一、實驗目的
? ? 掌握蛋白類藥物SDS-PAGE法檢測分子量和純度的原理和方法朗兵。
二、實驗原理
? ? SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS-PAGE)，也叫變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種含有蛋白變性劑SDS（十二烷基硫酸鈉）的常用電泳技術(shù)蛤吓，常用于檢測蛋白質(zhì)。
? 聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE一般采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)氓辣，即含有不同孔徑的兩層凝膠：上層膠（5%濃縮膠）和下層膠（分離膠），濃縮膠孔徑較大忱屑，不同大小的蛋白質(zhì)分子泳動速率相同幔崖，較稀的樣本經(jīng)過濃縮膠的遷移作用被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶，當進入小孔徑的分離膠后，不同大小蛋白質(zhì)由于所帶電荷不同梅誓，表現(xiàn)出不同的遷移率绵载，由于分子篩效應和電荷效應，使不同蛋白質(zhì)在同一電場中能夠有效的分離摹察。
? 蛋白樣品電泳前优床，需與上樣緩沖液（Loading Buffer）混合后煮沸處理仍翰，上樣緩沖液中含有強還原劑（DTT或2-Me）和蛋白變性劑SDS龟再，破壞了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)度气，將蛋白質(zhì)解聚成多肽鏈够吩，并將SDS包覆在肽鏈表面，SDS帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，使蛋白帶有一致的負電荷（約2個氨基酸一個SDS）和一致的形狀（棒狀），消除了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是與分子量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度主要取決于分子大小拦耐。
? 通過將未知分子量蛋白和多種已知分子量蛋白一起電泳歉铝，對比其遷移速度，推算出未知蛋白的分子量近似值凑耻。多種已知分子量蛋白稱為蛋白分子量標準太示，也叫蛋白Marker，市面上有成品銷售香浩，本實驗采用多色預染Marker类缤，也稱彩虹Marker。
三邻吭、儀器與試劑
1. 試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）餐弱、甘氨酸、電泳級SDS囱晴、丙烯酰胺膏蚓、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺）畸写、四甲基乙二胺（TEMED）驮瞧、甲醇、過硫酸銨（AP）艺糜、考馬斯亮藍R250剧董、冰乙酸、純化水破停、6X Loading Buffer翅楼、10 kDa-180 kDa蛋白Maker；
? ? 1×電泳緩沖液真慢、10% SDS毅臊、30%丙烯酰胺、1M Tris-HCl（pH=6.8）黑界、1.5M ?Tris-HCl（pH=8.8）管嬉、脫色液皂林、10% 過硫酸銨（AP）、考馬斯亮藍染色液蚯撩、目的蛋白樣本础倍。?
2.材料：燒杯、不銹鋼盆胎挎、EP管沟启、防爆夾、浮漂犹菇、加樣槍及槍尖德迹、量筒塘偎、吸量管彤钟、10mL離心管。
3.儀器：FA2004N型電子天平姥闪、DYY-8C型電泳儀称杨、DYY-BC型垂直電泳槽肌毅、制膠器、微波爐列另、電磁爐芽腾、純水機。
四页衙、實驗步驟
1．配液：根據(jù)用量摊滔，按照《附錄：SDS-PAGE法檢測分子量試劑配方》進行配制。
2．制膠
? ? 垂直電泳槽的玻璃板清洗干凈后，將凹型玻璃與平玻璃重疊眨八，將兩塊玻璃板放入電泳槽支架內(nèi)（短玻璃朝里）腺兴，并將電泳槽支架在桌面水平輕輕磕幾下，使玻璃板底部對齊廉侧，然后插入斜插板到適中程度页响，并將其固定在制膠器上，按照配方配制10%的分離膠10mL（2塊膠）段誊，和4mL 5%的濃縮膠（2塊膠）闰蚕，分離膠加入TEMED后立即混勻，迅速沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩滴入连舍，小心不要產(chǎn)生氣泡没陡，給濃縮膠留出約2 cm的空間。在丙烯酰胺溶液上緩慢覆蓋純化水進行壓實，防止空氣擴散到凝膠中抑制聚合作用盼玄，并保證凝膠表面水平贴彼。在室溫條件下，凝膠應在30min左右聚合完成埃儿，聚合后凝膠和上層液相之間可見折射率的變化器仗。
? ? 倒掉覆蓋層純化水，并用濾紙條吸凈殘留的水蝌箍，注意勿破壞凝膠表面青灼，濃縮膠中加入TEMED，混勻后迅速加在分離膠上妓盲，并立即插入干凈的加樣梳，注意不要混入氣泡专普。約30min濃縮膠聚合后悯衬，拆下制膠器，放入電泳槽內(nèi)檀夹，在兩片玻璃板中間加注1×電泳緩沖液后小心移去梳子筋粗，避免破壞加樣孔，加樣梳取出后炸渡，一定要觀察凝膠梳齒是否歪斜娜亿，如有歪斜，需要用注射器針頭或者接種針將其擺正蚌堵。最后再加入少量電泳緩沖液买决，使玻璃板內(nèi)緩沖液呈滿溢狀態(tài)，外周電泳液深度約2-3 cm左右即可吼畏。
