1. Integration of single-cell RNA sequencing and spatial molecular imaging analysis provides a map of healthy and in?amed colon

Fig 1a: 作者對(duì)6例HC沐兰、6例CD和6例UC患者樣本分別進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序及空間分子成像流程食铐。
Fig 1b,c & Suppl Fig 1a: 樣本總細(xì)胞數(shù)達(dá)46,700個(gè)，得到79個(gè)細(xì)胞群僧鲁。對(duì)上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞象泵、B和漿細(xì)胞寞秃、T細(xì)胞、髓系細(xì)胞進(jìn)行再聚類分析發(fā)現(xiàn)偶惠，炎性成纖維細(xì)胞春寿、中性粒細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞可見(jiàn)于部分CD或UC患者，但在正常對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)忽孽。
Suppl Fig 2a,b: 對(duì)石蠟包埋樣本進(jìn)行空間分子成像檢測(cè)CD45, Pan CK, CD3的表達(dá)后對(duì)特定FoVs進(jìn)行Cos Mx SMI分析绑改。
Suppl Fig 1c,d: 對(duì)scRNA-seq data和SMI data各細(xì)胞亞群進(jìn)行細(xì)胞豐度的相關(guān)性分析谢床，發(fā)現(xiàn)IBD患者循環(huán)、生發(fā)中心和記憶B細(xì)胞豐度明顯正相關(guān)厘线；上皮細(xì)胞與其他細(xì)胞亞群豐度存在顯著相關(guān)性识腿，而組織性成纖維細(xì)胞如固有層S1, 隱窩旁S2, 粘膜下層S3和肌粘膜層肌成纖維細(xì)胞呈正相關(guān)。有趣的是造壮，作者發(fā)現(xiàn)Glia細(xì)胞豐度與BEST4 OTOP2, 結(jié)腸細(xì)胞, 上皮細(xì)胞Ribhi, M2巨噬細(xì)胞和固有層S1成纖維細(xì)胞顯著正相關(guān)渡讼，而與中性粒細(xì)胞, 炎性成纖維細(xì)胞, M1巨噬細(xì)胞和炎性單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞無(wú)明顯相關(guān)或負(fù)相關(guān)。提示作者Glia細(xì)胞與腸結(jié)構(gòu)形態(tài)完整性有關(guān)耳璧，而炎癥微環(huán)境可能導(dǎo)致此類細(xì)胞減少成箫。另外，作者利用KDE共定位分析SMI data發(fā)現(xiàn)DCs, different types of T cells, 成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞 / FRCs, cycling cells, GC B cells, B cells和 na?ve B cells空間定位相近位于Neighborhood I旨枯。健康對(duì)照樣本Neighborhood II蹬昌、III、IV分別對(duì)應(yīng)固有層攀隔、隱窩和粘膜下層區(qū)域結(jié)構(gòu)皂贩。IBD患者樣本可見(jiàn)：①中性粒細(xì)胞出現(xiàn)于Neighborhood I, II；②CCL20 T細(xì)胞和In?ammation-Dependent Alternative (IDA) 替代性活化巨噬細(xì)胞可出現(xiàn)于Neighborhood IV竞慢；③N3中性粒細(xì)胞, M1巨噬細(xì)胞, 炎性成纖維細(xì)胞和炎性單核細(xì)胞構(gòu)成獨(dú)特區(qū)域結(jié)構(gòu)Neighborhood II先紫。
因此，scRNA-seq與CosMx SMI的聯(lián)合分析可提供結(jié)腸全面的單細(xì)胞空間形態(tài)筹煮。

Fig.1 | Integration of single cell RNA sequencing (scRNA-seq) and Spatial Molecular Imaging (SMI) provides a map of healthy and in?ammatory bowel disease (IBD) colonic biopsies.

2. Transcriptional analysis at single-cell and spatial resolution reveals different populations of resident and in?ammatory macrophages in the colonic mucosa

Suppl Fig 1a,3a: 作者發(fā)現(xiàn)不同IBD患者巨噬細(xì)胞構(gòu)成比例差異明顯遮精，隨后為間質(zhì)細(xì)胞。提示此類亞群受患者異質(zhì)性影響較大败潦。但基于本研究樣本量相對(duì)較小本冲，分析患者特征與細(xì)胞功能變化相對(duì)困難。
Suppl Fig 3b: 髓系細(xì)胞再注釋為不同的巨噬細(xì)胞亞群劫扒、樹(shù)突狀細(xì)胞檬洞、炎性單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞沟饥、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等添怔。

