hello择诈，周二了，隔離的第二天出皇，一個人的日子總是難熬羞芍，耐得住寂寞的人，都成了圣人~~~郊艘，今天我們分享的文獻(xiàn)在Single-Cell, Single-Nucleus, and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Cholangiocyte and Mesenchymal Heterogeneity,題目上就可以看出來荷科，運(yùn)用到了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，單核轉(zhuǎn)錄組纱注，和空間轉(zhuǎn)錄組畏浆，2021年10月發(fā)表于Hepatology Communications,我們今天就來分享一下。
前面我們總結(jié)一下單核和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的優(yōu)缺點(diǎn)
scrna：
- 優(yōu)勢：scRNA-seq 才能區(qū)分 T 和 B 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞狞贱；
- 劣勢：組織解離會限制完全捕獲人類肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞部分的能力刻获；可能會在細(xì)胞中引入應(yīng)激反應(yīng)；線粒體基因組編碼的基因和編碼線粒體蛋白的核基因在 scRNA-seq 中的表達(dá)更高瞎嬉；細(xì)胞類型頻率在 scRNA-seq 中被扭曲将鸵。
snrna
- 優(yōu)勢：SnRNA-seq 比 scRNA-seq 捕獲了更多的基因多樣性；長鏈非編碼 RNA 在 snRNA-seq 中的表達(dá)比 scRNA-seq 高佑颇；
- 劣勢：snRNA-seq 包含的環(huán)境 RNA 比例顯著高于 scRNA-seq顶掉；
Abstract
人類肝臟的關(guān)鍵功能是通過肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的相互作用來協(xié)調(diào)的。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄方法的最新進(jìn)展使得能夠以前所未有的分辨率檢查人類肝臟挑胸。然而痒筒，與解離相關(guān)的細(xì)胞擾動會限制完全捕獲人類肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞部分的能力，從而限制了全面分析該器官的能力茬贵。在這里簿透，使用匹配的單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 和單核 RNA 測序 (snRNA-seq) 報告了來自人類肝臟的 73,295 個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄情況。 snRNA-seq 的添加能夠以單細(xì)胞分辨率表征區(qū)域間肝細(xì)胞解藻，揭示肝間充質(zhì)細(xì)胞罕見亞型的存在老充，并有助于檢測僅在體外分化實(shí)驗(yàn)中觀察到的膽管細(xì)胞祖細(xì)胞。然而螟左，只有使用 scRNA-seq 才能區(qū)分 T 和 B 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞啡浊，突出了應(yīng)用這兩種技術(shù)來獲得組織駐留細(xì)胞類型的完整圖譜的重要性。通過獨(dú)立的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集和免疫組織化學(xué)驗(yàn)證了肝細(xì)胞胶背、膽管細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞群的不同空間分布巷嚣。結(jié)論：研究對 scRNA-seq 和 snRNA-seq 捕獲的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了系統(tǒng)比較，并提供了健康人肝臟中實(shí)質(zhì)細(xì)胞群的高分辨率圖譜钳吟。
Introduction
肝臟是負(fù)責(zé)關(guān)鍵功能的重要器官廷粒，包括脂質(zhì)和葡萄糖代謝、蛋白質(zhì)合成、膽汁分泌和免疫功能坝茎。 單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 技術(shù)能夠分析單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組涤姊，并為人類肝臟的發(fā)育、生理學(xué)和病理學(xué)提供了重要的見解嗤放。 這些研究揭示了人類肝臟生理學(xué)以前無法獲得的方面砂轻，例如肝小葉分區(qū)、細(xì)胞間相互作用以及免疫細(xì)胞表型和異質(zhì)性斤吐。
