第一節(jié) 分子生物學基本知識
一伐脖、DNA與RNA
<u>DNA</u> 脫氧核糖核酸
遺傳信息--核苷酸排列順序同窘、以堿基互補維持雙螺旋結(jié)構(gòu)
DNA為<u>長絲狀分子</u>互相糾纏锈至、其溶液十分黏稠搞隐。
溶液對<u>紫外線</u>有最強吸收驹愚、用<u>260 nm波長</u>測DNA溶液濃度。DNA變性后OD值會↑
因DNA不溶于乙醇劣纲、常用<u>二倍量乙醇</u>沉淀DNA
在<u>變性溫度</u>時逢捺、黏性突然降低。
淬火--為了保持DNA單鏈狀態(tài)
DNA變性后溶液冷卻癞季、DNA會<u>自動恢復雙螺旋結(jié)構(gòu)</u>
<u>RNA</u> 核糖核酸
起遺傳信息傳遞作用&指導合成蛋白質(zhì)
病毒中RNA也保存遺傳信息
- 含有核糖劫瞳、不是脫氧核糖
- 胸腺嘧啶都代之以尿嘧啶
二、DNA的復制和修復
限制性核酸內(nèi)切酶--不是合成DNA的必要條件
DNA多聚酶：DNA合成中绷柒、單核苷酸分子以共價鏈連接在3’末端的羥基上志于。
大腸菌DNA修復：<u>填補缺口</u>最重要的酶--DNA聚合酶Ⅰ（<u>Klenow片段沒有5’-3’外切酶活性</u>）意義：保證合成DNA時的準確性
<u>DNA復制最主要的酶</u>--<u>DNA聚合酶Ⅲ</u>（具有3’-5’外切酶活性的<u>亞基是：ε亞基</u>）
三、轉(zhuǎn)錄
DNA指導的RNA合成過程废睦。
DNA雙鏈解旋伺绽，解旋部位稱啟動子。
大腸菌<u>RNA</u>聚合酶有<u>5個亞基嗜湃、 σ亞基有啟動子作用</u>
四奈应、翻譯
- tRNA：搬運氨基酸
- rRNA：構(gòu)成核糖體骨架 ribosome
- mRNA：決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
DNA3個終止密碼子：UAA、UAG购披、UGA
真核生物 核糖體 的<u>5種組蛋白杖挣、H1</u>在進化中最不保守。
核糖體上刚陡、2個位置上暴露出mRNA分子相鄰的2個密碼子（蛋白質(zhì)合成結(jié)束惩妇？我不懂）
第二節(jié) 分子生物學基本技術(shù)
一株汉、質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定
質(zhì)粒--染色體外的穩(wěn)定遺傳因子屿附。
<u>大小從 1~200kb</u>郎逃、為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子挺份，超螺旋狀態(tài)在細胞中褒翰。
具有<u>自主復制和轉(zhuǎn)錄能力</u>。
細菌質(zhì)粒是常用載體匀泊、質(zhì)粒載體是天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工構(gòu)建的优训。
相比天然質(zhì)粒、質(zhì)粒載體帶有選擇性標記基因和人工的含多個限制性內(nèi)切酶識別點位的多克隆位點序列各聘。
理想克隆載體的特性：
- 分子量小揣非、多拷貝、松弛控制型
- 具有多種常用限制性內(nèi)切酶的單切點
- 能插入較大的<u>外源DNA片段</u>
- 具有容易操作的<u>檢測表型</u>
<u>常用質(zhì)粒載體大小1~10kb</u>
細菌中分離質(zhì)粒DNA的3個基本步驟
- 培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增
- 收集和裂解細胞
- 分離和純化質(zhì)粒DNA
<u>加入抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素躲因、細菌停止繁殖后質(zhì)粒仍然在復制→提高質(zhì)粒的收獲量早敬。</u>
<u>溶菌酶</u>破壞菌體細胞壁→十二烷基磺酸鈉<u>（SDS）和Triton X-100裂解細胞膜</u>→用強熱、酸大脉、堿處理→細菌的線性染色體DNA變性搞监、質(zhì)粒的共價閉合環(huán)狀DNA雙鏈不會分開→外界條件恢復→線性染色體DNA片段難以復性、而質(zhì)粒DNA雙鏈恢復超螺旋分子→溶解狀態(tài)于液相中
離心除去DNA片段和細胞碎片→酚處理除去核酸酶等蛋白質(zhì)→乙醇沉積→將質(zhì)粒DNA從上清液沉積下來→獲得高濃度的質(zhì)粒溶液镰矿。
超螺旋DNA琐驴、提取過程還會產(chǎn)生開環(huán)DNA--松弛型環(huán)狀分子（雙鏈中有1條發(fā)生斷裂）
二、基因組DNA的提取
利用基因組DNA較長的特性秤标，將其與小分子DNA分離
異丙醇or乙醇绝淡、即沉淀成絮團、玻棒取出苍姜。
<u>構(gòu)建基因組文庫牢酵、初始DNA長度必須＞100kb</u>
進行RFLP和PCR分析、DNA長度可以短至50kb衙猪、＞該長度茁帽，可以保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段（20kb以下）、&保證包含PCR擴增的片段（2kb以下）
三屈嗤、RNA的提取和cDNA合成
細胞內(nèi)總RNA制備方法：<u>異硫氰酸胍熱苯酚法</u>
