole”構象變?yōu)椤癶ole-into-knob”）來提高兩條鏈的正確配對。

6. 結語

盡管目前TCR基因修飾CTL的基礎與臨床研究均取得較好進展润绵，但仍存在一些問題线椰，如功能性TCR的正確表達、TCR表達效率尘盼、TCR基因修飾CTL的親和力與體內有效性和存活時間憨愉、臨床安全性等均需要深入研究。