此前搔涝，通過 scRNA-seq 檢查了人類肝臟的細(xì)胞復(fù)雜性，并確定了 20 個不同的細(xì)胞clusters和措，包括兩個不同的具有免疫調(diào)節(jié)和炎癥特性的肝臟駐留巨噬細(xì)胞群庄呈。這項工作的觀察結(jié)果是酶促和機(jī)械解離人類肝臟組織的數(shù)量顯著影響肝臟圖譜的組成，因?yàn)楦渭?xì)胞對解離誘導(dǎo)的損傷很敏感派阱，而我們的解離技術(shù)不能很好地釋放膽管細(xì)胞和肝間充質(zhì)細(xì)胞诬留，如肝星狀細(xì)胞 (HSC)（單細(xì)胞的解離技術(shù)還是對細(xì)胞有很大的損傷）。例如贫母，膽管細(xì)胞（即形成膽管的實(shí)質(zhì)細(xì)胞文兑，預(yù)計占所有肝細(xì)胞的 3%-5%）僅由我們的 8,444 個細(xì)胞 scRNA-seq 圖的 199 個 (0.64%) 細(xì)胞組成.捕獲膽管細(xì)胞異質(zhì)性是了解膽管病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，例如原發(fā)性硬化性膽管炎腺劣，目前尚無治愈性治療干預(yù)措施绿贞。
單核 RNA 測序 (snRNA-seq) 是一種繞過 scRNA-seq 所需的細(xì)胞解離步驟的方法，它使用去污劑從完整細(xì)胞中釋放細(xì)胞核橘原。 SnRNA-seq 數(shù)據(jù)還與可從組織檔案中獲得的速凍樣本兼容籍铁。最近，Slyper 等人評估了三種不同的核分離方案趾断，用于從冷凍組織中提取 snRNA-seq拒名，每種方案都使用不同的基于洗滌劑的緩沖液：Nonidet P40 與鹽和 Tris (NST)、Tween-20 與鹽和 Tris (TST)芋酌，以及CHAPS 含鹽和 Tris (CST)增显。在這里，使用這三種protocols進(jìn)行了匹配的 snRNA-seq脐帝，并使用發(fā)布的實(shí)驗(yàn)和分析工作流程對四個健康的人類肝臟樣本進(jìn)行了 scRNA-seq同云。在同一樣本上使用多個protocols能夠評估這三種 snRNA-seq protocols與 scRNA-seq protocols相比減少解離相關(guān)效應(yīng)的能力，對比每種協(xié)議測量的細(xì)胞表達(dá)譜腮恩，并開發(fā)一種整合方法將結(jié)果整合到更全面的單一map中梢杭。
工作突出了應(yīng)用于人類肝臟的 snRNA-seq 和 scRNA-seq 技術(shù)之間的細(xì)胞類型組成差異，并揭示了 snRNA-seq 數(shù)據(jù)特有的膽管細(xì)胞和肝間充質(zhì)細(xì)胞亞群秸滴，這些亞群以前在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中未發(fā)現(xiàn)。（單核作為補(bǔ)充募判，更加具有說服力）荡含。結(jié)合這兩種技術(shù)的結(jié)果創(chuàng)建了一個豐富的數(shù)據(jù)集咒唆，用于解釋人類肝臟生物學(xué)，以及識別兩種技術(shù)中定義關(guān)鍵細(xì)胞類型的標(biāo)記基因 释液。
Results
EXAMINING THE QUALITY OF LIVER MAPPING VIA SCRNA -SEQ VERSUS SNRNA -SEQ（scrna vs snrna）
單細(xì)胞和單核轉(zhuǎn)錄組是從四個健康的人類肝臟中產(chǎn)生的全释，這些肝臟來自正在接受移植到活體受體的神經(jīng)系統(tǒng)死亡供體。 總共從新鮮的肝臟解離物中捕獲了 29,432 個單細(xì)胞误债，從匹配的速凍組織中捕獲了 43,863 個單核浸船，并使用 10× Chromium 平臺進(jìn)行了測序。 這些數(shù)據(jù)經(jīng)過相同的質(zhì)量控制處理寝蹈，并系統(tǒng)地比較匹配的樣本李命。
SnRNA-seq 比 scRNA-seq 捕獲了更多的基因多樣性。 這些差異主要是由于 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中獨(dú)特分子標(biāo)識符的比例很高箫老，這些獨(dú)特分子標(biāo)識符來自編碼核糖體蛋白的轉(zhuǎn)錄本和線粒體基因組中編碼的基因封字，而這些在 snRNA-seq 數(shù)據(jù)中不存在。 在用于提取細(xì)胞核的不同去污劑之間觀察到最小的差異耍鬓。 此外阔籽，對于大多數(shù)樣本，snRNA-seq 包含的環(huán)境 RNA 比例顯著高于 scRNA-seq牲蜀，由 SoupX 估計得到的結(jié)果（這一段是比較單核和單細(xì)胞之間的優(yōu)劣勢）笆制。
INTEGRATING SCRNA -SEQ AND SNRNA -SEQ MAPS