Marker: HLA-DPA1, HLA-DPB1, CD14, CD68, SELENOP, LYZ, C1QA, C1QB, (M0) CD209, CD163L1, FUCA1, MRC1, FOLR2, A2M, PTPRC, IL10RA, KLF4, NRG1, EREG, HBEGF, CD300E, VCAN, FCN1, INHBA, ACOD1, CXCL5, SPP1, MMP9, CLEC5A, S100A8, S100A9, OSM, TNF, IL1A, IL1B, IL6, CCL20, CD1C, TCTN3, LAMP3, CCR7, LAD1, CCL22, CCL19, CCL17, FCGR3B, CMTM2, AQP9, CXCL8, HCAR3, CSF3R, FFAR2, PROK2, CXCR2, CXCR4, CCL3L1, IFIT2, IFIT3, GBP5, GBP1, CLC, IL4, IL13, MS4A3, TPSB2, TPSAB1, LTC4S, MS4A2, CD69, GATA2, TOP2A, MKI67, PCLAF

Fig 2a, Suppl Fig 3c: 髓系細(xì)胞再注釋及豐度差異。M2特征性標(biāo)志如CD163L1, CD209, FOLR2贤旷；根據(jù)巨噬細(xì)胞相關(guān)基因及M2特征性標(biāo)志的表達(dá)情況將健康對(duì)照組巨噬細(xì)胞注釋為M0和M0_Ribhi广料，其PTPRC/CD45亦相對(duì)低表達(dá)。除外M0和M2, 髓系細(xì)胞可再注釋為ACOD1和CXCR5 M1幼驶、IDA巨噬細(xì)胞艾杏。
Fig 2b: Milo工具分析健康對(duì)照和IBD患者髓系細(xì)胞構(gòu)成差異。
Fig 2c: 火山圖顯示M2和M0巨噬細(xì)胞表征基因盅藻。
Fig 2d: 熱圖顯示M0, M2, M1和IDA巨噬細(xì)胞在HC, CD和UC差異基因的表達(dá)购桑。
Fig 2e: Cos Mx SMI顯示HC, CD和UC髓系細(xì)胞亞群分布畅铭。
分析各髓系細(xì)胞亞群與腸粘膜間距發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照組駐留巨噬細(xì)胞與粘膜相距最近勃蜘，肥大細(xì)胞和DCs傾向位于更深層次粘膜層硕噩，而IBD患者M(jìn)1巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞可見(jiàn)于粘膜表面即潰瘍處。

Fig.2 | Analysis of myeloid cell subsets in healthy and in?amed colonic mucosa.

3. M0 and M2 represent two independent states

Suppl Fig 4a,b: 作者應(yīng)用上述注釋基因?qū)ζ渌矓?shù)據(jù)進(jìn)行HC, CD和UC髓系細(xì)胞注釋并比對(duì)與數(shù)據(jù)來(lái)源注釋亞群的相關(guān)性元旬，發(fā)現(xiàn)M0和M2細(xì)胞與來(lái)源文獻(xiàn)注釋最為相近榴徐。

Supplementary Figure 4. Intestinal Macrophages across studies

Supplementary Figure 4. Intestinal Macrophages across studies

Supplementary Figure 5. Inflammation-dependent alternative (IDA) macrophages show a unique signature compared to M2 and M1 macrophages

Supplementary Figure 4. Intestinal Macrophages across studies.

Supplementary Figure 5. Inflammation-dependent alternative (IDA) macrophages show a unique signature compared to M2 and M1 macrophages.

4. In?ammation-associated macrophages, including M1 and In?ammation-Dependent Alternative macrophages, show highly heterogeneous signatures among patients

