1.為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白？
答：原因有很多：
a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)沛厨，換一種細(xì)胞刚照；
b) 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了刑巧，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性无畔；
c) 你的抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白啊楚，多看看說(shuō)明，看是否有問(wèn)題浑彰。
2.我的細(xì)胞提取液有的有沉淀恭理，有的很清亮，為什么呢郭变？
答：a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻](méi)有變性完全颜价，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)诉濒；
b) 也不排除你的抗原濃度過(guò)高周伦，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。
3.我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD),請(qǐng)問(wèn)怎么做WB未荒？
答：可以選擇0.2μml的膜专挪，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起茄猫，再轉(zhuǎn)移狈蚤。其他按步驟即可。
4.我的目的帶很弱划纽，怎么加強(qiáng)脆侮？
答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的勇劣。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低靖避。
5.膠片背景很臟，有什么解決方法比默？
答：減少抗原上樣量幻捏，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r(shí)間命咐，提高牛奶濃度篡九。?
6.目標(biāo)帶是空白，周圍有背景醋奠，是為什么榛臼？
答：你的一抗?jié)舛容^高伊佃，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)沛善，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)航揉，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”金刁。將一抗和二抗?jié)舛冉档退浚蚋鼡Q新底物。
7.我的膠片是一片空白尤蛮，是怎么回事媳友？
答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)抵屿，將底物消耗光庆锦；
b) ECM底物中H2O2捅位，不穩(wěn)定轧葛，失活；
c) ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置艇搀；
d) 二抗失活尿扯。
8.我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片
是什么原因呢?
答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來(lái)就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善焰雕；
b) 顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)衷笋。
9.DAB好還是ECM好？
答：DAB 有毒矩屁，但是比較靈敏辟宗，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制吝秕，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)泊脐，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏烁峭，可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原容客。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。
10.抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大约郁，是怎么回事缩挑？
答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量鬓梅，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)供置，可以打開(kāi)二聚體；
b)蛋白本身的修飾如：糖基化绽快，磷酸化等芥丧。
11.蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上悲关，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了娄柳。為什么寓辱？
答：可能是：
a)樣品濃度過(guò)低；
b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠赤拒。
12.磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等秫筏？
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑肃弟，一般最好加免姿。但是不加也可以乐设，大部分時(shí)候是不用加的瘩蚪。
13.要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在抖所，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎金吗？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎罗珍？
答：① 免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位糊秆，但是不能精確定量始衅，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性冷蚂，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子汛闸，進(jìn)行定量蝙茶，但是不能定位。
② 兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用诸老，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)隆夯，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片别伏。
14.電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象
︶ 條帶呈笑臉狀
原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統(tǒng)溫度偏高厘肮。
︵ 條帶呈皺眉狀
原因：可能是由于裝置不合適愧口，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全轴脐。
拖尾
原因：樣品溶解不好调卑。
紋理（縱向條紋）
原因：樣品中含有不溶性顆粒。
條帶偏斜
原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜大咱。
條帶兩邊擴(kuò)散
原因：加樣量過(guò)多恬涧。
15.Western blot結(jié)果中背景較高可能的原因及建議
膜封閉不夠
延長(zhǎng)封閉的時(shí)間；選擇更加適合的封閉液碴巾。
一抗稀釋度不適宜
對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試溯捆，選擇最適宜的抗體稀釋度。
一抗孵育的溫度偏高
建議4℃結(jié)合過(guò)夜。
選擇的膜容易產(chǎn)生高背景
一般硝酸纖維素膜的背景會(huì)比PVDF膜低提揍。
膜在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中干過(guò)
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意保持膜的濕潤(rùn)啤月。
檢測(cè)時(shí)曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
減少曝光時(shí)間。
16.?Western blot結(jié)果中雜帶較多可能的原因及建議
目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)劳跃、糖基化位點(diǎn)谎仲、乙酰化位點(diǎn)等）刨仑，本身可以呈現(xiàn)多條帶郑诺。
查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息杉武，通過(guò)去修飾確定蛋白實(shí)際大小辙诞。
目的蛋白有其它剪切本
查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。
樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解
加入蛋白酶抑制劑轻抱；樣本處理時(shí)在冰上操作飞涂。
上樣量過(guò)高，太敏感
適當(dāng)減少上樣量祈搜。
一抗特異性不高
重新選擇或制備高特異性的抗體较店。
一抗不純
純化抗體
一抗或者二抗?jié)舛绕?/p>
降低抗體濃度。
17.Western?blot結(jié)果中無(wú)信號(hào)或顯示信號(hào)弱
可能的原因及建議
檢測(cè)樣本不表達(dá)目的蛋白
選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照夭问，用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性泽西。
檢測(cè)樣本低表達(dá)目的蛋白
提高上樣量曹铃，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑缰趋。
轉(zhuǎn)移不完全或過(guò)轉(zhuǎn)移
可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過(guò)頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流陕见。
抗體不能識(shí)別測(cè)試種屬的相關(guān)蛋白
購(gòu)買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說(shuō)明書(shū)秘血，確定其是否能夠交叉識(shí)別測(cè)試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白。
一抗孵育時(shí)間不足
建議4℃結(jié)合過(guò)夜评甜。
二抗與一抗不匹配
選擇針對(duì)一抗來(lái)源的種屬的抗體灰粮。
洗膜過(guò)度
洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，加入的去垢劑不宜過(guò)強(qiáng)或過(guò)多忍坷，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20粘舟。
18.其它現(xiàn)象
膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑
原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。
反白（條帶顯白色）
原因：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?/p>
蛋白分子量偏低或偏高
原因：膠濃度不適合佩研，高分子量要用低濃度膠柑肴；小分子蛋白要用高濃度膠。
19.安全問(wèn)題
操作有毒試劑時(shí)旬薯，帶手套和口罩晰骑，且操作揮發(fā)性試劑應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