使用典型的計算處理流程，scRNA-seq 和 snRNA-seq 數(shù)據(jù)不會聚集在一起涣达，因?yàn)榧?xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的 RNA 與細(xì)胞質(zhì)之間存在系統(tǒng)差異（技術(shù)帶來的批次效應(yīng)還是難以逾越）项贺。 在組織處理和細(xì)胞處理過程中可能會引入額外的技術(shù)混雜效應(yīng)。 scRNA-seq 樣本來源于酶解和機(jī)械解離的新鮮組織峭判，這可能會在細(xì)胞中引入應(yīng)激反應(yīng)开缎。 相比之下，snRNA-seq 樣本是從快速冷凍的組織中提取的林螃，受解離相關(guān)應(yīng)力的影響應(yīng)該較小奕删。 此外，當(dāng)使用相同的測序技術(shù)時疗认，我們發(fā)現(xiàn)個體供體之間存在顯著的批次效應(yīng)完残，特別是在肝細(xì)胞中。 這可能與環(huán)境對肝臟代謝的影響有關(guān)横漏，并且與我們之前報道的 scRNA-seq 肝臟圖譜一致谨设。
SYSTEMATIC DIFFERENCES IN NUCLEAR AND WHOLE-CELL TRANSCRIPTOMES
單獨(dú)擴(kuò)展數(shù)據(jù)集以整合 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的必要性表明，這些技術(shù)生成的數(shù)據(jù)之間存在顯著的系統(tǒng)基因表達(dá)差異缎浇。檢查這些系統(tǒng)差異表達(dá)的基因表明扎拣，基因功能和基因長度都與通過 scRNA-seq 或 snRNA-seq 測量的表達(dá)密切相關(guān)。由線粒體基因組編碼的基因和編碼線粒體蛋白的核基因在 scRNA-seq 中的表達(dá)更高。同樣二蓝，編碼核糖體相關(guān)蛋白的 mRNA 在 scRNA-seq 中的表達(dá)比在 snRNA-seq 中高 4 倍多誉券。這是意料之中的，因?yàn)榫€粒體和核糖體普遍存在于肝細(xì)胞（尤其是肝細(xì)胞）的細(xì)胞質(zhì)中刊愚，而 snRNA-seq 材料輸入中大多缺少細(xì)胞質(zhì)踊跟。相比之下，其他“看家”蛋白質(zhì)編碼基因在 snRNA-seq 和 scRNA-seq 中同樣表達(dá)鸥诽。與其他組織的結(jié)果一致商玫，長鏈非編碼 RNA 在 snRNA-seq 中的表達(dá)比 scRNA-seq 高 0.7 倍；然而牡借，這與其他非管家蛋白質(zhì)編碼基因沒有顯著差異拳昌，后者在 snRNA-seq 中的表達(dá)高 0.8 倍.
除了基因功能，總基因長度與 snRNA-seq 與 scRNA-seq 中的相對表達(dá)具有最強(qiáng)的相關(guān)性蓖捶。 較長的基因 (>37 kb) 在 snRNA-seq 中的表達(dá)更高地回，而短的基因 (<15 kb) 在 scRNA-seq 中的表達(dá)更高。 即使在排除核糖體和線粒體相關(guān)基因后也是如此俊鱼。 (這方面以前還真沒注意到)刻像。
CELLS OF THE HUMAN LIVER AS REVEALE D BY SCRNA -SEQ VERSUS SNRNA -SEQ
整合后（整合的方法我們下面分享），使用已知標(biāo)記對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類和注釋并闲； 結(jié)果圖顯示了所有主要的已知肝細(xì)胞類型细睡。 這些細(xì)胞類型在 scRNA-seq 和 snRNA-seq 以及所有樣本中都有代表，但以不同的頻率捕獲帝火。 特別是溜徙，與具有 3% 淋巴細(xì)胞和 5% 巨噬細(xì)胞的 snRNA 序列相比，scRNA-seq 捕獲了更高比例的免疫細(xì)胞犀填，其中 7% 的細(xì)胞被測序確定為淋巴細(xì)胞蠢壹，9% 被確定為巨噬細(xì)胞。 相比之下九巡，snRNA-seq 捕獲的膽管細(xì)胞和肝間充質(zhì)細(xì)胞比 scRNA-seq 多 50%图贸。 我們用這兩種方法獲得了相似百分比的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞 (LSEC) 和內(nèi)皮細(xì)胞。 然而冕广，這些頻率取決于用于 snRNA-seq 的洗滌劑疏日。 CST 和 NST 提取了較高頻率的 LSEC（分別為 25% 和 20%）和較高頻率的間充質(zhì)細(xì)胞（CST 中為 7%，NST 中為 12%）撒汉，但肝細(xì)胞的頻率較低沟优。
HEPATOCYTES
