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測序中加入Phix的作用

測序建庫的時候鞋怀，會加入一定比例的Phix所坯，那么Phix文庫有什么作用呢命锄，我轉(zhuǎn)了兩篇文章帮哈，方便大家理解伴找。Phix文庫最主要的目的1）是調(diào)節(jié)堿基平衡，改善測序儀的空間校正兄纺，便于后期提高base calling的準(zhǔn)確性大溜，2）由于Phix序列已知基因組較小，在測序的過程中Illumina的測序儀就開始將測的read與phix基因組進(jìn)行比較估脆，預(yù)估測序指標(biāo)钦奋。我也遇到過，Illumina工程師在維護(hù)測序儀時，用Phix文庫測試付材。轉(zhuǎn)載內(nèi)容詳見下文

轉(zhuǎn)自Illumina公司

PhiX對照品v3是一款可靠朦拖、連接接頭的文庫，適合用作Illumina測序運(yùn)行的對照品厌衔。該文庫來源于已妥善分析特征的小型PhiX基因組璧帝，并具備多項(xiàng)測序和比對優(yōu)點(diǎn)。

通用型PhiX對照品v3不僅能用作即用型文庫富寿，還可用于多種應(yīng)用睬隶，以增加工作流程價值及提高結(jié)果的可信度。

PhiX文庫提供適用于簇生成作喘、測序和比對的質(zhì)量對照品理疙，以及適用于串?dāng)_矩陣生成、定相和預(yù)定相的校正對照品泞坦〗严停可快速對其進(jìn)行比對以預(yù)估相關(guān)邊合成邊測序(SBS)指標(biāo)，比如定相和錯誤率贰锁。

視乎應(yīng)用赃梧，PhiX對照品v3還可用作：

適用于堿基不均衡樣本（AT或GC內(nèi)容低于40%或高于60%的基因組）的高濃度外標(biāo)對照品

低濃度摻入，適用于比對和定量效率的計(jì)算

可在多樣性較低樣本旁的設(shè)置照品通道

適用于簇生成問題故障診斷豌熄，便于確定錯誤是否與文庫制備有關(guān)

轉(zhuǎn)自Mars-Zhan老師

測定混合微生物群的16S的若干個片段授嘀，從其可變區(qū)的序列來進(jìn)行菌落組成分序，已是很常用的實(shí)驗(yàn)方法锣险。

自從MiSeq測序平臺推出PE300的測序方式之后蹄皱，用PE300來測16S的V1、V2芯肤、V3區(qū)巷折，已成了最常用的菌落分析手段。

但是每次我提醒用戶：在做16S文庫測序的上機(jī)時崖咨，建議加入70%的PhiX文庫锻拘。用戶都會感到不解：為什么要浪費(fèi)這70%的測序通量？

這還要從Illumina公司的測序原理說起：

Illumina的測序根本原理是用4種顏色熒光基團(tuán)標(biāo)記4種dNTP击蹲。

在顯微掃描鏡下署拟，通過對4種顏色的熒光進(jìn)行分別掃描，得到4張照片歌豺，每張照片對應(yīng)于一種顏色的熒光推穷。

把4張照片進(jìn)行對比，把各張照片上的光點(diǎn)重合类咧，計(jì)算每個光點(diǎn)的光的顏色強(qiáng)度馒铃，倒過來推算出這個點(diǎn)是哪種熒光基團(tuán)谴咸，進(jìn)爾再推算出這個點(diǎn)是哪種堿基。

MiSeq測16S文庫時骗露，為什么要加PhiX?