3．制樣
? 將目的蛋白樣品（約1mg/mL）于-20℃冰箱中取出督赤，室溫融化后混合均勻，取出25μL置于一新1.5mL EP管內(nèi)泻蚊，加入5μL ?6X Loading Buffer躲舌，混合均勻，蓋上管蓋性雄，并在管蓋上標記好組別没卸，用防爆夾夾住管口，插入到浮漂孔內(nèi)秒旋，100℃煮沸5?- 15 min约计，本實驗采用的蛋白Marker為預處理樣本，不需要此煮樣操作滩褥。
4．加樣
? 電泳槽內(nèi)加電泳緩沖液沒過加樣孔病蛉，傾斜整個裝置以趕走凝膠下面可能留有的氣泡，按預定順序加樣，每孔加入20μL铺然，在蛋白Marker孔中加入5μL蛋白Marker俗孝。
5．電泳
? 加樣完畢，蓋好上蓋魄健，連接電泳儀赋铝，打開電泳儀開關(guān)后，設(shè)置恒壓80V（電壓調(diào)80V沽瘦，電流調(diào)最大）20min革骨，樣品中的溴酚藍指示劑壓縮成一條直線且到達分離膠后，調(diào)節(jié)恒壓120V 約1h 40min（或200V 30-40min）析恋，當溴酚藍指示劑遷移到凝膠前沿時關(guān)閉電源停止電泳良哲。從電泳裝置上卸下玻璃板，用卡片剝下凝膠后切除一角以標注凝膠方位（或?qū)?/span>Marker孔設(shè)置在前面）助隧。
6．染色
? 將凝膠沖洗后浸泡在染色液中筑凫，置于搖床上37℃染色2h或者室溫染色過夜（快速染色可用微波爐煮沸后靜置10min，2-3次重復）并村，染色液可回收重復利用巍实。
7．脫色
? 染色結(jié)束后，將凝膠漂洗后浸泡在脫色液中哩牍，置于搖床上脫色過夜棚潦，其間更換脫色液3次；或采用快速脫色膝昆，微波爐煮沸后靜置15min丸边，3-4次重復，每次均換新脫色液外潜。直至蛋白條帶清晰為止原环。
8．分子量
? 將顯示蛋白條帶的凝膠拍照，采用凝膠呈像系統(tǒng)軟件計算分子量和純度处窥，并粘貼實驗結(jié)果照片嘱吗。
五、注意事項
1．實驗中大部分試劑具有毒性滔驾，操作時應戴上手套谒麦，注意防護；
2. 制膠前玻璃板位置不要歪斜哆致，旋緊旋鈕時需要兩側(cè)同時用力绕德，防止漏膠；
3. 制膠時TEMED最后加入摊阀，加入后立即進行制膠耻蛇，防止凝固太快導致制膠失斪俚拧；
4. 制膠時待膠凝固后再進行下一步操作臣咖，凝固時間一般為30min跃捣，但室溫低時可能會延長；
5. 加樣梳取出后夺蛇，一定要觀察凝膠梳齒是否歪斜疚漆，如有歪斜，需要用注射器針頭或者接種針將其擺正刁赦；
6. 制樣時一定要用防爆夾夾牢EP管娶聘，防止煮沸過程中管蓋爆開導致樣品損失；
7. 樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20存放數(shù)月甚脉，但是反復凍融會使蛋白質(zhì)降解丸升；
8.上樣時，小心不要使樣品溢出而污染相鄰加樣孔牺氨，蛋白Marker孔不要設(shè)置在中間发钝，防止分不出凝膠正反面；
9.為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散波闹，上樣后應盡快進行電泳；
10.電泳時涛碑，電泳儀與電泳槽間正精堕、負極不能接錯，以免樣品反方向泳動蒲障。
六歹篓、思考題
? 制膠時加入TEMED作用是什么？為何最后加入揉阎？
附錄：SDS-PAGE法檢測分子量試劑配方
1.10% SDS：10g SDS庄撮，加純化水定容至100mL。
2.30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g毙籽，N洞斯，N’-亞甲基雙丙烯酰胺1g，加純化水定容至100mL坑赡。
3.1M Tris-HCl（pH=6.8）：將24.22g Tris用純化水溶解烙如，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=6.8，純化水定容200mL毅否。
4.1.5M Tris-HCl（pH=8.8）：90.85g Tris用純化水溶解亚铁，加濃鹽酸調(diào)pH=8.8，純化水定容至500mL螟加。
5.10% 過硫酸銨（AP）：2g過硫酸鈉徘溢，加純化水定容至20mL吞琐，1mL/支分裝，-20℃凍存然爆。
6.5×電泳緩沖液：15.1gTris堿站粟，94g甘氨酸，5g電泳級SDS施蜜，加純化水溶解后定容至1000mL卒蘸，用前5倍稀釋。
7.考馬斯亮藍染色液：考馬斯亮藍R250 ?0.5g翻默，加入甲醇 150mL缸沃，冰乙酸 50mL，研磨溶解修械，濾紙過濾后趾牧，加純化水定容至500mL。
脫色液：冰醋酸 100mL肯污，甲醇 300mL翘单，加純化水定容至1000mL。
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