肝細(xì)胞是肝小葉的主要實(shí)質(zhì)細(xì)胞，負(fù)責(zé)大部分肝功能睬辐。它們表現(xiàn)出從中央周圍靜脈到門靜脈周圍區(qū)域的功能分區(qū)挠阁。最近的工作已經(jīng)證明了區(qū)域間肝細(xì)胞對肝臟穩(wěn)態(tài)和再生的重要性宾肺，但由于缺乏已知的標(biāo)記物，它們很難識別鹃唯。對我們的肝細(xì)胞clusters進(jìn)行亞聚類顯示了來自 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的六個不同的clusters爱榕，以及在所有樣本中瓣喊。將這些clusters與小鼠肝小葉顯微解剖區(qū)域的分區(qū)表達(dá)相關(guān)聯(lián)坡慌，可以將這些clusters中的三個注釋為包含中央周圍或門靜脈周圍肝細(xì)胞。這些注釋使用已知的周圍標(biāo)記基因（細(xì)胞色素 P450 3A4 [CYP3A4]藻三、乙醇脫氫酶 4 [ADH4]洪橘、谷氨酸氨連接酶 [GLUL] 和丁酰膽堿酯酶 [BCHE]）和門靜脈標(biāo)記基因（組氨酸解氨酶 [HAL] 、氨基甲酰磷酸合酶 1 [CPS1] 和 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 合酶 1 [HMGCS1])棵帽。在剩下的三個亞群中熄求，一個與小鼠第 7 層相關(guān)性最強(qiáng)；另一個與小鼠第 5 層相關(guān)性最強(qiáng)逗概，表明這兩個clusters（IZ1 和 IZ2）代表人類區(qū)域間肝細(xì)胞弟晚。我們通過將其與源自人類顯微解剖肝小葉區(qū)域的大量 RNA-seq 進(jìn)行比較來驗(yàn)證推定的區(qū)域間肝細(xì)胞身份，其中這些clusters與區(qū)域間層 4 的相關(guān)性最強(qiáng)逾苫。從這兩個clusters（組氨酸三聯(lián)體核苷酸結(jié)合蛋白 1 [HINT1] 卿城、細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 7C [COX7C]、載脂蛋白 C1 [APOC1]铅搓、脂肪酸結(jié)合蛋白 1瑟押、肝臟 [FABP1]、金屬硫蛋白 2A [MT2A]星掰、金屬硫蛋白 1G [MT1G] 和泛醌氧化還原酶亞基 B1 [NDUFB1]）進(jìn)行了驗(yàn)證使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和免疫組織化學(xué)多望，它們表現(xiàn)出與周圍或中心標(biāo)記明顯不同的表達(dá)模式，但仍然模棱兩可（具有不確定性）氢烘。
最后一組表達(dá)白蛋白 (ALB) 的肝細(xì)胞表達(dá)門靜脈周圍肝細(xì)胞標(biāo)志物怀偷，如絲氨酸蛋白酶抑制劑家族 A 成員 1 (SERPINA1)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白 (TTR)播玖、載脂蛋白 A1 (APOA1) 和載脂蛋白 C3 (APOC3)椎工。 然而，該cluster與門靜脈周圍的小鼠血竇區(qū)域沒有強(qiáng)烈的相關(guān)性黎棠，也沒有表達(dá)許多其他的門靜脈周圍標(biāo)記基因晋渺，如 HAL、CPS1 和 HMGCS1脓斩。 此外木西，表達(dá)譜與人類血竇的帶間層 4 相關(guān)性最強(qiáng)，但與任何小鼠分區(qū)層無關(guān)（頂部差異表達(dá)基因 (DE)：ALB随静、SERPINA1八千、APOA1吗讶、觸珠蛋白 [HP]、鐵蛋白輕鏈 [FTL]恋捆、APOC3照皆、血清淀粉樣蛋白 A1 [SAA1]、穩(wěn)定蛋白 1 [STAB1]沸停、TTR膜毁、β-2-微球蛋白 [B2M] 和 LIF 受體亞基 α [LIFR]）。 這些結(jié)果表明該cluster可能代表人類特異性的區(qū)域間肝細(xì)胞cluster愤钾，但需要進(jìn)一步的工作來確認(rèn)這一特性瘟滨。
在 scRNA-seq 和 snRNA-seq 中，整個肝細(xì)胞的捕獲效果一樣好能颁；然而杂瘸，中心靜脈 (CV1) 肝細(xì)胞在 snRNA-seq 中的頻率幾乎是 scRNA-seq 的兩倍（17% 對 9%；P < 10-30）伙菊。相比之下败玉，區(qū)域間肝細(xì)胞在 scRNA-seq 中最常見（15% 和 9% 對 8% 和 3%；P < 10-15）镜硕。盡管存在這些差異运翼，但觀察到幾乎所有與肝細(xì)胞相關(guān)的途徑都在 snRNA-seq 衍生的肝細(xì)胞中表現(xiàn)出升高的表達(dá)。通過 snRNA-seq 在 CV1 肝細(xì)胞中鑒定的幾個重要基因未通過 scRNA-seq 鑒定谦疾，而門靜脈周圍肝細(xì)胞的基因表達(dá)模式在兩種技術(shù)中顯著相關(guān)南蹂。區(qū)域間肝細(xì)胞存在最大的不一致，其中許多在 snRNA-seq 中上調(diào)的基因在 scRNA-seq 中下調(diào)念恍。這可能反映了由于 scRNA-seq 所需的解離六剥，肝細(xì)胞內(nèi)的活力差或細(xì)胞狀態(tài)被破壞，而用 snRNA-seq 檢查肝細(xì)胞時不存在這種解離峰伙。因此疗疟，盡管捕獲率相似，但 snRNA-seq 可能比 scRNA-seq 提供更好的肝細(xì)胞表征瞳氓。
