文獻(xiàn)摘要:越來越多的證據(jù)表明環(huán)狀RNAs（circRNA）是在腫瘤發(fā)生中起重要作用鸥咖。然而，circRNA在三陰性乳腺癌（TNBC）中的功能在很大程度上是未知的妓羊。作者使用circRNA微陣列來鑒定在TNBC細(xì)胞系中異常表達(dá)的circRNA顶岸。在TNBC細(xì)胞系和組織中通過定量實(shí)時(shí)PCR（qRTPCR）檢測顯著上調(diào)的circRNA的表達(dá)水平circGFRA1精拟。采用Kaplan-Meier生存分析方法探討circGFRA1在臨床預(yù)后中的意義。然后通過細(xì)胞增殖杯活，凋亡和小鼠異種移植試驗(yàn)檢測了circGFRA1在TNBC中的功能匆帚。

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此外，通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circGFRA1在TNBC中的miRNA海綿體功能旁钧。微陣列分析和qRT-PCR證實(shí)在TNBC中circGFRA1表達(dá)上調(diào)吸重。 KaplanMeier生存分析顯示，circGFRA1表達(dá)上調(diào)與存活率較差相關(guān)歪今。circGFRA1的敲低抑制TNBC的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡嚎幸。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測表明到circGFRA1直接GFRA1和miR-34a結(jié)合。隨后的實(shí)驗(yàn)表明寄猩，circGFRA1和GFRA1通過對miR-34a的海綿吸附作用調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)嫉晶。得出結(jié)論：circGFRA1可能作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）吸附miR-34a調(diào)節(jié)GFRA1的表達(dá)以發(fā)揮調(diào)節(jié)TNBC生長的功能。 circGFRA1可能是診斷TNBC治療的生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)田篇。

1替废、 circRNA GFRA1在TNBC中高度表達(dá)

為了研究TNBC中的潛在參與調(diào)控的circRNA，作者在三種TNBC細(xì)胞系（MDA-MB-231泊柬，MDA-MB-468和BT549）和一種HME細(xì)胞系（MCF-10A）上進(jìn)行了高通量的circRNAs微陣列測定椎镣。篩選出10個(gè)上調(diào)的circRNA，并進(jìn)行qRT-PCR以驗(yàn)證前8個(gè)上調(diào)的circRNA的表達(dá)兽赁，其中hsa_circ_005239在TNBC細(xì)胞中上調(diào)的最顯著（下圖）状答，其來源于GFRA1基因，于是將其命名為circGFRA1刀崖。

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2惊科、circGFRA1敲低后抑制TNBC細(xì)胞的生長

作者接下來使用RNA干擾敲低circGFRA1的表達(dá)來評(píng)估其在TNBC中的生物學(xué)功能。 qRT-PCR分析表明抑制是成功的(下圖A)蒲跨，隨后檢測細(xì)胞增殖測定circGFRA1的下調(diào)會(huì)顯著抑制TNBC細(xì)胞的生長（下圖B）译断，此外EdU檢測顯示在下調(diào)circGFRA1后，TNBC細(xì)胞的增殖潛力受損或悲，在集落形成實(shí)驗(yàn)中孙咪，circGFRA1下調(diào)后，TNBC細(xì)胞集落形成能力顯著降低（下圖C）巡语。

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3翎蹈、circGFRA1作為miR-34a的海綿吸附體

通過分別檢測細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的circGFRA1，結(jié)果顯示circGFRA1主要分布在TNBC細(xì)胞的胞質(zhì)中（下圖A）男公，它可能作為一個(gè)ceRNA來結(jié)合miRNA荤堪，導(dǎo)致相應(yīng)的miRNA靶靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的釋放合陵。

通過預(yù)測，在circGFRA1序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)miR-34a的潛在結(jié)合位點(diǎn)澄阳，因此作者進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因檢測以確定miR-34a是否可以直接與circGFRA1結(jié)合拥知。qRT-PCR分析表明轉(zhuǎn)染成功（下圖B），當(dāng)circGFRA1螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miR-34a mimics共轉(zhuǎn)染時(shí)碎赢，熒光素酶強(qiáng)度降低超過40％低剔，而當(dāng)circGFRA1螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miR-34a 干擾共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性顯著增強(qiáng)（下圖C）肮塞。

qRT-PCR檢測進(jìn)一步證實(shí)miR-34a mimics可抑制circGFRA1的表達(dá)而miR-34a干擾會(huì)增加circGFRA1表達(dá)（下圖D）襟齿，在circGFRA1敲低時(shí)miR-34a的表達(dá)會(huì)上調(diào)（下圖E）。數(shù)據(jù)證實(shí)circGFRA1在功能上與miR-34a相互作用枕赵，并作為miR-34a的海綿吸附體猜欺。

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4、circGFRA1作為miR-34a的ceRNA調(diào)控GFRA1的表達(dá)

為了研究circGFRA1是否作為ceRNA吸附miR-34a并釋放GFRA1的表達(dá)拷窜，作者繼續(xù)檢測GFRA1在乳腺癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)开皿，結(jié)果顯示GFRA1在TNBC細(xì)胞系中也上調(diào)（下圖A）。

此外装黑，使用TargetScan來鑒定miR-34a的假定靶基因副瀑，并預(yù)測GFRA1，為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)恋谭，作者構(gòu)建了含有全長GFRA1 3'-UTR的螢光素酶報(bào)道基因載體糠睡，其含有miR-34a和突變型的靶位點(diǎn)，與miR-34a mimics轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中疚颊。 當(dāng)與miR-34a mimics共轉(zhuǎn)染時(shí)觀察到熒光素酶活性的顯著降低狈孔，當(dāng)用突變體熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性沒有顯著差異材义。

相反均抽，當(dāng)與miR-34a inhibit共轉(zhuǎn)染時(shí)觀察到熒光素酶活性的顯著增加（下圖B）。qRT-PCR和WB驗(yàn)證了GFRA1的表達(dá)被miR-34a抑制（下圖C）其掂，此外油挥，miR-34a的表達(dá)被GFRA1抑制（圖5g）。這些結(jié)果表明GFRA1是miR-34a的直接靶標(biāo)款熬，circGFRA1可以作為miR-34a的海綿吸附體解除其對GFRA1表達(dá)的抑制作用深寥。

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文獻(xiàn)原文：RongfangHe,Peng Liu,Xiaoming Xie,et al. circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triplenegative breast cancer by regulating miR-34a.J EXP CLIN CANC RES,2017,36:145