最近在看單細胞方面的文獻，總是時不時的出現(xiàn)流式細胞儀細胞術(shù)（FCM）的圖收苏，比如紐
約大學醫(yī)學院在Nature上發(fā)表了題為“The?bone?marrowmicroenvironment?at?single-cell?resolution”的文章,解析了單細胞分辨率下的單細胞測序下的骨髓微環(huán)境
又比如北京大學張澤民課題組在Cell發(fā)表的關(guān)于單細胞測序刻畫肝癌免疫微環(huán)境動態(tài)特征的研究《Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma》
還比如
耶魯大學研究人員在Nature發(fā)表的采用流式細胞術(shù)與高通量單細胞免疫組庫測序技術(shù)研究生殖道抗病毒感染的機制《Migrant memory B cells secrete luminal antibody in the vagina》亿卤。
發(fā)現(xiàn)流式細胞術(shù)（FCM）總是和高分文章相伴相隨。而在google搜索Single cell的時候也總是出現(xiàn)流式細胞儀相關(guān)的介紹鹿霸。那么流式細胞儀細胞術(shù)FCM到底是什么排吴？它對于我們做單細胞方面的研究到底有哪些幫助呢？我們到底怎樣解讀流式細胞儀的結(jié)果呢懦鼠？這一切的答案都要求我們對流式細胞儀有一個基本的了解钻哩。
首先看一下流式細胞對我們做單細胞方面有哪些幫助：
針對與Droplet-based的單細胞技術(shù)，通過流式分選做進階式的研究肛冶，不僅讓單細胞測序更有深度街氢，還可以對高通量測序繪制的細胞圖譜進行輔助驗證，還有一大優(yōu)勢是對死細胞進行過濾有助于減少樣本中死細胞的比例睦袖，提高實驗的成功率珊肃。
流式細胞儀細胞術(shù)簡單來說是一種利用流式細胞儀快速精確對細胞等生物粒子的理化及生物學特性（細胞大小、DNA/RNA含量馅笙、細胞表面抗原表達等）進行定量分析和分選的新技術(shù)（如下圖）：
FCM在細胞生物學伦乔、腫瘤學、免疫學的單細胞水平的研究中有著極其重要的作用董习。比如僅僅根據(jù)流式細胞儀前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）就可以區(qū)分外周血中的淋巴細胞（Lymphocytes）,單核細胞(Monocytes),中性粒細胞(neutrophil)烈和。
還比如免疫發(fā)生異常時會導(dǎo)致機體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化。FCM可以同時檢測一種或幾種淋巴細胞表面抗原阱飘，將不同的淋巴細胞亞群區(qū)分開來斥杜，并計算出它們相互間的比例，通過對病人淋巴細胞各亞群數(shù)量的測定來監(jiān)控病人的免疫狀態(tài)沥匈，并指導(dǎo)治療）蔗喂。例如下圖淋巴細胞的檢測，CD4（輔助T細胞表面抗原受體）高帖，CD8（殺傷性T細胞表面抗原受體）雙陽性的細胞比例由80.5%變成了60.6%缰儿，CD8 陽性細胞群比例由4.63%變成了5.92%，CD4陽性細胞群比例由10.9%變成了15.7%
知道了FCM是研究單細胞的利器散址，那么讓我們來簡單的看一下FCM的原理乖阵。
FCM是流式細胞儀根據(jù)細胞的特性宣赔，將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺罱K轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號（如下圖）
而光信號的核心在于前向散射光FSC和側(cè)向散射光SSC（如下圖）
在實驗中常常采用FSC和SSC來區(qū)分細胞群體瞪浸，并去除碎片儒将，死細胞，粘連細胞的干擾对蒲，以及用藥前后細胞的變化钩蚊。
此外另一個核心是免疫標記技術(shù)（immunolabelling technique）
免疫標記技術(shù)是指用熒光素，放射性同位素蹈矮，酶砰逻，發(fā)光劑或者電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標記抗體或者抗原進行的抗原抗體反應(yīng)泛鸟。能夠檢測以下幾種熒光信號：
??????FL1(第一熒光)：FITC
????FL2（第二熒光）：PE
? ? FL3（第三熒光）：PerCp蝠咆，PeCy5等
????PL4（第四熒光）：APC
例如nature 爆文《通過單態(tài)性MHC I類相關(guān)蛋白MR1可實現(xiàn)普遍性T細胞腫瘤靶向》
就對CD3采用PerCp染色，對CD4采用APC進行染色北滥，發(fā)現(xiàn)了一類神奇的T細胞系MC.7.G5刚操，它在一種肺癌細胞系—-A549細胞的刺激下能夠發(fā)生增殖（如下圖比例從2.5%變成了18%），說明這個T細胞克隆能夠識別A549腫瘤細胞并產(chǎn)生反應(yīng)再芋。
簡單的介紹了原理祝闻，我們再回過頭來，看一下我們在做流式或者看到文獻中流式的結(jié)果遗菠，到底該如何解讀联喘。
FCM結(jié)果的顯示通常有一維直方圖、二維點圖辙纬、等高線圖豁遭、密度圖等幾種。由數(shù)據(jù)還可以做出標準曲線進行定量分析贺拣。
我們首先看一下單參數(shù)直方圖蓖谢。
每一個細胞單參數(shù)的測量數(shù)據(jù)可以整理成統(tǒng)計分布，以直方圖的方式來顯示譬涡。在圖中闪幽，橫坐標表示熒光信號或散射光信號相對強度的值，其單位是道數(shù)（channel）涡匀，可以是線形（line）或者對數(shù)（log）盯腌。縱坐標一般是相對細胞 / 粒子數(shù)（count）陨瘩。
其次是二維圖：
在二維圖的中腕够，橫坐標 / 縱坐標都表示熒光信號或散射光信號相對強度的值级乍，可以是線形（line）或者對數(shù)（log）。雙參數(shù)圖可以將樣品細胞群分開帚湘，從而方便對感興趣的細胞進行分析玫荣。
哈哈哈哈，寫到這里大诸，想必大家對流式有了初步的認知捅厂，下次再看10X文獻的時候，這塊應(yīng)該是不愁了.....
參考文獻：
[1].?Tikhonova, A.N., Dolgalev, I., Hu, H.?et al.?The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.?Nature?569,?222–228 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1104-8
[2].QimingZhang.et al.?Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma .?https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.003
[3].Oh J E, Iijima N, Song E, etal. Migrant memory B cells secrete luminal antibody in the vagina[J]. Nature,571, 122–126(2019).
[4].?Crowther, M. D. et al. Genome-wide CRISPR-Cas9screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHCclass I-related protein MR1. Nat Immunol21, 178-185,doi:10.1038/s41590-019-0578-8 (2020).