CHOLANGIOCYTES
膽管細(xì)胞是排列在膽管內(nèi)的上皮細(xì)胞策彤，占總膽汁量的 30%。 之前嘗試僅使用 scRNA-seq 來表征這些細(xì)胞匣摘，僅鑒定了一個群體店诗，其中包含 1.4%（8,444 個中的 199 個）表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)志物（上皮細(xì)胞粘附分子 [EPCAM]、SRY（性別決定區(qū)域 Y））的細(xì)胞 - 框 9 [SOX9] 和角蛋白 1 [KRT1])音榜。 (差異還是很大)庞瘸。
在本研究中，發(fā)現(xiàn) snRNA-seq 捕獲了更高比例的 KRT7赠叼、SOX9 和膜聯(lián)蛋白 A4 (ANXA4) 表達(dá)膽管細(xì)胞（3.4% 對 2.4%）擦囊，總共產(chǎn)生 448 個膽管細(xì)胞樣細(xì)胞违霞。 對這個 KRT7+ SOX9+ 群體進(jìn)行亞聚類揭示了六個轉(zhuǎn)錄不同的亞群（標(biāo)記為 Chol-1 到 Chol-6）。 鑒定了三個去唾液酸糖蛋白受體 1 陽性 (ASGR1+) 肝細(xì)胞樣cluster瞬场、兩個典型的膽管細(xì)胞樣cluster（KRT7买鸽、KRT18 和溶質(zhì)載體家族 4 成員 2 [SLC4A2] 高）和一組祖細(xì)胞，其中 82% 來源于snRNA-seq贯被。 這些cluster并非特定于特定樣本或供體眼五，表明它們不是批次效應(yīng)或供體特定變異的結(jié)果。 相反刃榨，這些cluster形成了從雙能祖細(xì)胞延伸到肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞命運(yùn)的分支軌跡弹砚。
在膽管細(xì)胞分支最分化的一端是 Chol-4 群双仍，其中包含成熟的膽管細(xì)胞枢希，表達(dá)分化的膽管細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物（top DE：水通道蛋白 1 [AQP1]、KRT8朱沃、KRT18苞轿、KRT7、防御素 1 [DEFB1]逗物、CD24 搬卒、聚合免疫球蛋白受體 [PIGR] 和 ANXA4)，其中許多對人類膽管具有高度特異性翎卓。此外契邀，經(jīng)典的膽管細(xì)胞通路，如細(xì)胞極性失暴、離子轉(zhuǎn)運(yùn)坯门、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和許多免疫通路，在該cluster中上調(diào)的基因中富集逗扒。 該clusters的細(xì)胞以同等量度源自 scRNA-seq 和 snRNA-seq古戴，并且顯著上調(diào)的標(biāo)記物，包括 AQP1矩肩、分泌型磷蛋白 1 [SPP1] 和 DEFB1现恼，在兩種技術(shù)中相對一致。 因此黍檩，成熟的膽管細(xì)胞可以通過 snRNA-seq 或 scRNA-seq 很好地表征叉袍。
分化程度較低的膽管細(xì)胞群 (Chol-5) 對 snRNA-seq 具有特異性（177 個細(xì)胞核對 33 個細(xì)胞）抒钱。膽管細(xì)胞特性通過關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（肝細(xì)胞核因子-1-β [HNF1B]昼丑、一切同源框 1 [ONECUT1] 和 SOX9）的表達(dá)和 WNT 信號、ABC 和離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的富集得到證實(shí)罗洗。根據(jù) B 細(xì)胞白血病/淋巴瘤 2 (BCL2) 表達(dá)確定該clusters包含特定的小膽管細(xì)胞肛跌，而大膽管細(xì)胞不表達(dá)艺配。通過免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn) BCL2 的膽管限制性表達(dá)證實(shí)了這一點(diǎn)察郁。我們注意到該clusters中許多干性標(biāo)記的高表達(dá)，這與先前關(guān)于這些膽管細(xì)胞分化程度較低的表型的報道一致转唉。使用 snRNA-seq（CYP3A5皮钠、PPARG 共激活因子 1 α [PPARGC1A]、脆性組氨酸三聯(lián)體二腺苷三磷酸酶 [FHIT]赠法、含有黃素的二甲基苯胺單加氧酶 5 [FMO5]麦轰、色氨酸 2,3-雙加氧酶 [TDO2] 和SOX6);然而，這些并沒有在 scRNA-seq 中重述砖织，隨后強(qiáng)化了這一群體只能使用 snRNA-seq 來表征.