相較健康對(duì)照介陶，IBD患者巨噬細(xì)胞比例及多樣性相對(duì)增加腹备。除外M0和M2, 作者發(fā)現(xiàn)炎性/活化巨噬細(xì)胞可分為至少三種不同狀態(tài)：M1 (M1 ACOD1和M1 CXCL5)、IDA巨噬細(xì)胞和炎性單核細(xì)胞斤蔓。與M0和M2巨噬細(xì)胞不同的是，炎性巨噬細(xì)胞在不同來(lái)源的數(shù)據(jù)相似性不高镀岛，提示其與患者背景高度相關(guān)弦牡。
Suppl Fig 5c: 采用體外 i) GM-CSF-derived macrophages (Cuevas VD et al., 2022), ii) GM-CSF-derived macrophages stimulated with LPS (Cuevas VD et al., 2022), iii) M-CSF-derived macrophages stimulated with LPS (Cuevas VD et al., 2022), iv) upregulated genes of M-CSF-derived macrophages inhibited with MAF siRNA (Vega MA et al, 2020) and v) upregulated genes of M-CSF-derived macrophages stimulated with 5-HT (serotonin) (Nieto C et al, 2020; Domínguez-Soto á et al, 2017) 上調(diào)基因標(biāo)注注釋細(xì)胞友驮，發(fā)現(xiàn)M1 CXCL5與體外GM-CSF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞相似性較大，而M1 ACOD1與M-CSF和GM-CSF+LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞均具有共同表達(dá)驾锰。IDA巨噬細(xì)胞則與M-CSF+ serotonin(5-HT)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特性更為相似卸留。
基于軌跡分析結(jié)果，M1亞群發(fā)育軌跡與M2/M0不同椭豫。炎性單核細(xì)胞可完全分化為M1活化狀態(tài)耻瑟；然而，IDA巨噬細(xì)胞具有M1, M2分支赏酥，說(shuō)明其可能處于上述兩種亞群的轉(zhuǎn)換狀態(tài)喳整。
Suppl Fig 5d, 5e: 韋恩圖示IDA巨噬細(xì)胞前200個(gè)marker基因與M1, M2分別具有10%和16%的共同基因÷惴觯火山圖說(shuō)明IDA巨噬細(xì)胞與M1, M2基因表達(dá)差異較大框都。
本研究說(shuō)明腸道巨噬細(xì)胞可源于單核細(xì)胞在不同刺激條件下分化誘導(dǎo)。

Supplementary Figure 5. Inflammation-dependent alternative (IDA) macrophages show a unique signature compared to M2 and M1 macrophages.

5. In?ammation-dependent alternative macrophages express neuregulin 1

Fig 3a: IDA巨噬細(xì)胞特征基因包括EGFR家族配體如AREG, HBEGF和NRG1, M1和M2傳統(tǒng)標(biāo)志物相對(duì)低表達(dá)呵晨。
Fig 3b,c: NRG1在UC患者的表達(dá)相較CD和HC均明顯升高魏保。提示neuregulin 1可能參與IBD, 尤其是UC疾病的發(fā)生發(fā)展。
Fig 3d: 原位雜交顯示IBD患者NRG1與CD68+巨噬細(xì)胞共表達(dá)摸屠。然而健康對(duì)照組NRG1的表達(dá)多見(jiàn)于上皮細(xì)胞谓罗，CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)較少。
Suppl Fig 6a-e: scRNA-seq和Cos Mx SMI分析亦可見(jiàn)正常對(duì)照組NRG1多表達(dá)于S2b(SOX6+) 腸腔側(cè)成纖維細(xì)胞季二，而非隱窩旁S2a 成纖維細(xì)胞檩咱。另外成纖維細(xì)胞NRG1的表達(dá)水平在UC患者亦顯著增加。
Fig 3e: Neuregulin 1 可結(jié)合ErbB受體誘導(dǎo)人上皮分化成分泌細(xì)胞及促進(jìn)小鼠干細(xì)胞的增殖再生戒傻。作者應(yīng)用富含腸上皮干細(xì)胞的類器官税手，發(fā)現(xiàn)Neuregulin 1可顯著抑制干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)GR5并促進(jìn)OLFM4的表達(dá)，其中增殖標(biāo)志物MKI67未見(jiàn)差異需纳。
Suppl Fig 7a: 考慮NOTCH配體和TNFα均可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞OLFM4的表達(dá)芦倒。分析Notch靶基因和受體(NOTCH1-4)在各組上皮細(xì)胞的表達(dá)，可見(jiàn)HES1和NOTCH1在上皮細(xì)胞表達(dá)不翩。與HES1相反兵扬，NOTCH1在完全分化的上皮細(xì)胞表達(dá)相對(duì)下降】隍穑可見(jiàn)TNF受體TNFRSF1A和TNFAIP3在上皮細(xì)胞表達(dá)器钟。作者進(jìn)一步通過(guò)1000-gene CosMx panel 驗(yàn)證NOTCH1和TNFRSF1A 的空間定位。

Fig.3 | Neuregulin 1 expression and function in colonic mucosa.

