寫在前面
原本缸夹，我并無寫這一稿件的想法痪寻。主要原因有二：
- 網(wǎng)絡(luò)上已有相關(guān)資料較多，盡管類似的問題天天仍然有人問
- 再談起 GO富集分析虽惭，距離上次已是五六年槽华，簡(jiǎn)單來說，不想談
如果要找合理解釋趟妥，那么針對(duì)第一點(diǎn)猫态，就是每天仍然有大量新接觸生信數(shù)據(jù)分析的朋友；針對(duì)第二點(diǎn)披摄，......在前兩天我推的文稿《零基礎(chǔ)快速完成基因功能注釋 / GO / KEGG / PFAM...》中亲雪，評(píng)論區(qū)答應(yīng)了下，閱讀過5000疚膊，那就寫一寫富集分析义辕。于是，如果不寫寓盗，總是不對(duì)灌砖。如果要寫，只能現(xiàn)在寫傀蚌。畢竟有些事情基显，現(xiàn)在不做，以后真的不會(huì)做善炫。
基因集功能富集分析原理
對(duì)于這一塊撩幽，完全陌生的朋友，尤其是不少生物學(xué)背景朋友箩艺，有必要溫習(xí)一下數(shù)理統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)窜醉。這一稿件只做原理最簡(jiǎn)單的但使用最廣泛其速度最快的Over-Represence Analysis模式的富集分析講演。其他模式艺谆，不涉及榨惰。
回到主題，先舉個(gè)經(jīng)典的抽球例子：
小紅小綠小藍(lán)三個(gè)人自稱有超能力静汤，可以用手摸摸球就分辨出黑球白球琅催，于是我們找來黑袋子，放100個(gè)球撒妈，其中20個(gè)白球80個(gè)黑球恢暖，讓三人分別無放回地抽取排监。
小紅隨機(jī)抽出來10個(gè)球狰右，其中2個(gè)白球8個(gè)黑球，情況即舆床，
抽球中白球比例與背景白球比例完全一致棋蚌，說明小紅抽球結(jié)果隨機(jī)嫁佳。
球放回去，小綠來抽球谷暮，抽出來的10個(gè)球蒿往，其中3個(gè)白球7個(gè)黑球，情況即湿弦，
抽球中白球比例比背景白球比例高一些瓤漏，說明小綠似乎更會(huì)抽取到白球
球又返回去，小藍(lán)來抽球颊埃，抽出來的10個(gè)球蔬充，其中10個(gè)白球0個(gè)黑球，情況即班利，
抽球中白球比例比背景白球比例高了非常多饥漫，說明小藍(lán)似乎很會(huì)抽取到白球。
我們關(guān)注的是罗标，誰抽取到更多的白球（相對(duì)于背景）庸队，于是小紅與背景一致，不用看了闯割。小綠和小藍(lán)都比背景多彻消，那么如何判斷小綠或者小藍(lán)是走狗屎運(yùn)還是有超能力？
這是經(jīng)典的抽球案例宙拉，抽取到的白球個(gè)數(shù)的概率分布為超幾何分布证膨。基于此鼓黔，我們可以簡(jiǎn)單計(jì)算抽取到比小綠抽取到球個(gè)數(shù)（或更多即更極端）的概率如何央勒，在 R語言中計(jì)算，即
> 1-phyper(3-1,20,80,10)
[1] 0.3187799
而對(duì)于小藍(lán)的情況澳化，那么概率如何崔步？
> 1-phyper(10-1,20,80,10)
[1] 1.067318e-08
在 TBtools 中也可以計(jì)算，只是寫法有點(diǎn)區(qū)別
可以看到缎谷，盡管這只是一次抽球井濒，小綠抽球中白球比例（或更極端情況）出現(xiàn)的概率是31.88%+，還是挺高的列林，于是我們有較高的把握說瑞你，小綠嘛，只是走了狗屎運(yùn)希痴。相反者甲，小藍(lán)抽球中白球比例或更極端情況出現(xiàn)的概率幾乎為 0 ，我們幾乎沒啥把握說砌创，小藍(lán)走狗屎運(yùn)....換句話說虏缸，我們有理由相信鲫懒，或許小藍(lán)真有抽白球的超能力.....