在對面分支的遠(yuǎn)端是 Chol-3款侵，一個中央靜脈肝細(xì)胞樣細(xì)胞群，表達(dá)高水平的 CYP3A4侧纯、glypican 6 (GPC6) 和醛氧化酶 1 (AOX1)新锈。 這些細(xì)胞與膽管細(xì)胞聚集在一起，因?yàn)樗鼈兏弑磉_(dá)許多膽汁代謝基因（即 ATP 結(jié)合盒亞家族 A 成員 8 [ABCA8]眶熬、ABCA6妹笆、羥基酸氧化酶 1 [HAO1]、ABCA1 和 SLC27A2）娜氏，表明參與膽汁功能拳缠。 有趣的是，這些細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞核因子 4 (HNF4a)贸弥，它首先在祖肝細(xì)胞中表達(dá)窟坐，是肝細(xì)胞分化的中樞調(diào)節(jié)因子。
另外兩個偏向肝細(xì)胞的clusters Chol-2 和 Chol-6 表達(dá)了一些典型的膽管細(xì)胞標(biāo)志物（KRT7绵疲、SOX9 和 CD24）哲鸳，但也表達(dá)了早期肝細(xì)胞譜系定義轉(zhuǎn)錄因子（HNF4a、叉頭盒 A2 [FOXA2]最岗、prospero homeobox 1 [PROX1]帕胆、ONECUT1 和 ONECUT2），表明中間或祖細(xì)胞表型般渡。 Chol-6 和 Chol-2 的高表達(dá)基因與祖細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物相關(guān)懒豹，例如 FOXA2、成纖維細(xì)胞生長因子受體 3 (FGFR3)驯用、多毛和分裂 1 增強(qiáng)子 [HES1] 和鋸齒狀規(guī)范缺口配體 1 (JAG1) 脸秽。 clusters之間的主要區(qū)別是 Chol-6 中增殖相關(guān)基因的表達(dá)，表明這些細(xì)胞是增殖性和非增殖性肝祖細(xì)胞蝴乔。
在這些偏向譜系的分支的根部是一大群雙能祖細(xì)胞（Chol-1）记餐，其中包含主要測序的單核（621 個核對 134 個細(xì)胞）。該cluster不表達(dá)成熟的膽管細(xì)胞標(biāo)記薇正，而是許多莖樣和祖細(xì)胞標(biāo)記的集合片酝，包括 pou 5 類同源框 1 (POU5F1)囚衔、FOXO2、矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2 (RUNX2)雕沿、SOX6练湿、CD133、丙氨酰氨肽酶审轮、膜 (ANPEP) 和 SOX9肥哎。該cluster的這些特征與之前僅在體外觀察到的雙能祖細(xì)胞一致。此外疾渣，通過通路分析篡诽，確定了 NOTCH2 信號通路（notch 受體 2 [NOTCH2]，免疫球蛋白 kappa J 區(qū)的重組信號結(jié)合蛋白 [RBPJ ]榴捡，像轉(zhuǎn)錄共激活因子 2 [MAML2]杈女、MAML3、MAML4) 作為這些祖細(xì)胞的一個關(guān)鍵特征薄疚。內(nèi)胚層碧信、細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂途徑在這個群體中相對于支持干樣狀態(tài)的其他集群而言是富集的。在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和公開的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)中街夭，Chol-1 的標(biāo)記基因（即 FOXO3、GATA 結(jié)合蛋白 6 [GATA6]躏筏、FGFR3 和 ANPEP）定位于膽管板丽，表明這些可能是祖細(xì)胞生態(tài)位。
使用此處提供的組合圖譜作為參考趁尼，能夠使用自動注釋工具 scmap-cell 來識別和標(biāo)記在我們之前的地圖中無法檢測到的兩個不同的膽管細(xì)胞子集埃碱。 我們從成熟膽管細(xì)胞 (Chol-4) 和少量雙能祖細(xì)胞 (Chol-1) 中鑒定出細(xì)胞，這些細(xì)胞只能使用 snRNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定酥泞，證明了我們組合的 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的效用肝臟圖譜砚殿。
LIVER MESENCHYMAL CELLS
各種間充質(zhì)細(xì)胞群，如 HSC芝囤、成纖維細(xì)胞 (FB) 和血管平滑肌細(xì)胞 (VSMC) 已被提議作為致病性肌成纖維細(xì)胞的來源似炎，它們通過產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白促進(jìn)肝損傷后的纖維化。設(shè)計理想的抗纖維化療法專門針對疾病中的肌成纖維細(xì)胞悯姊，必須描述這些間充質(zhì)細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)時的基礎(chǔ)細(xì)胞功能羡藐。 以前的單細(xì)胞研究側(cè)重于間充質(zhì)的異質(zhì)性，特別是疾病或損傷期間的 HSC悯许，通常利用額外的細(xì)胞處理步驟來豐富這些細(xì)胞仆嗦。 對我們的間充質(zhì)細(xì)胞clusters進(jìn)行亞聚類顯示，健康肝臟中存在七個不同的群體 (Mes1-7)先壕，其中只有 Mes1瘩扼、2 和 4 包含用 scRNA-seq 捕獲的 10 多個細(xì)胞谆甜，并且在所有樣本中只有 Mes4 被兩種方法大致相等地捕獲。