總RNA可利用<u>mRNA 3‘末端含多聚（A）+的特點</u>→得到較純mRNA
mRNA在70%乙醇中潘拨、-70℃可以保持1年以上
RNA→酶促反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄合成→cDNA
四饶号、DNA酶切及凝膠電泳
<u>限制性內(nèi)切酶</u>切割雙鏈DNA（一段限制性內(nèi)切酶識別序列）
分為3類铁追。其中Ⅱ類限制性內(nèi)切酶廣泛應(yīng)用。
<u>Ⅱ類限制性內(nèi)切酶</u>識別長度為4個或6個核苷酸的回文對稱序列茫船。
DNA→限制性內(nèi)切酶切割→許多一定長度的片段→電泳分離不同長度片段→特征性圖形→DNA電泳圖譜琅束，又稱<u>DNA物理圖譜扭屁，以直線or環(huán)狀圖示表示</u>
一般DNA電泳<u>用量為0.5~1 μg、反應(yīng)溫度大多37℃</u>
質(zhì)粒DNA酶切用量<u>1μg DNA加1單位酶涩禀、消化1~2 h料滥；完全酶解必須增加酶的用量2~3倍</u>、時間延長
- 不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度<u>200bp~50kb</u>的DNA片段（水平電泳）
- 聚丙烯酰胺分離小片段<u>5~500bp</u>（通常垂直裝置電泳）
電泳完畢→溴化乙錠染色（誘變劑）--302nm紫外光下發(fā)橙色熒光
第三節(jié) 探針和雜交技術(shù)
- DNA雙鏈解旋形成單鏈--DNA的變性
- 堿基配對重新形成雙鏈--DNA的復性
- 復性過程中艾船、不同來源互補序列形成穩(wěn)定雜合雙鏈DNA的過程--分子雜交
- 帶有可識別標記的已知核苷酸序列--探針
- 根據(jù)探針測知對應(yīng)序列的存在--雜交技術(shù)
-
隨機合成法標記核苷酸探針<u>最簡單有效</u>葵腹，也可使用PCR反應(yīng)。
DNA探針（最常用）屿岂、RNA探針（信號強践宴、效果更好）
分子雜交分類
- Southen雜交：被檢對象為<u>DNA</u>、探針為DNA\RNA
- Northen雜交：被檢對象為<u>RNA</u>爷怀、探針為DNA\RNA
- 其他：斑點雜交阻肩、狹槽雜交、原位雜交
3種固相支持體可用于雜交
<u>硝酸纖維素濾膜（最多選）运授、尼龍膜烤惊、Whatman541濾紙</u>
第四節(jié) 擴增技術(shù)
PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）--選擇性體外擴增DNA/RNA的方法
3個基本步驟：
- 變性：雙鏈DNA片段在94℃下解鏈
- 退火：2種寡核苷酸引物在適當穩(wěn)定（50℃左右）下與模板上的目的序列通過氫鍵配對
- 延伸：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成吁朦。
三個基本步驟一個循環(huán)柒室、25~35輪循環(huán)擴增10^6倍
PCR反應(yīng)中主要成分：
- 引物：特異性由一對上下游引物決定
- 4種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）:理論上4種dNTP<u>各20μmol/L</u>，足以在100μl反應(yīng)中合成<u>2.6μg</u>的DNA喇完。
當dNTP<u>終濃度大于50mmol/L時可抑制TaqDNA聚合酶的活性</u>伦泥。
4種dNTP的<u>濃度應(yīng)該相等</u>剥啤。 - Mg2+：Mg2+濃度范圍<u>0.5~2mmol/L</u>
- 模板：必須以DNA為模板擴增锦溪、模板DNA可以是單鏈、雙鏈府怯、線狀刻诊、<u>環(huán)狀分子</u>（線狀分子稍好于環(huán)狀分子）
影響PCR的主要因素是<u>模板的數(shù)量和純度</u>。 - Taq DNA聚合酶：活性半衰期<u>92.5℃-130 mins牺丙、95℃-40 mins则涯、97℃-5 mins</u>。
- 反應(yīng)緩沖液：一般含10~50 mmol/L Tris·Cl冲簿，20℃下pH 8.3~8.8粟判，50 mmol/L KCl和Mg2+
第五節(jié) 高通量檢測技術(shù)
生物基因組是一個極其巨大的分子。
<u>一次測定中峦剔、獲得成百上千反應(yīng)的結(jié)果</u>--高通量檢測技術(shù)
生物芯片發(fā)展最快档礁、應(yīng)用最廣泛。
生物芯片包括：基因芯片吝沫、蛋白質(zhì)芯片呻澜、細胞芯片递礼、組織芯片
根據(jù)原理：元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片羹幸、生物傳感芯片
基因芯片--也稱基因微陣列技術(shù)
90%用于<u>基因表達譜分析脊髓、病毒基因分型、SNP研究</u>栅受、8.5%芯片臨床診斷
基因芯片優(yōu)越性：
- 高通量将硝，同時監(jiān)控多種微生物
- 提高特異性，多條探針雜交窘疮、克服PCR易污染的特點
- 克服窗口期漏檢
基因芯片在SARS病毒的鑒定中發(fā)揮了很大作用