但請注意，因?yàn)檫@4張照片都是納米級的分辨率血巍，而測序過程中芯片是移動的萧锉，所以每次拍照多少存在一定程度的空間偏差，如上圖所示述寡。這就需要進(jìn)行空間校正柿隙。

文庫復(fù)雜度不夠高帶來的影響：

如果是文庫的復(fù)雜度足夠高，也就是在一個測序循環(huán)中鲫凶，A/C/G/T四種堿基的比例較接近于各25%禀崖，那么4張照片上都會有足夠多的明亮的光點(diǎn)，可供空間校正之用螟炫。

但是如果文庫的復(fù)雜度不夠高波附，典型的例子就是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，比如說第一個循環(huán)昼钻，99%的 堿基都是A掸屡，那么C/G/T三種堿基加起來也只有1%。這就導(dǎo)致C/G/T這三張照片都很暗然评，上面沒有足夠多的光點(diǎn)可供測序儀來分辨仅财，更難于做空間校正。 測序儀就會把大多數(shù)無法準(zhǔn)確分辨的點(diǎn)給舍棄碗淌。

最終的結(jié)果就是：測序得到的有效數(shù)據(jù)量（PF data盏求，Pass Filter data）很少，而且數(shù)據(jù)的質(zhì)量（Q值）也偏低亿眠。

上述的原因碎罚，讓Illumina的MiSeq和HiSeq 2000/2500在測復(fù)雜度低的文庫（PCR擴(kuò)增文庫、Bisulfite處理的甲基化文庫缕探、簡化基因組文庫等）時魂莫，如果沒有加入彌補(bǔ)的方法，軟件就不 能很好識別的光點(diǎn)爹耗，導(dǎo)致最后的有效數(shù)據(jù)量減少耙考、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量也偏低。

目前的解決方案是：

在測低復(fù)雜度的文庫時潭兽，摻入一定量的高復(fù)雜度文庫倦始。最常用的摻入文庫是Illumina出品的PhiX文庫，也有些實(shí)驗(yàn)室會用哺乳類動物的基因組文庫來增加文庫的復(fù)雜度山卦，效果是一樣的鞋邑。

PhiX文庫有以下的特點(diǎn)：

PhiX文庫中GC含量約為45%诵次，是堿基比例較為平衡的樣本。

PhiX DNA就是ΦX174噬菌體的DNA枚碗，其基因組的長度是4kb略多逾一，其序列已清楚地被測定。

PhiX DNA文庫沒有Index肮雨，所以在樣本Demultiplex的過程中遵堵，被挪到undetermined的文件中，不會與別的有Index的文庫相混怨规。

PhiX的序列是已知的陌宿，所以，在測序過程中波丰，儀器會對PhiX的序列進(jìn)行比對壳坪，算出Phasing和Pre-Phasing(一個簇中，有多少比例的DNA是少合成了一個堿基（Phasing）掰烟，又有多少比例的DNA是多合成了一個堿基（Pre-Phasing）)

轉(zhuǎn)自陳云地老師

常見的堿基組成不平衡的樣本類型比如：甲基化爽蝴、擴(kuò)增子、轉(zhuǎn)錄組纫骑、ChIP霜瘪、重復(fù)序列測序（16S rDNA, HLA…）等等，其中重亞硫酸鹽處理后的甲基化樣本是堿基組成極度不平衡的惧磺，基本沒有C颖对，只有A、T磨隘、G三種堿基缤底，而T的含量又比正常樣本增加幾乎一倍。

堿基不平衡的樣本可以與堿基平衡的樣本混合以改善平衡程度番捂，常見堿基平衡的樣本比如人全基因組个唧、人外顯子組、Illumina標(biāo)準(zhǔn)品文庫PhiX等设预。

平衡與不平衡樣本的混合比例徙歼，根據(jù)樣本的不平衡的嚴(yán)重程度調(diào)整。樣本的堿基越不平衡鳖枕，Phix文庫的比例越高魄梯。

其中PhiX可以同時起到兩個作用：改善堿基平衡度，作為陽性對照監(jiān)控測序操作是否成功宾符。

http://blog.sina.com.cn/s/blog_751bd9440102vruh.html

http://garification.blog.163.com/blog/static/1741330252015726502943/

https://www.illumina.com.cn/products/by-type/sequencing-kits/cluster-gen-sequencing-reagents/phix-control-v3.html