總體而言集绰，間充質(zhì)細(xì)胞由 2.5% 的單核組成店印，是其 1% 捕獲的單細(xì)胞的兩倍多。 使用 snRNA-seq倒慧，我們揭示了健康肝臟中低頻率存在的 VSMC 和 FB 的轉(zhuǎn)錄組按摘。
在生理條件下，HSCs 保持靜止和非增殖表型纫谅，并位于 Disse 空間中的 LSECs 和肝細(xì)胞層之間炫贤。活化的 HSCs 被認(rèn)為是肝纖維化中肌成纖維細(xì)胞池的主要貢獻(xiàn)者付秕，其特征在于含有視黃醇的脂滴的丟失兰珍，收縮表型的發(fā)展，以及膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)重塑蛋白的產(chǎn)生询吴。 Mes1掠河、5 和 7 表達(dá) HSC 相關(guān)的視黃醇儲存基因，而其余的則表達(dá)肌成纖維細(xì)胞相關(guān)的基因猛计。為了進(jìn)一步確定這些cluster的細(xì)胞特性唠摹，我們使用先前發(fā)表的來自健康和四氯化碳誘導(dǎo)的纖維化小鼠肝臟的熒光激活細(xì)胞分選的 HSC、FB 和 VSMC 的轉(zhuǎn)錄組特征進(jìn)行了跨物種相關(guān)性分析奉瘤。與健康和纖維化 HSC 特征密切相關(guān)的間充質(zhì)cluster是 Mes1勾拉。 70% 的間充質(zhì)細(xì)胞核由專門負(fù)責(zé)維生素 A 儲存和代謝的靜止 HSC（Mes-1 和 Mes-5）組成，RBP1盗温、卵磷脂視黃醇跖涸蓿基轉(zhuǎn)移酶 (LRAT) 和磷酸二酯酶 3B (PDE3B) 高表達(dá)。Mes1 在肝細(xì)胞中特異性表達(dá)生長因子 (HGF)卖局，它是肝臟再生和肝細(xì)胞分化和生長的關(guān)鍵生長因子斧蜕，并顯示出預(yù)期的神經(jīng)元通路富集。 Mes5 表達(dá)抗原呈遞基因并顯示出與脂肪和水溶性維生素相關(guān)的通路富集砚偶、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和有機(jī)酸代謝批销。脂質(zhì)代謝和纖維蛋白凝塊途徑和炎癥相關(guān)基因的存在表明這些可能代表活化的 HSC。 Mes7 是表達(dá) RBP1蟹演、HGF风钻、LRAT 和核心蛋白聚糖 (DCN) 的最小細(xì)胞cluster，但許多淋巴細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的存在表明它們可能是雙細(xì)胞酒请。
來自 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的 Mes2 和 Mes4 轉(zhuǎn)錄組與小鼠 FB 特征密切相關(guān)骡技，而 Mes3 和 Mes6 與 VSMC 特征相關(guān)，而不是來自慢性纖維化小鼠肝臟的活化 HSC。 這些觀察結(jié)果適用于 scRNA-seq 和 snRNA-seq布朦。 Mes2 細(xì)胞是數(shù)據(jù)集中第二常見的細(xì)胞群（24% 的細(xì)胞核）囤萤。 與 Mes4（AOX1、PDE3D 和 PDE4D）相比是趴，它們表達(dá)了更多的脂質(zhì)加工基因涛舍，以及補(bǔ)體級聯(lián)通路的富集，但缺乏典型的 HSC 標(biāo)志物和強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物唆途。 此外富雅，該cluster還顯示細(xì)胞因子和生長因子受體以及血管生成和增殖因子（即轉(zhuǎn)化生長因子 1 [TGFB1]、2 型轉(zhuǎn)化生長因子受體 [TGFBR2]）的表達(dá)肛搬，表明它們可能是肝 FB 没佑。
其他三個非 HSC Mes clusters僅包含 10% 的間充質(zhì)細(xì)胞核（1,069 個中的 112 個），并且包含組織重塑細(xì)胞類型的異質(zhì)子集温赔。肌成纖維細(xì)胞通常在肝損傷后出現(xiàn)蛤奢，以響應(yīng)細(xì)胞因子、局部損傷陶贼、生長因子和纖維化信號啤贩。與 Mes2 相比，Mes4 具有豐富的與炎癥信號傳導(dǎo)拜秧、膠原蛋白產(chǎn)生和基質(zhì)重塑相關(guān)的通路痹屹，并表達(dá)高水平的纖維化和肌成纖維細(xì)胞相關(guān)基因。 Mes4 和 Mes6 都表達(dá)了幾個激活相關(guān)基因 [ACTA2腹纳、分泌蛋白酸性和富含半胱氨酸 (SPARC)痢掠、轉(zhuǎn)凝膠蛋白 (TAGLN)、1 型膠原蛋白 α 1 鏈 (COL1A1) 和 TIMP 金屬肽酶抑制劑 1 (TIMP1)]嘲恍，并富集兩個clusters中的途徑包括膠原蛋白形成、細(xì)胞外基質(zhì)和整合素信號傳導(dǎo)雄驹。此外佃牛，Mes4 富含衰老相關(guān)通路和炎癥基因（白細(xì)胞介素 32 [IL-32]、集落刺激因子 1 [CSF1]医舆、TNF 超家族成員 10 [TNFSF10]俘侠、CC 基序趨化因子配體 2 [CCL2] 和 IL6ST )，表明更活躍的 FB 表型蔬将。 Mes6 表達(dá) VSMC 標(biāo)志物爷速，如鈣調(diào)蛋白 2 (CNN2)、肌球蛋白輕鏈 9 (MYL9)霞怀、TAGLN 和 ACTA2惫东、高水平的纖維化生長因子，并富含收縮表型，表明 VSMC 處于纖維化狀態(tài)廉沮。 Mes3 細(xì)胞核也表達(dá) ACTA2颓遏、MYL9 和 TAGLN，但不表達(dá)膠原蛋白或基質(zhì)重塑物或靜止的 HSC 基因滞时。相反叁幢，這個cluster富含支持血管生成和局部細(xì)胞增殖（細(xì)胞凋亡）的基因，表明 VSMC 狀態(tài)的激活程度較低