說了這么多，那么跟基因集合富集分析有啥關(guān)系刽辙？....基因集合功能富集分析窥岩。那么我們就需要有一個(gè)基因集合（如差異表達(dá)基因集合或ChIP-seq的Peaks或GWAS定位的系列區(qū)間），還有一個(gè)功能標(biāo)簽（如 生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān) ）宰缤。于是黑白球案例可以簡(jiǎn)單調(diào)整一下颂翼。假定現(xiàn)在這個(gè)物種一共有100個(gè)基因，其中20個(gè)基因與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)慨灭，80個(gè)沒有注釋到與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)（換句話說疚鲤，約等于無關(guān)），我們做了對(duì)植株做了處理缘挑，和CK分別測(cè)定轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜集歇，通過差異表達(dá)分析，鑒定到10個(gè)差異表達(dá)基因语淘，其中2個(gè)與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)诲宇，而另外8個(gè)則沒注釋到生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，簡(jiǎn)單畫一下惶翻，即
好姑蓝，剩下的兩個(gè)就不替換了。整體上吕粗，ORA模式的富集分析纺荧，本身就是經(jīng)典的抽球案例，感興趣的自行替換就可以了颅筋。
兩三注意點(diǎn)
基本原理宙暇，相信都搞清楚了。不過還是有兩三點(diǎn)需要注意：
- 區(qū)別“富集”和“富集顯著”：上述按理议泵，小綠和小藍(lán)抽白球比例都各自超過背景比例占贫，那么這種情況類比上，就是“富集”先口，因?yàn)槠x了背景型奥。但是通過檢驗(yàn)，小綠抽白球出現(xiàn)的情況更可能是一種隨機(jī)波動(dòng)碉京，而小藍(lán)抽取白球出現(xiàn)的情況則明顯非正常厢汹，類比下，就是“富集顯著”谐宙。
- 富集分析時(shí)烫葬，很多新接觸的，搞錯(cuò)的往往就是沒搞清楚原理卧惜，背景 和 抽球厘灼；基因全集 和 基因選擇集合（如差異表達(dá)基因集合）。一定要注意咽瓷，做基因功能富集分析是设凹，背景注釋指的是這個(gè)物種所有基因的功能注釋信息而不是選擇集的基因功能注釋。比如茅姜，做擬南芥的闪朱，大概有2w+個(gè)基因的功能注釋，拿這個(gè)做背景钻洒；而不是拿差異表達(dá)的幾百上千個(gè)基因的注釋做背景奋姿。（算我求各位了，好好看看教程吧....別再做傻事了......）
具體如何做物種所有基因的背景注釋素标，請(qǐng)參考前述推文《零基礎(chǔ)快速完成基因功能注釋 / GO / KEGG / PFAM...》称诗。
使用 TBtools 進(jìn)行ORA模式的GO富集分析
首先，打開 TBtools GO 富集分析界面
整體如上头遭，一共三個(gè)文件：
- go-basic.obo 文件寓免，可以從下述鏈接下載，也可以點(diǎn)擊按鈕下載
http://purl.obolibrary.org/obo/go/go-basic.obo
- 一個(gè)物種所有基因的GO注釋信息文件计维，請(qǐng)參考前述推文《零基礎(chǔ)快速完成基因功能注釋 / GO / KEGG / PFAM...》袜香。
- 一個(gè)基因選擇集合，如差議表達(dá)基因集合鲫惶，或GWAS篩選出來的集合蜈首，或者其他
具體示例如下
點(diǎn)擊 Start ，隨后等待即可欠母。完成時(shí)會(huì)有彈窗提示欢策。查看輸出文件
一般，建議用戶只看“*.final.xls”文件赏淌。大部分人關(guān)注的是這三列
（寫到這里猬腰，突然覺得這些都沒啥意思，不知為何....就不詳細(xì)寫了猜敢，大伙自己看看列名姑荷，猜猜吧）
很多時(shí)候，我們會(huì)選擇缩擂，篩選第一列鼠冕，只看 Biological Process。一般這些與我們的生物學(xué)認(rèn)知會(huì)貼近一些胯盯。
當(dāng)然懈费，你拿著這個(gè)文件，可以直接在 TBtools 里面可視化
于是你得到
寫在最后
基因集合功能富集分析博脑，是一個(gè)常常被談起的話題憎乙，甚至近期都有不少新方法或算法被提出票罐。感興趣的朋友可以去了解。這份教程泞边，只與大伙說最簡(jiǎn)單该押，但也是使用最為廣泛的一種富集分析模式。無論是不是 TBtools 用戶阵谚，理論上來說蚕礼，都可以輕松理解并掌握，從原理到實(shí)踐梢什。
寫到一半奠蹬，其實(shí)我已經(jīng)不想寫了。原因非常簡(jiǎn)單嗡午，這也是為什么在我之前囤躁，并沒有一個(gè)人寫出來 TBtools 類似的工具。不是寫不了荔睹，而是不想寫割以。有時(shí)候，隨著能力增長(zhǎng)和知識(shí)積累应媚，往往不再愿意做一些簡(jiǎn)單的事情严沥。或許這還涉及到年齡的增長(zhǎng)中姜，角色的轉(zhuǎn)變消玄，責(zé)任的變化....云云。
小時(shí)候丢胚，我以為寫 TBtools 玩玩翩瓜；
后來，我以為我會(huì)一直寫下去携龟；
現(xiàn)在兔跌，，峡蟋，坟桅，，蕊蝗，