6. CosMx Spatial Molecular Imaging analysis con?rms the expansion of In?ammation-Dependent Alternative macrophages and reveals their tissue distribution in in?ammatory bowel disease colon

Fig 4a: CosMx SMI分析可見(jiàn)IDA巨噬細(xì)胞廣泛分布與UC和CD患者結(jié)腸組織妙蔗。
Fig 2g: M1巨噬細(xì)胞在腸固有層和粘膜下層相對(duì)少見(jiàn)傲霸，主要分布于潰瘍表面。
Fig 4b: 1例CD患者見(jiàn)有肉芽腫。CosMx SMI分析可見(jiàn)IDA和M2巨噬細(xì)胞為該肉芽腫的主要組成細(xì)胞昙啄，少見(jiàn)M0和M1巨噬細(xì)胞穆役。免疫組化可見(jiàn)CD68+CD209+M2標(biāo)志物的表達(dá)亦相對(duì)少見(jiàn)并分散。
Fig 4c: NRG1在肉芽腫的表達(dá)相較固有層巨噬細(xì)胞減少梳凛。
因此, IDA巨噬細(xì)胞NRG1的表達(dá)與組織結(jié)構(gòu)相關(guān)耿币。NRG1hi IDA巨噬細(xì)胞多位于腸腔近上皮處，NRG1lo IDA巨噬細(xì)胞見(jiàn)于CD患者肉芽腫或IBD患者粘膜下層韧拒。提示兩群細(xì)胞功能不同淹接。

Fig.4 | In?ammation-Dependent Alternative (IDA) macrophages are widely distributed in ulcerative colitis and present in Crohn’s disease granulomas.

7. In?ammatory ?broblasts co-localize with In?ammation Dependent Alternative macrophages in in?ammatory bowel disease

Fig 5a: CD或UC患者IDA巨噬細(xì)胞傾向與其他巨噬細(xì)胞亞群、部分間質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞（尤其是CD8+T, Tregs, CCL20 T）空間距離靠近叛溢。
Fig 5b,c: CD或UC患者IDA巨噬細(xì)胞與炎性成纖維細(xì)胞具有高度空間相關(guān)性塑悼。
Fig 5f: 炎性成纖維細(xì)胞表達(dá)CSF2和CSF3, encoding for GM-CSF, G-CSF respectively, 和前列腺素合成酶PTGS1,PTGES,PTGS2。近年研究表明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織成纖維細(xì)胞活化可誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素并促進(jìn)IDA樣巨噬細(xì)胞的分化和HBEGF, EREG而非NRG1的表達(dá)雇初。提示炎性成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可通過(guò)配體-受體直接作用參與IBD疾病的發(fā)生發(fā)展拢肆。

Fig.5 | In?ammation-Dependent Associated (IDA) macrophages co-localize with in?ammatory ?broblasts.

8. Single-cell RNA sequencing reveals a marked heterogeneity of tissue neutrophils in inflammatory bowel disease colonic mucosa

Suppl Fig 11a-c: IBD患者中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞比例均明顯升高。相較外周血靖诗，其特征性表面標(biāo)志 (CD62L, CD193, CD69) 表達(dá)增加郭怪，提示存在不同活化狀態(tài)。
Suppl Fig 3a: 嗜酸性粒細(xì)胞特征標(biāo)志如CLC, MS4A3, CCR3 和 “Th2” 細(xì)胞因子 IL4 和IL13刊橘。
Fig 2b: 中性粒細(xì)胞特征標(biāo)志如HCAR3, FCGR3B (CD16b), CMTM2, PROK2 等鄙才。
Fig 6a: 腸道中性粒細(xì)胞可分為3個(gè)亞群，命名N1, N2和N3, 其在不同疾病和個(gè)體豐度有所差異促绵。相較N1和N3攒庵，N2中性粒細(xì)胞表達(dá)CCL3, LGALS3 和CXCR4 增加，而N3中性粒細(xì)胞表達(dá)如GBP1, IRF1, FCGR1A等IFN-response signature更明顯败晴。
Fig 6c: 與其他外周血中性粒細(xì)胞scRNA-seq數(shù)據(jù)集比較浓冒，N1和N3中性粒細(xì)胞與骨髓成熟中性粒細(xì)胞（BM matureN）和臍帶血中性粒細(xì)胞（UCB）具有相似性。N2中性粒細(xì)胞與外周血中性粒細(xì)胞重疊性不高尖坤，相反稳懒，其特異性表達(dá)組織定位相關(guān)基因如趨化因子和受體、不同活化狀態(tài)和功能（如CD83, CD63, FTH1, VEGFA）慢味。
Suppl Fig 11d: 組織中性粒細(xì)胞N2標(biāo)志物CXCR4和CD63 的表達(dá)率可達(dá)10%和61%场梆，外周血?jiǎng)t分別為0.26%和14%。
Fig 6d: Cos Mx SMI分析見(jiàn)上述3類中性粒細(xì)胞亞群廣泛分布于炎性固有層結(jié)構(gòu)纯路，主要集中于隱窩膿腫和潰瘍病變處或油。

Fig.6 | Analysis of the heterogeneity of neutrophil populations in in?amma tory bowel disease (IBD) colonic mucosa.