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)獨(dú)立證實(shí) HSC 基因表達(dá)（Mes1 和 5）更高并分散在整個肝組織中坪稽，而 VSMC（Mes3 和 6）和 FB（Mes2 和 4）主要位于門靜脈周圍區(qū)域曼玩，如前所述。 由于這些clusters中的大多數(shù)主要在 snRNA-seq 數(shù)據(jù)中被識別出來窒百，因此 snRNA-seq 數(shù)據(jù)中的大多數(shù)差異表達(dá)基因在 scRNA-seq 樣本中沒有被識別為顯著性黍判，這增強(qiáng)了捕獲肝間充質(zhì)細(xì)胞的聯(lián)合方法的價值。
當(dāng)然還有其他細(xì)胞類型的比較贝咙，這里我們就不再過多介紹了样悟。
Discussion
比較應(yīng)用于四個健康人肝臟樣本的 scRNA-seq 和 snRNA-seq protocols揭示了幾個顯著差異。這兩種技術(shù)都產(chǎn)生了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)庭猩，可以闡明人類肝臟中的主要細(xì)胞分類窟她。然而，細(xì)胞類型頻率在 scRNA-seq 中被扭曲蔼水，這主要是由于與實(shí)質(zhì)細(xì)胞相比震糖，免疫細(xì)胞對組織解離的彈性。這些差異會影響每種方法對描述相應(yīng)細(xì)胞類型亞型的敏感性趴腋。 SnRNA-seq 能夠檢測膽管細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的許多其他細(xì)胞亞型吊说，這些細(xì)胞亞型使用 scRNA-seq 難以區(qū)分。例如优炬，該數(shù)據(jù)集中提供的小管膽管細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜可作為評估小管膽管病變（如原發(fā)性膽汁性膽管炎 (PBC)）中的膽管細(xì)胞與健康肝臟中的膽管細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上的差異的參考颁井。 此外，該平臺可能允許區(qū)分知之甚少的自身免疫性肝病的細(xì)胞lanscope差異蠢护，例如區(qū)分 PBC 和原發(fā)性硬化性膽管炎雅宾，原發(fā)性硬化性膽管炎是一種主要影響大膽管的疾病。
肝內(nèi)免疫landscope的完整表征對于了解肝病的發(fā)病機(jī)制也至關(guān)重要葵硕。 盡管細(xì)胞核分析具有優(yōu)勢眉抬，但許多重要的免疫細(xì)胞標(biāo)志物在 snRNA-seq 數(shù)據(jù)中完全不存在。 例如懈凹，在我們的 snRNA-seq 樣本中沒有檢測到 T 細(xì)胞或 B 細(xì)胞受體成分蜀变。 因此，我們建議調(diào)查肝內(nèi)免疫群體的研究使用 scRNA-seq介评。
snRNA-seq 克服與組織解離相關(guān)的限制并以高分辨率捕獲實(shí)質(zhì)細(xì)胞的能力為詳細(xì)檢查健康和疾病中實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用開辟了一條途徑库北。 此外，在冷凍組織中執(zhí)行 snRNA-seq 的能力可以以單細(xì)胞分辨率檢查生物樣本庫。 總之贤惯，我們已經(jīng)證明單細(xì)胞和單核 RNA-seq 從正常肝臟樣本中生成高質(zhì)量數(shù)據(jù)洼专，使用 snRNA-seq 可以更好地檢查稀有肝臟基質(zhì)細(xì)胞，包括 FB孵构、HSC 和 VSMC屁商，以及實(shí)質(zhì)細(xì)胞 如膽管細(xì)胞。 該組合數(shù)據(jù)集可以對實(shí)質(zhì)細(xì)胞復(fù)雜性進(jìn)行復(fù)雜檢查颈墅，并為單細(xì)胞肝病研究提供基礎(chǔ)蜡镶。
Method
首先來關(guān)注一下單核數(shù)據(jù)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)的整合方法
DATA INTEGRATION AND CLUSTER
The data were integrated using default parameters of Harmony,then clustered using Seurat’s SNN-Louvain clustering algorithm.The data were clustered using 30 sets of parameters, and the most consistent clusterings were identified using apcluster on the cluster–cluster distance matrix calculated using the Variation of Information criterion.The full description of data integration and clustering can be found in the extended methods.
生活很好，有你更好
